Mycobacterium leprae, det agens af spedalskhed, ikke vokser in vitro. Vi beskriver en nem at følge protokollen til at forberede en bacillær suspension til at sikre opretholdelsen af store mængder M. leprae for en lang række applikationer. Protokoller til formering af mus footpad podning, evaluering af levedygtighed, nedfrysning og optøning bacillær bestand er beskrevet i detaljer.
Spedalskhed, forårsaget af Mycobacterium leprae, er en vigtig smitsom sygdom, der stadig er endemisk i mange lande rundt om i verden, herunder Brasilien. Der er i øjeblikket ingen kendte metoder til at dyrke M. leprae in vitro, der udgør en betydelig hindring i studiet af dette patogen i laboratoriet. Derfor er vedligeholdelse og vækst af M. leprae-stammer udføres fortrinsvis i athymiske nøgne mus (NU-Foxn1 nu). De laboratoriebetingelser for anvendelse af mus er let tilgængelige, let at udføre og tillader standardisering og udvikling af protokoller for at opnå reproducerbare resultater. I denne rapport beskriver vi en enkel protokol til oprensning af baciller fra nøgne mus footpads hjælp trypsin, hvilket giver en suspension med minimal celle debris og med høj bakteriel levedygtighed indeks, som bestemt ved fluorescerende mikroskopi. En ændring til standardmetoden for bacillær tælling ved Ziehl-Neelsenfarvning og lysmikroskopi er også vist. Derudover beskriver vi en protokol for nedfrysning og optøning bacillær lagre som en alternativ protokol til vedligeholdelse og opbevaring af M. leprae-stammer.
Spedalskhed, en sygdom forårsaget af Mycobacterium leprae, er et vigtigt offentligt sundhedsproblem i mange lande rundt om i verden 1,2. Trods bliver kendt som en smitsom sygdom, der påvirker både hud og perifere nerver er der stadig flere huller i viden om de involverede mekanismer i den komplekse immunopathogenesis af sygdommen.
Blandt de udfordrende karakteristika M. leprae der hindrer dens undersøgelse er dens manglende evne til at vokse i kunstig kultur medier og dens relativt lang fordobling tid (ca. 14 dage) 3,4. De fleste eksperimentelle procedurer, der anvender M. leprae er sat op med baciller oprenset fra hudlæsioner af spedalskhed patienter eller fra eksperimentelle dyremodeller, såsom bæltedyr og flere stammer af mus 5,6.
I mange år har forskere afhang oprensning af M. leprae fra hudlæsioner af multibacillary LeprOsy patienter til anvendelse i eksperimentelle procedurer. Adskillige laboratoriebetingelser for in vitro-dyrkning eller vedligeholdelse af levende M. leprae er blevet forsøgt, men til dato har dyremodeller vist sig at være mest egnet til forskningsformål. I 1960'erne og 1970'erne, forskere begyndte at bruge mus og bæltedyr til påvisning og vurdering af M. leprae levedygtighed, overvågning bakterievækst i respons på anti-M. leprae stoffer og i vækst og vedligeholdelse af mycobakterielle stammer 2,4.
De dyremodeller har nogle begrænsninger, især i bæltedyr og ikke-menneskelige primater, herunder etiske bekymringer, udgifter til vedligeholdelse, særlig nødvendige infrastruktur til vedligeholdelse dyr og dårlig reproducerbarhed af de resultater og de endelige udbytter. I øjeblikket mus er den foretrukne model dyr for spedalskhed forskning. De laboratoriebetingelser for anvendelse af mus er let tilgængelige, let at udføre og tillader standardiserede protokoller <sup> 7,8,9. Nøgne mus er blevet anvendt i opretholdelsen af M. leprae-stammer, for selv med lave levedygtige bacillary belastninger, respons på T-celle deficiente immunrespons fører til overstrømmende granuloma og god bacillary multiplikation. Således har denne dyremodel vundet bredt accepteret inden for spedalskhed forskningsverdenen.
I denne rapport beskriver vi en enkel protokol til enzymatisk rensning af baciller fra nøgne mus trædepuder, der er beregnet til fremstilling af en M. leprae suspension med minimal cellerester og med høj bakteriel levedygtighed indeks. Levedygtigheden bestemmes ved fluorescensmikroskopi, som hurtigt kan udføres i laboratoriet. Vi demonstrerer også en ændring til standardmetoden for bacillær optælling af kulde Ziehl-Neelsen farvning og lysmikroskopi. Derudover præsenterer vi et alternativ protokol til vedligeholdelse og opbevaring af M. leprae-stammer, så nedfrysning og optøning af bacillary stocks.
En detaljeret beskrivelse af en godt illustreret, succesfuld protokol til opformering af M. leprae er stærkt behov. Vores undersøgelse viser, at protokollen podestof fremstilling ved filtrering og trypsinfordøjelse tillader inokula, der skal opnås med meget lidt celleaffald og med høj levedygtighed baciller (score 0 +). Natriumhydroxid er blevet anvendt til at opdele vævet til oprensning af baciller 6. Undersøgelser udført i vores laboratorium under anvendelse af natriumhydroxid til oprensning af M. leprae resulterede i dannelse af klumper af baciller, hæmmer homogenisering af suspensionen for levedygtighed bestemmelse og dyrs podning (data ikke vist).
Potentielle problemer med præparatet inokulum ved filtrering og trypsinfordøjelse omfatter store mængde celleaffald og forurening af inokulum med bakterie-eller svampe-midler. I tilfælde af store mængder cellulært debrer observeres efter rensning, enten trypsin ikke længere er aktiv, eller der er en stor mængde af biologisk materiale. Enzymatiske aktivitet af trypsin stamopløsning skal vurderes. Hvis der er mistanke om overdreven mængde indledende biologisk materiale, skal materialet opdeles i portioner, og protokollen bør udføres i separate sæt. For at undgå forurening af inoculum med bakterie-eller svampe agenter, skal der drages omsorg for at behandle materialet under aseptiske forhold. Hvis der opdages svampe-og / eller bakteriel forurening suspensionen bør kasseres.
En begrænsning af vores protokol er subjektivitet levedygtighed evalueringen ved hjælp af den beskrevne semi-kvantitativ metode. Levedygtighed vurderet semikvantitativt er mere praktisk, selv om mindre præcis end den offentliggjorte kvantitative metode 6. Levedygtighed score på 0 + og 1 + er tilfredsstillende for vedligeholdelse af formering og nedfrysning afM. leprae. Lahiri et al. har allerede vist, at nøgne mus podet med 80-90% levedygtige inokulum resultere i trædepuder egnede til høst (høj levedygtighed baciller) ved 4-5 måneders inokulering. Derfor er tidlig infektion (omkring 4 måneder) er det bedste høsttidspunktet. Til høst af frossen inokulum blev musene i denne protokol opretholdes podet i længere perioder (7 måneder) og garanterer vækstkurver. Et kritisk trin for at sikre passende levedygtighed anvendelse af friske bacilli suspensioner, fortrinsvis inden for 24 timer efter indsamling af biologisk materiale fra værten og forarbejdning. Desuden kvaliteten af de reagenser, frisk tilberedte fortyndet trypsin og levedygtighed farvningsopløsninger, er nødvendige for at sikre reproducerbare resultater.
En anden begrænsning af denne protokol er, at den endelige M. leprae suspension er ikke fri for værts-DNA, RNA, protein osv. Derfor skal andre rensningstrin tilføjes to opnå en M. leprae suspension fri for værtscellekomponenter.
En metode til at opretholde levedygtige baciller ved frysning hele vævsprøver M. leprae læsioner er blevet rapporteret 9. Men undersøgelsen af Portaels et al. viste signifikant tab af levedygtighed, der spænder mellem 65-97% efter nedfrysning og optøning af M. leprae inficerede vævsprøver opnået fra bæltedyr 9. Vores protokol viste, at levedygtighed indekset observeret i M. leprae suspensioner efter nedfrysning og optøning faldt i forhold til den alikvot, der ikke havde været frosset (tabel 1). Faktisk frysning M. leprae suspension i indefrysning medier gav levedygtighed spænder fra 50-70%, med levedygtighed score 1 +, mens levedygtigheden score 0 + blev opnået i ufrossent suspension. Ikke desto mindre, formering af M. leprae var tilfredsstillende efter 7 måneder efter podning af nøgne mus ( <sTrong> Tabel 1). Podning af nøgne mus med rekonstitueret prøver holdes nedfrosset i 60 dage resulterede i middel 100 gange stigning i antallet af baciller forhold til det oprindelige inokulum. Det fremgår, at frysning M. leprae suspension i fryse medier, i stedet for inficerede vævsprøver, er mere effektiv. Et kritisk trin i vores protokol er langsom frysning af AFB i et fryserum beholder, som er nødvendig for at opretholde levedygtige baciller, som påvist ved Colston og Hilson 8. Vil blive gennemført fremtidige eksperimenter for at vurdere levedygtigheden af baciller efter længere frysning perioder.
Sammenfattende fordi M. leprae ikke vokser in vitro, vores protokol giver mulighed for en hurtig og nem alternativ til vedligeholdelse af levedygtige inokulum, og den vellykkede frysetrinnet muliggør opretholdelse af stammer uden løbende passage i dyr, således at etableringen af en bank af definerede stammer.
Dette afsnit indeholder instruktioner til forberedelse reagenser til at udføre denne protokol.
1.. Trypsin
Trypsin | 0,5 g |
Destilleret vand | op til 100 ml |
Filtersteriliser. Opbevar ved -20 ° C.
2. 7H9
7H9 bouillon basen | 4,7 g |
40% glycerol stock | 5 ml |
Destilleret vand | op til 900 ml |
Bland base med vand og derefter tilføje glycerol under omrøring. Autoklave ved 121 ° C i 20 minutter for at sterilisere. Opbevares ved 4 ° C.
3. Hjerne-hjerte-infusion (BHI)
BHI | 37 g |
Destilleret vand | op til 1.000 ml |
Autoklave ved 121 ° C i 15 minutter for at sterilisere. Opbevares ved 4 ° C.
4.. Phenol serum
4.1) 5% phenol
Phenol | 5 ml |
Destilleret vand | op til 100 ml |
4.2) Serum phenol
kalvefosterserum | 2 ml |
5% phenol | 98 ml |
Opbevares ved 4 ° C.
5.. Løsninger til kold Ziehl-Neelsen Stain
5.1) CarboFuchsin
Fuchsin | 1 g |
Phenol krystaller fusioneret til 60 ° C | 5 ml |
Ren ethylalkohol | 10 ml |
Destilleret vand | op til 100 ml |
Filter før hver brug.
5.2) methylenblåt Base
Methylenblåt | 3 g |
95% ethylalkohol | op til 200 ml |
5.3) Alkohol syre
70% alkohol | 990 ml |
chloridric syre | 10 ml |
6.. Medium til frysning:
OADC | 10 ml |
Glycerol | 20 ml |
7H9 medium | op til 100 ml |
Autoklave glycerol før brug og sterilisere OADC ved filtrering.
7.. Autoklaveret M. leprae suspension
Autoklave ved 121 ° C i 20 min. Opbevar ved -20 ° C.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro og Claudia PM Carvalho til teknisk bistand. Vi takker Pranab K. Das for at støtte etableringen af dyret facilitet. Vi takker Lais RR Costa for revision af manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Fundação Paulista contra Hanseníase og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo1°C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova INC | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer – 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |