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Immunology and Infection

에 최적화 된 프로토콜 doi: 10.3791/50620 Published: March 23, 2014

Summary

은 Mycobacterium leprae, 나병의 원인 물질은 체외에서 성장하지 않습니다. 우리는 M. 많은 양의 유지를 보장하기 위해 세균성 현탁액을 준비하는 프로토콜을 따라하기 쉽게 설명 응용 프로그램의 다양한 leprae. 마우스 노상 접종, 생존 능력의 평가, 냉동과 해동 세균성 주식으로 전파 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

Abstract

은 Mycobacterium leprae에 의한 나병, 브라질 등 세계 많은 나라에서 여전히 발병에 중요한 전염성 질병입니다. M. 성장에 대한 공지의 방법은 현재 없습니다 leprae 생체 실험실에서이 병원체의 연구의 주요 장애물을 제시. 따라서, M.의 유지 및 성장 leprae 변종은 바람직 흉선 누드 마우스 (NU-Foxn1 뉴)에서 수행됩니다. 마우스를 사용한 실험 조건은 용이하게 수행 가능한 쉽고, 재현성있는 결과를 달성하기위한 표준화 및 프로토콜의 개발을 허용한다. 형광 현미경 검사에 의해 결정되는 본 보고서에서, 우리는 최소의 세포 파편과 높은 박테리아 생존 지수 현탁액을 산출 트립신을 사용하여 누드 마우스 발바닥으로부터 간균 정화용 간단한 프로토콜을 설명한다. Ziehl-Neelsen에 의한 세균성 계산을위한 표준 방법에 대한 수정염색하고 광학 현미경도 보여줍니다. 또한, 우리는 M.의 유지 관리 및 저장을위한 대체 프로토콜로 동결 융해 세균성 주식에 대한 프로토콜을 설명 leprae 변종.

Introduction

나병은 Mycobacterium의 leprae에 의한 질병은 세계 1,2 여러 나라에서 중요한 공중 보건 문제입니다. 피부와 말초 신경 모두에 영향을 미치는 전염성 질병으로 알려져에도 불구하고, 질병의 복잡한 면역 학적 발생에 관여하는 메커니즘에 대한 지식의 여러 격차는 여전히있다.

M.의 도전 특성 중 의 연구를 방해 leprae 인공 배양 배지와 상대적으로 긴 배가 시간 (약 14 일) 3,4에서 성장의 무능력이다. M.를 사용하는 대부분의 실험 절차 leprae는 나병 환자의 피부 병변에서 또는 아르마딜로와 마우스 5,6의 몇 가지 계통 등의 실험 동물 모델에서 정제 된 균으로 설정되어 있습니다.

몇 년 동안, 연구진은 M.의 정화에 의존 한 leprae multibacillary lepr의 피부 병변에서실험 절차에 사용 OSY 환자. 라이브 M.의 체외 배양 및 유지 보수 등 여러 실험실 조건 leprae이 시도되었지만, 현재까지 동물 모델 연구 목적에 가장 적합한 것으로 판명되었다. 1960 년대와 1970 년대에, 연구진은 M.의 탐지 및 평가를위한 마우스와 아르마딜로를 사용하기 시작했다 안티 M.에 대한 응답으로 박테리아의 성장을 모니터링 leprae의 생존, leprae 약물 및 마이코 박테리아 균주 2,4의 성장과 유지 보수.

동물 모델은 윤리적 인 문제, 유지 보수 비용, 동물 유지 보수에 필요한 특수 인프라 및 결과의 재현성을 나쁘게 최종 수율을 포함하여, 특히 아르마딜로와 인간이 아닌 영장류에 일부 제한이 있습니다. 현재 마우스는 나병 연구에 대한 선호 모델 동물이다. 마우스를 사용하는 실험실 조건은하기 쉬운, 쉽게 사용할 수 있으며, 표준화 된 프로토콜이 허용 M.의 유지에 사용되어왔다 심지어 낮은 가능한 세균성로드의 T-세포 결핍 면역 반응이 무성한 육아종 형성과 좋은 세균성 곱셈에 이르게하기 때문에 leprae는 변종. 따라서,이 동물 모델은 나병 연구 커뮤니티 내에서 폭 넓은 수용을 얻고있다.

본 보고서에서, 우리는 누드 마우스 풋 패드에서 균의 효소 정제를위한 간단한 프로토콜을 설명, M.의 준비를위한 것 최소한의 세포 파편과 높은 세균 생존 지수 leprae 서스펜션. 생존율이 급격히 실험실에서 수행 될 수 형광 현미경에 의해 결정된다. 우리는 또한 감기 Ziehl-Neelsen 염색하고 광학 현미경에 의한 세균성 계산을위한 표준 방법에 변형을 보여줍니다. 또한, 우리는 M.의 유지 관리 및 저장을 위해 다른 프로토콜을 제시한다 leprae 변종, 수 냉동 세균성 세인트의 해동ocks.

Protocol

1. 은 Mycobacterium leprae 서스펜션의 제조

  1. 흉선 누드 마우스 (NU-Foxn1 뉴)를 안락사 전에, 트립신 솔루션과 문화 매체 준비 (시약의 프로토콜 - 프로토콜 1, 2, 3). 누드 마우스에게 M. 4-5 개월 후 접종을 안락사 leprae 동물의 안락사에 대한 AVMA 가이드 라인에 따라 2013 년 판 10 (동물의 이미지의 실험과 사용이 승인 Faculdade 드 Odontologia 드 바우 루, USP의 동물 관리위원회의 지침에 따라 실시되었다). 70 % 에탄올 알코올 전체 마우스를 청소, 동물을 처리하는 데 사용되는 생물 안전 캐비닛 내부.
  2. 족부 관절 원위부 지혈 겸자를 사용하여 후방 발을 잡습니다. 집게 아래 가위로 발을 차단하고 20 분 동안 2 % 요오드에 발을 담그지. 그리고, 다른 후방 발위한 절차를 반복한다.
  3. 에 발을 전송추가 작업에 대한 깨끗한 생물 안전 캐비닛. , 2 % 요오드 밖으로 발을 멸균 거즈로 건조하고 뼈 주변의 모든 연부 조직 (진피, 표피, 힘줄, 신경)를 제거, 22 번 또는 23 메스 블레이드를 사용하여 두 발바닥를 수집합니다. 중족골 뼈와 제 1, 5 지골를 제거합니다. 멸균 페트리 접시에 재료를 놓고 메스 블레이드로 긁어하여 표피를 제거합니다. 가위로 작은 조각으로 조직을 잘라 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다. 무게 조직 및 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 ㎖를 추가합니다. 샘플의 온난화 방지하기 위해 얼음에 튜브를 유지합니다.
  4. HBSS의 또 다른 1 ML을 추가하고 조직의 균질화를 사용하여 샘​​플을 균질화.
    1. 먼저 균질화주기 : 속도 4 (14,450 RPM)에서 15 초 3 펄스.
    2. 남아있는 이물질을 제거하기 위해 셀 스트레이너를 통과, 멸균 50 ML 원뿔 관에 뜨는을 전송합니다. 이 솔루션은 GRA으로 전달할 수 있도록VITY.
    3. HBSS의 추가 2 ㎖를 추가하고 균질화 사이클 (1.4.1)를 반복하고, 다시 셀 스트레이너를 통해 샘플을 전달합니다.
    4. 9 ML에 볼륨을 가져 HBSS를 추가하여 여과기를 씻어. 셀 스트레이너를 폐기하십시오.
  5. 0.5 % 트립신 솔루션의 나누어지는 해동. 최종 농도 0.05 %의 트립신을 얻기 위해 세포 현탁액의 10 ml로 트립신 1 ML을 추가합니다. 남은 해동 트립신을 폐기하십시오. 37 ° C의 물을 욕조에 60 분 동안 품어. 배양 후, 트립신을 희석 멸균 식염수를 첨가하여 40 ㎖에 볼륨을 가져옵니다.
  6. 4 ℃에서 30 분 동안 1,700 XG에 원심 분리기
  7. 조심스럽게 튜브를 반전하여 상층 액을 버린다. 튜브를 눌러 펠렛을 재현 탁하고 멸균 생리 식염수 1 ㎖를 추가합니다. 서스펜션 (조직의 수율 / 그램을 계산하는)의 최종 부피를 측정하는 새로운 원뿔 튜브에 현탁액을 전송합니다.
  8. 1m를 사용하여 바실러스 현탁액을 균질화26 G 바늘 L 인슐린 주사기 새로운 튜브에 현탁액을 전송하는 동안.
  9. 각 매체에 2 방울 (50 UL)를 배치하여 서스펜션의 미생물 제어를 수행 7H9 및 뭐냐 - 젠슨 매체와 마이코 박테리아 오염의 검출을 위해, 30 일 동안 37 ° C에서 알을 품다. 마찬가지로, 뇌 심장 주입 (BHI) 배지에 접종 및 호기성 세균 오염의 검출을 위해, 37 ° C에서 24 시간 동안 배양한다.
  10. 염색을 위해 튜브에 정지 나누어지는 : 찬 Ziehl-Neelsen 염색 (프로토콜 2) 35 μL,과 생존 결정 (프로토콜 3) 200 μl를.
  11. Ziehl-Neelsen 염색법 (ZN) 후에 산성 빠른 간균 / ㎖ (AFB / ㎖)의 수를 계산한다. 누드 마우스 접종의 경우, 1 × 10 8 AFB / ㎖의 현탁액을 준비하고, 30 μL / 발바닥 / 동물 (프로토콜 5)을 접종하기에 충분한 볼륨이 있는지 확인하고, 접종 할 때까지 정지 추위를 유지합니다. 냉동의 경우, 1 × 10 7 AFB / ㎖ 지속을 준비연금 (프로토콜 4).

2. 콜드 Ziehl-Neelsen 염색

  1. 염색을 시작하기 전에 혈청 / 페놀 용액과 ZN 염색 용액 준비 (시약의 프로토콜 - 프로토콜 4, 5). 면역 조직 화학의 펜을 사용하여 3 개의 유리 슬라이드에 세 개의 원 (내경 10mm)를 그립니다. (1) 일반 또는 희석, (2) 1:10 (3) 1:100는 숫자 2 연필 (주 : 일부 흑연 ZN 염색 후 해제 페이드)를 사용하여 : 슬라이드를 확인합니다.
  2. 1:10 1:100 시리얼 희석에 세균성 서스펜션 (1.10 단계) 희석, 희석 현탁액을 5 ㎕의 생리 식염수 45 μl를 추가, 다음 1:10 5 μL를 가지고 생리 식염수 45 μl를 추가합니다.
  3. 혈청 / 페놀 용액 5 μL, 원 기준, 세균성 현탁액의 10 μl를 추가합니다. 균질화 및 처분 할 수있는 루프의 손잡이 원의 주변에 균일하게 확산. 서스펜션은 수평 테이블에 건조 기다립니다.
  4. D 후휴대용가, 분젠 버너 (약 20 초 총) (11)의 푸른 불꽃에 슬라이드 3 번 전달하여 얼룩을 고정합니다.
  5. 염색의 경우, 20 분 동안 여과 Ziehl-Neelsen의 carbofuchsine (약 5 mL)로 슬라이드의 전체 표면을 커버.
  6. 물 (느린 속도)를 실행에 슬라이드를 씻어.
  7. 약 20 초 동안 10 % 아세트산 알코올 용액으로 슬라이드 커버.
  8. 흐르는 물에 다시 슬라이드를 씻으십시오.
  9. 5 분 메틸렌 블루 용액으로 슬라이드를 커버.
  10. 흐르는 물에 슬라이드를 씻어 실온에서 말리면.
  11. 100X 오일 침지 목표를 사용하여 20 필드 / 원 (총 60 필드 / 슬라이드)를 계산합니다. 다음과 같이 산 빠른 균 / ㎖ (AFB / ㎖)의 계산은 나병 (12)에 대한 실험실 기술에 대한 설명에 따라 수행된다 :
    AFB / 필드 = 60로 나눈 3 원 (60 필드)에있는 균의 총 수.
    AFB / ㎖ = AFB / x 필드 상수 원의 (지역X 100)는 대물 렌즈의 개구 면적으로 나눈 값, 및 희석 현탁액을 계산하는 경우, 희석 계수 (10 또는 100)에 의해 AFB / ㎖의 수를 곱한다.

3. 생존 결정

  1. 시작하기 전에 멸균 M.에게 준비 leprae 서스펜션 (시약의 프로토콜 - 프로토콜 7). M.의 질적 결정을위한 적절한 키트 (시약 및 장비의 표 참조)을 사용하여 서스펜션의 leprae 생존. 다음과 같이 (모든 절차가 희미한 빛에 따라 수행되어야한다) 솔루션을 희석 : 생리 식염수에 10 배 (1 ㎕의 주식 플러스 9 μL 식염수)로 솔루션을 희석 식염수의 요인에 의해 용액 B (20)을 희석 (1 μL 주식 플러스 19 μL 식염수).
  2. 테스트 할 수있는 세균성 서스펜션 (단계 1.10)의 200 μL로 희석 용액 3.6 ㎕의 희석 용액 B의 6 μl를 추가합니다. 이전 멸균 M. leprae 서스펜션은 일상적으로 사용됩니다생존 염색에 대한 제어를 egative.
  3. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 현탁액을 배양한다.
  4. 4 ℃에서 5 분 동안 10,600 XG에서 튜브를 원심 분리기
  5. 뜨는을 취소하고 10 % 글리세롤의 15 μL에 펠렛을 재현 탁. 깨끗한 유리 슬라이드의 표면에 8 μl를 적용하고 작은 커버 슬립으로 커버. (분자 프로브 추천 참조) 적절한 필터를 포함하는, 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석한다. 아이오다 이드 (PI) 염색을 프로피 디움하는 염색 SYTO 9 (SY)를 비교하여 그 결과를 평가합니다.
    참고 : 싸이 얼룩은 모두 죽은 살아있는 박테리아의 100 %를 관통하고, PI의 얼룩은 손상된 세포막으로 만 박테리아를 침투. 멸균 현탁액 (음성 대조군) 세포 파편의 존재로 인해 세균 덩어리를 형성 할 수있다. 라이브 / 죽은 평가에 사용 된 반 정량적 척도는 0에서 2 +로 변화, 0은 세포의 30 % 미만은 PI의 얼룩에 대한 긍정적 인 것을 나타내고, 1 + (30) 사이의 의미 -세포의 50 %는 PI의 얼룩에 대한 긍정적 인 2 +는 세포의 50 % 이상이 PI의 얼룩에 대한 긍정적 인 의미합니다. 0의 점수를 사용하기에 가장 적절한 것으로 간주됩니다.

4. 냉동 / 해동 M. leprae 서스펜션

  1. 시작하기 전에, 냉동 매체 (- 프로토콜 6 시약의 프로토콜)를 준비하고 있습니다. 냉동의 경우, 아래에 설명 된 단계를 사용 :
    1. 포함하는 현탁액 150 μl를 추가 1 × 10 7 매체를 동결 1 ㎖와 함께 멸균 cryovial에 ML AFB /.
    2. 냉동 컨테이너에 cryovial을 놓고 24 시간 동안 -80 ° C에서 컨테이너를 저장합니다.
    3. 저장 상자에 고정 된 유리 병을 전송하고 -80 ℃에서 보관
  2. 해동을 위해, 아래에 설명 된 단계를 사용
    1. -80 ° C에서 냉동 서스펜션 cryovial을 제거하고 서스펜션을 해동 시작하는 37 ° C의 물을 욕조에 넣습니다.
    2. 멸균 20 ㎖을 함유하는 관으로​​ 현탁액을 부어식염수. 해동이 완료 될 때까지 조심스럽게 현탁액을 섞는다.
    3. 4 ° C에서 1,700 XG에 30 분 동안 현탁액을 원심 분리기
    4. 뜨는을 취소하고 원하는 볼륨에 도달하기에 충분한 멸균 식염수를 추가합니다. 주사기 (단계 1.8)를 통과하여 현탁액을 균질화.
    5. ZN 염색, 생존 의지와 예방 접종의 경우, 프로토콜, 2, 3, 5를 따릅니다.

5. 마우스 접종

  1. 두 사람이 절​​차에 필요한, ​​사람은 접종을 관리하는 마우스와 서로를 억제한다. 접종되는 동물 윤리 지침과 규정에 따라 처리해야하며, 모든 절차는 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아야한다. 발을 위로와 목의 목덜미에 의해 누드 마우스를 억제합니다.
  2. 26 G 바늘을 통해 전달하여 현탁액을 균질화. 접종에 1 ML의 주사기와 함께, 대기음 충분히 세균성 정지테 두 발바닥 (30 μL / 발바닥).
  3. 뒤쪽 발을 잡고 주입 전에 70 %의 에탄올 알코올 발바닥을 청소하고 바늘의 베벨과 바늘 피내을 소개 근위부에서 발바닥의 원심 측에 지적했다. 현탁액의 30 μl를 주입한다. 발바닥 주사는 마취 된 마우스에서 수행 될 수있다.
  4. 접종의 역류를 방지하기 위해 피부에서 바늘을 철수하기 전에 5 초를 기다립니다. 마우스는 부드러운 침구 포스트 접종에 보관되어야하고, 보행 및 자해의 징후를 모니터링해야한다.

Representative Results

프로토콜의 성공은 세 가지 방법으로 평가 될 수있다. 먼저, 종균의 품질 평가는, 세포 파편의 양과 최종 현탁액 가능한 간균 얻어진 백분율 (프로토콜 3 참조)에 의해 결정된다. 그림 1과 2에 나타낸 바와 같이, 최종 세균성 서스펜션은 아주 작은 세포 파편 높은 가능성을 (+ 0 점수)에 포함 된 대부분의 균은 SYTO 9 녹색 형광 얼룩 (얼룩 죽은 살아있는 박테리아를 모두 100 %를 관통 염색 있습니다, 그림 1)과 빨간색 PI 형광 얼룩 (얼룩 손상된 세포막, 그림 2) 만 박테리아를 침투 염색 단지 몇 균.

그림 1
그림 1. SYTO 9 염색 M. leprae 서스펜션. 녹색 형광이 살아 있고 죽은 M.의 존재를 보여줍니다 leprae. 400X.

그림 2
그림 2. M.의 PI 염색 죽은 M.의 작은 수를 나타내는 leprae 서스펜션. 적색 형광 leprae. 400X.

비디오 (프로토콜 1)에서와 같이 두 번째로 높은 가능성을 가진 접종은 분명 육안 병변의 발전과 함께 4 ~ 5 개월 후 접종 후 동물의 발바닥에있는 균의 증식에 영향을줍니다. 프로토콜의 성공을 평가하는 세 번째 방법 (프로토콜 4 참조) 다른 기간 동안 얼 되었었다 균을 접종 마우스 발바닥에 AFB의 생존과 증식을 평가하는 것이다.

"cellspacing ="0 "> 실험 (동물) 0 일에서 AFB / ㎖ 냉동 수 생존 능력 점수 / 일 0 기간을 동결 (일) 냉동 후 접종 AFB 수 냉동 후 생존 능력 점수 7개월 후 회복 AFB / ㎖의 수 1 (1) 1.0 × 10 7 0 + (60) 1.7 × 10 5 1 + 2.3 × 10 8 1 (2) 1.0 × 10 7 0 + (60) 1.7 × 10 5 1 + 3.8 × 10 7 1 (3) 1.0 × 10 7 0 + (60) 1.7 × 10 5 1 + 8.5 × 10 7 1 (4) 1.0 × 10 7 0 + (60) 1.7 × 10 5 <TD> 1 + 4.6 × 10 7 2 (1) 1.0 × 10 7 0 + 15 4.2 × 10 5 1 + 1.7 × 10 7 2 (2) 1.0 × 10 7 0 + 15 4.2 × 10 5 1 + 4.8 × 10 6 2 (3) 1.0 × 10 7 0 + 15 4.2 × 10 5 1 + 8.6 × 10 6 3 (1) 1.0 × 10 7 0 + 15 1.7 × 10 5 1 + 1.2 × 10 7 3 (2) 1.0 × 10 7 0 + 15 1.7 × 10 5 1 + 1.8 × 10 7 3 (3) 1.0 × 10 7 15 1.7 × 10 5 1 + 1.8 × 10 7 3 (4) 1.0 × 10 7 0 + 15 1.7 × 10 5 1 + 2.6 × 10 7 3 (5) 1.0 × 10 7 0 + 15 1.7 × 10 5 1 + 3.7 × 10 6

표 1. M. 결과 포스트 냉동 현탁액을 사용하여 leprae 곱셈.

표 1은 M.의 결과를 보여줍니다 냉동 후 현탁액을 사용하여 leprae 성장. 해동 후 현탁액의 생존 능력 점수는 1 +이었다. 냉동 프로토콜은 상이한 냉동주기를 테스트하기 위해 세 개의 독립적 인 실험을 수행 하였다. 15 또는 60 일 동안 냉동 접종원으로 두 실험에서 결과는 비슷한, P이었다냉동 후 ropagation는 10-1,000 번 접종 (표 1) 7 개월 만에 각각의 노상에서 발견 AFB의 수가 증가 얻었다. 따라서, M.의 동결 OADC (올레산 - 알부민 - 덱스 트로 오스 - 카탈) 보충 7H9 배지에서 leprae 현탁액은 생존의 유지 보수 결과.

세 접종원은 M.을 평가하는 데 사용 하였다 leprae는 두 개의 서로 다른 동결 기간 (15 60 일) 후 곱셈. 7개월 후, 균이 접종 된 생쥐의 발바닥에서 회복하고, Ziehl-Neelsen 염색 후 측정. 반 정량적 생존 스케일 : 0은 PI 염색 된 세포의 30 %까지 결석, 1 +는 PI 염색 된 세포의 30 % ~ 50 % 사이의 의미, 2 +는 PI 염색 된 세포의 50 % 이상을 의미합니다. AFB : 산 빠른 균.

Discussion

M.의 전파 잘 설명, 성공 프로토콜에 대한 자세한 설명 leprae가 매우 필요합니다. 우리의 연구는 여과 및 트립신 소화에 의해 접종 준비의 프로토콜이 접종이 (+ 0 점수) 아주 작은 세포 파편과 간균의 높은 생존 능력을 얻을 수 있습니다 것을 보여줍니다. 수산화 나트륨 간균 6 정화용 조직을 해리하는 데 사용되었다. M. 정화용 수산화 나트륨을 사용하여 실험실에서 수행 연구 leprae는 생존의 의지와 동물 접종 (데이터가 표시되지 않음)에 대한 서스펜션의 균질화를 방해, 균 덩어리의 형성 결과.

여과 및 트립신의 소화에 의해 접종 준비에 발생하는 잠재적 인 문제는 세균 또는 진균과 접종의 세포 파편과 오염 물질의 많은 양이 (가) 있습니다. 경우 휴대 debr 많은 양의정화 후 관찰, 하나 트립신는 더 이상 또는 생물학적 물질의 과도한 양이되어 있습니다. 트립신 원액 효소 활성을 평가해야합니다. 초기 생체 물질의 과량이 의심되는 경우, 물질은 분취 량으로 분할되어야하며 프로토콜은 별도 배치로 수행되어야한다. 세균 또는 진균과 접종의 오염을 방지하기 위해 치료는 무균 조건 하에서 물질을 처리하기 위해주의해야합니다. 곰팡이 및 / 또는 세균 오염이 감지 된 경우 정지는 폐기해야합니다.

우리 프로토콜의 제한은 기재된 반 정량 방법을 사용하여 생존력 평가의 주관성이다. 게시 된 양적 방법 6보다 정확한 비록 반 정량적으로 평가 가능성이 더 실용적입니다. 0 +, 1 +의 생존 능력 점수는 전파 및 동결의 유지 보수에 대한 만족M. leprae. 라히리 등. 이미 80-90% 가능한 접종을 접종 누드 마우스는, 접종 4 ~ 5 개월 (높은 생존 균)을 수확에 적합한 보호구가 발생하는 것으로 나타났습니다. 따라서, (4 개월 정도) 초기 감염은 최고의 수확 시간입니다. 냉동 접종의 수확, 본 프로토콜의 마우스는 성장 곡선을 보장하는 긴 기간 (7 개월)에 접종 유지되었다. 충분한 가능성을 보장하는 중요한 단계는 바람직하게는 호스트 및 처리에서 생체 물질의 수집 후 24 시간 이내에, 신선한 균 현탁액의 사용이다. 또한, 시약의 품질, 갓 준비한 희석 트립신과 생존 염색법 솔루션은 재현 가능한 결과를 보장하기 위하여 필요하다.

이 프로토콜의 또 다른 한계는 그 최종 M. leprae 서스펜션 호스트 DNA, RNA, 단백질 등의 무료로하지 않습니다. 따라서 다른 정제 단계는 t을 추가해야합니다오 M.에게 취득 leprae 현탁액 숙주 세포 성분의 자유로운.

M.의 전체 조직 표본을 동결 생존 균을 유지하기위한 방법 leprae의 병변은 9보고 된 바있다. 그러나 Portaels 등의 연구. 동결 M.의 해동 후 65~97% 사이에 이르기까지 생존 보여 상당한 손실, leprae 아르마딜로 9에서 얻은 조직 표본을 감염. 우리의 프로토콜은 것을 보여 주었다 M.에서 관찰 된 생존 능력 지수 (표 1) 냉동되지 않은 분취 량에 비해 동결 융해 후 leprae 현탁액은 떨어졌다. 실제로, M. 동결 냉동 미디어 leprae 서스펜션까지 생존 능력을 산출 생존 점수 1 +와 50 ~ 70 %, 생존 능력 점수 0 +가 고정되지 않은 정지를 얻었다하면서부터. 그럼에도 불구하고, M.의 곱셈 leprae은 (누드 마우스 7 개월 후 접종 후 만족했다 M. 동결 대신에 감염된 조직 표본의 동결 미디어 leprae 서스펜션은 더 효율적입니다. 우리의 프로토콜의 중요한 단계 Colston 및 Hilson (8)에 의해 설명되는 것과 같이 균이 생존 유지에 필요한 냉동 컨테이너에 AFB의 느린 냉동입니다. 향후 실험은 더 이상 동결 기간 후 균의 생존 능력을 평가하기 위해 실시됩니다.

요약하면, 때문에 M. leprae는 체외에서 성장하지 않습니다, 우리의 프로토콜은 가능한 접종의 유지 보수를위한 빠르고 쉬운 대안을 허용하고 성공적으로 동결 단계는 이렇게 정의 된 균주 은행의 설립을 가능하게 동물의 연속 통과하지 않고 긴장의 유지 보수를 가능하게한다.

이 절에서는이 프로토콜을 수행하기 위해 시약을 제조하기위한 지침이 포함되어 있습니다.

1. 트립신

트립신 0.5 g
증류수 최대 100 ML

소독 필터. -20 ° C.에 저장

2. 7H9

7H9 국물베이스 4.7 g
40 % 글리세롤 5 ㎖
증류수 최대 900 ML

교반하는 동안 물에 기반을 혼합 한 후 글리세롤을 추가합니다. 살균하는 20 분 동안 121 ° C에서 압력솥. 4 ℃에서 보관

3. 뇌 심장 주입 (BHI)

BHI 37g
증류수 최대 1,000 ml의

살균하는 15 분 동안 121 ° C에서 압력솥. 4 ℃에서 보관

4. 페놀 혈청

4.1) 5 % 페놀

페놀 5 ㎖
증류수 최대 100 ML

4.2) 혈청 페놀

소 태아 혈청 2 ㎖
5 % 페놀 98 ML

4 ℃에서 보관

5. 차가운 Ziehl-Neelsen 얼룩위한 솔루션

5.1) CarboFuchsin

푹신 1g
페놀 결정은 60 ° C에 융합 5 ㎖
순수 에틸 알코올 10 ㎖
증류수 최대 100 ML

각 사용하기 전에 필터.

5.2) 메틸렌 블루 자료

메틸렌 블루 3g
95 % 에틸 알코올 최대 200 ML

5.3) 알코올 산

70 % 알코올 990 ㎖의
chloridric 산 10 ㎖

6. 냉동 매체 :

OADC 10 ㎖
글리세린 20 ㎖
7H9 매체 최대 100 ML

사용하기 전에 글리세롤을 압력솥과 여과 OADC 소독.

7. 멸균 M. leprae 정지

20 분 동안 121 ° C에서 압력솥. -20 ° C.에 저장

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 기술 지원을 비트 리즈 GC 사르 토리, Lázara M. Trino, 아나 엘리사 Fusaro와 클라우디아 오후 카르발류 감사합니다. 우리는 동물 시설의 설립을 지원하기 위해 프라 납 K. 다스 감사합니다. 우리는 원고를 수정에 Lais RR 코스타 감사합니다. 이 연구는 Fundação 파울리스타 콘트라 Hanseníase 및 Pesquisa à Fundação 데 앰 파로에서 교부금에 의해 지원되었다 에스​​ 타도 데 상파울루 (FAPESP을 2009/06122-5) 할.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BacLight Bacterial Viability Kit Invitrogen; Molecular Probes L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9269
Cryo 1 °C Freezing Container Nalgene 5100001
Lowenstein-Jensen medium LB Laborclin 901122
Saline TEK Nova Inc S5812
Pen Dako S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base TPP 91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon BD Falcon 352340
Trypsin Sigma T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base Sigma-Aldrich M0178 Fluka
Glycerol Gibco BRL 15514011
Brain heart infusion (BHI) Oxoid LTDA CM1135
Fuchsin Merck Millipore 1159370025
Phenol  Invitrogen 15509037
Ethyl alcohol Merck Millipore EX02764
Cloridric acid Merck 1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) Becton Dickinson 211886
Fetal bovine serum Gibco; LifeTechnologies 26140079

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References

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에 최적화 된 프로토콜<em&gt;은 Mycobacterium leprae</em&gt; 스트레인 관리 : 무 흉선 누드 마우스에서 냉동 보관 보존 ​​및 유지 관리
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Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).More

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).

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