은 Mycobacterium leprae, 나병의 원인 물질은 체외에서 성장하지 않습니다. 우리는 M. 많은 양의 유지를 보장하기 위해 세균성 현탁액을 준비하는 프로토콜을 따라하기 쉽게 설명 응용 프로그램의 다양한 leprae. 마우스 노상 접종, 생존 능력의 평가, 냉동과 해동 세균성 주식으로 전파 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.
은 Mycobacterium leprae에 의한 나병, 브라질 등 세계 많은 나라에서 여전히 발병에 중요한 전염성 질병입니다. M. 성장에 대한 공지의 방법은 현재 없습니다 leprae 생체 실험실에서이 병원체의 연구의 주요 장애물을 제시. 따라서, M.의 유지 및 성장 leprae 변종은 바람직 흉선 누드 마우스 (NU-Foxn1 뉴)에서 수행됩니다. 마우스를 사용한 실험 조건은 용이하게 수행 가능한 쉽고, 재현성있는 결과를 달성하기위한 표준화 및 프로토콜의 개발을 허용한다. 형광 현미경 검사에 의해 결정되는 본 보고서에서, 우리는 최소의 세포 파편과 높은 박테리아 생존 지수 현탁액을 산출 트립신을 사용하여 누드 마우스 발바닥으로부터 간균 정화용 간단한 프로토콜을 설명한다. Ziehl-Neelsen에 의한 세균성 계산을위한 표준 방법에 대한 수정염색하고 광학 현미경도 보여줍니다. 또한, 우리는 M.의 유지 관리 및 저장을위한 대체 프로토콜로 동결 융해 세균성 주식에 대한 프로토콜을 설명 leprae 변종.
나병은 Mycobacterium의 leprae에 의한 질병은 세계 1,2 여러 나라에서 중요한 공중 보건 문제입니다. 피부와 말초 신경 모두에 영향을 미치는 전염성 질병으로 알려져에도 불구하고, 질병의 복잡한 면역 학적 발생에 관여하는 메커니즘에 대한 지식의 여러 격차는 여전히있다.
M.의 도전 특성 중 의 연구를 방해 leprae 인공 배양 배지와 상대적으로 긴 배가 시간 (약 14 일) 3,4에서 성장의 무능력이다. M.를 사용하는 대부분의 실험 절차 leprae는 나병 환자의 피부 병변에서 또는 아르마딜로와 마우스 5,6의 몇 가지 계통 등의 실험 동물 모델에서 정제 된 균으로 설정되어 있습니다.
몇 년 동안, 연구진은 M.의 정화에 의존 한 leprae multibacillary lepr의 피부 병변에서실험 절차에 사용 OSY 환자. 라이브 M.의 체외 배양 및 유지 보수 등 여러 실험실 조건 leprae이 시도되었지만, 현재까지 동물 모델 연구 목적에 가장 적합한 것으로 판명되었다. 1960 년대와 1970 년대에, 연구진은 M.의 탐지 및 평가를위한 마우스와 아르마딜로를 사용하기 시작했다 안티 M.에 대한 응답으로 박테리아의 성장을 모니터링 leprae의 생존, leprae 약물 및 마이코 박테리아 균주 2,4의 성장과 유지 보수.
동물 모델은 윤리적 인 문제, 유지 보수 비용, 동물 유지 보수에 필요한 특수 인프라 및 결과의 재현성을 나쁘게 최종 수율을 포함하여, 특히 아르마딜로와 인간이 아닌 영장류에 일부 제한이 있습니다. 현재 마우스는 나병 연구에 대한 선호 모델 동물이다. 마우스를 사용하는 실험실 조건은하기 쉬운, 쉽게 사용할 수 있으며, 표준화 된 프로토콜이 허용 <sup> 7,8,9. 누드 마우스는 M.의 유지에 사용되어왔다 심지어 낮은 가능한 세균성로드의 T-세포 결핍 면역 반응이 무성한 육아종 형성과 좋은 세균성 곱셈에 이르게하기 때문에 leprae는 변종. 따라서,이 동물 모델은 나병 연구 커뮤니티 내에서 폭 넓은 수용을 얻고있다.
본 보고서에서, 우리는 누드 마우스 풋 패드에서 균의 효소 정제를위한 간단한 프로토콜을 설명, M.의 준비를위한 것 최소한의 세포 파편과 높은 세균 생존 지수 leprae 서스펜션. 생존율이 급격히 실험실에서 수행 될 수 형광 현미경에 의해 결정된다. 우리는 또한 감기 Ziehl-Neelsen 염색하고 광학 현미경에 의한 세균성 계산을위한 표준 방법에 변형을 보여줍니다. 또한, 우리는 M.의 유지 관리 및 저장을 위해 다른 프로토콜을 제시한다 leprae 변종, 수 냉동 세균성 세인트의 해동ocks.
M.의 전파 잘 설명, 성공 프로토콜에 대한 자세한 설명 leprae가 매우 필요합니다. 우리의 연구는 여과 및 트립신 소화에 의해 접종 준비의 프로토콜이 접종이 (+ 0 점수) 아주 작은 세포 파편과 간균의 높은 생존 능력을 얻을 수 있습니다 것을 보여줍니다. 수산화 나트륨 간균 6 정화용 조직을 해리하는 데 사용되었다. M. 정화용 수산화 나트륨을 사용하여 실험실에서 수행 연구 leprae는 생존의 의지와 동물 접종 (데이터가 표시되지 않음)에 대한 서스펜션의 균질화를 방해, 균 덩어리의 형성 결과.
여과 및 트립신의 소화에 의해 접종 준비에 발생하는 잠재적 인 문제는 세균 또는 진균과 접종의 세포 파편과 오염 물질의 많은 양이 (가) 있습니다. 경우 휴대 debr 많은 양의정화 후 관찰, 하나 트립신는 더 이상 또는 생물학적 물질의 과도한 양이되어 있습니다. 트립신 원액 효소 활성을 평가해야합니다. 초기 생체 물질의 과량이 의심되는 경우, 물질은 분취 량으로 분할되어야하며 프로토콜은 별도 배치로 수행되어야한다. 세균 또는 진균과 접종의 오염을 방지하기 위해 치료는 무균 조건 하에서 물질을 처리하기 위해주의해야합니다. 곰팡이 및 / 또는 세균 오염이 감지 된 경우 정지는 폐기해야합니다.
우리 프로토콜의 제한은 기재된 반 정량 방법을 사용하여 생존력 평가의 주관성이다. 게시 된 양적 방법 6보다 정확한 비록 반 정량적으로 평가 가능성이 더 실용적입니다. 0 +, 1 +의 생존 능력 점수는 전파 및 동결의 유지 보수에 대한 만족M. leprae. 라히리 등. 이미 80-90% 가능한 접종을 접종 누드 마우스는, 접종 4 ~ 5 개월 (높은 생존 균)을 수확에 적합한 보호구가 발생하는 것으로 나타났습니다. 따라서, (4 개월 정도) 초기 감염은 최고의 수확 시간입니다. 냉동 접종의 수확, 본 프로토콜의 마우스는 성장 곡선을 보장하는 긴 기간 (7 개월)에 접종 유지되었다. 충분한 가능성을 보장하는 중요한 단계는 바람직하게는 호스트 및 처리에서 생체 물질의 수집 후 24 시간 이내에, 신선한 균 현탁액의 사용이다. 또한, 시약의 품질, 갓 준비한 희석 트립신과 생존 염색법 솔루션은 재현 가능한 결과를 보장하기 위하여 필요하다.
이 프로토콜의 또 다른 한계는 그 최종 M. leprae 서스펜션 호스트 DNA, RNA, 단백질 등의 무료로하지 않습니다. 따라서 다른 정제 단계는 t을 추가해야합니다오 M.에게 취득 leprae 현탁액 숙주 세포 성분의 자유로운.
M.의 전체 조직 표본을 동결 생존 균을 유지하기위한 방법 leprae의 병변은 9보고 된 바있다. 그러나 Portaels 등의 연구. 동결 M.의 해동 후 65~97% 사이에 이르기까지 생존 보여 상당한 손실, leprae 아르마딜로 9에서 얻은 조직 표본을 감염. 우리의 프로토콜은 것을 보여 주었다 M.에서 관찰 된 생존 능력 지수 (표 1) 냉동되지 않은 분취 량에 비해 동결 융해 후 leprae 현탁액은 떨어졌다. 실제로, M. 동결 냉동 미디어 leprae 서스펜션까지 생존 능력을 산출 생존 점수 1 +와 50 ~ 70 %, 생존 능력 점수 0 +가 고정되지 않은 정지를 얻었다하면서부터. 그럼에도 불구하고, M.의 곱셈 leprae은 (누드 마우스 7 개월 후 접종 후 만족했다 <strong> 표 1). 재구성 된 샘플을 가진 누드 마우스의 접종은 평균 100 배에 비해 초기 접종 균의 수가 증가 결과 60 일 동안 냉동 유지 하였다. 해당 컴퓨터의 M. 동결 대신에 감염된 조직 표본의 동결 미디어 leprae 서스펜션은 더 효율적입니다. 우리의 프로토콜의 중요한 단계 Colston 및 Hilson (8)에 의해 설명되는 것과 같이 균이 생존 유지에 필요한 냉동 컨테이너에 AFB의 느린 냉동입니다. 향후 실험은 더 이상 동결 기간 후 균의 생존 능력을 평가하기 위해 실시됩니다.
요약하면, 때문에 M. leprae는 체외에서 성장하지 않습니다, 우리의 프로토콜은 가능한 접종의 유지 보수를위한 빠르고 쉬운 대안을 허용하고 성공적으로 동결 단계는 이렇게 정의 된 균주 은행의 설립을 가능하게 동물의 연속 통과하지 않고 긴장의 유지 보수를 가능하게한다.
이 절에서는이 프로토콜을 수행하기 위해 시약을 제조하기위한 지침이 포함되어 있습니다.
1. 트립신
트립신 | 0.5 g |
증류수 | 최대 100 ML |
소독 필터. -20 ° C.에 저장
2. 7H9
7H9 국물베이스 | 4.7 g |
40 % 글리세롤 | 5 ㎖ |
증류수 | 최대 900 ML |
교반하는 동안 물에 기반을 혼합 한 후 글리세롤을 추가합니다. 살균하는 20 분 동안 121 ° C에서 압력솥. 4 ℃에서 보관
3. 뇌 심장 주입 (BHI)
BHI | 37g |
증류수 | 최대 1,000 ml의 |
살균하는 15 분 동안 121 ° C에서 압력솥. 4 ℃에서 보관
4. 페놀 혈청
4.1) 5 % 페놀
페놀 | 5 ㎖ |
증류수 | 최대 100 ML |
4.2) 혈청 페놀
소 태아 혈청 | 2 ㎖ |
5 % 페놀 | 98 ML |
4 ℃에서 보관
5. 차가운 Ziehl-Neelsen 얼룩위한 솔루션
5.1) CarboFuchsin
푹신 | 1g |
페놀 결정은 60 ° C에 융합 | 5 ㎖ |
순수 에틸 알코올 | 10 ㎖ |
증류수 | 최대 100 ML |
각 사용하기 전에 필터.
5.2) 메틸렌 블루 자료
메틸렌 블루 | 3g |
95 % 에틸 알코올 | 최대 200 ML |
5.3) 알코올 산
70 % 알코올 | 990 ㎖의 |
chloridric 산 | 10 ㎖ |
6. 냉동 매체 :
OADC | 10 ㎖ |
글리세린 | 20 ㎖ |
7H9 매체 | 최대 100 ML |
사용하기 전에 글리세롤을 압력솥과 여과 OADC 소독.
7. 멸균 M. leprae 정지
20 분 동안 121 ° C에서 압력솥. -20 ° C.에 저장
The authors have nothing to disclose.
우리는 기술 지원을 비트 리즈 GC 사르 토리, Lázara M. Trino, 아나 엘리사 Fusaro와 클라우디아 오후 카르발류 감사합니다. 우리는 동물 시설의 설립을 지원하기 위해 프라 납 K. 다스 감사합니다. 우리는 원고를 수정에 Lais RR 코스타 감사합니다. 이 연구는 Fundação 파울리스타 콘트라 Hanseníase 및 Pesquisa à Fundação 데 앰 파로에서 교부금에 의해 지원되었다 에스 타도 데 상파울루 (FAPESP을 2009/06122-5) 할.
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo1°C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova INC | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer – 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |