Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Optimaliserte protokoller for doi: 10.3791/50620 Published: March 23, 2014

Summary

Leprabasill, den forårsaker agent av spedalskhet, ikke vokser in vitro. Vi beskriver en enkel å følge protokollen for å forberede en basillær suspensjon for å sikre opprettholdelse av store mengder av M. leprae for en rekke applikasjoner. Protokoller for formering med musen footpad inokulasjon, evaluering av levedyktighet, frysing og tining basillær lager er beskrevet i detalj.

Abstract

Spedalskhet, forårsaket av Mycobacterium leprae, er en viktig smittsom sykdom som fortsatt er endemisk i mange land rundt om i verden, blant annet Brasil. Det er for tiden ingen kjente metoder for dyrking M. leprae in vitro, presentere en stor hindring i studiet av dette patogenet i laboratoriet. Derfor, opprettholdelse og vekst av M. leprae stammer fortrinnsvis utført i atymisk nakenmus (NU-Foxn1 nu). Den laboratorieforhold for bruk av mus er lett tilgjengelig, lett å utføre og tillater standardisering og utvikling av protokoller for å oppnå reproduserbare resultater. I den foreliggende rapport beskriver vi en enkel protokoll for rensing av bakterier fra nakne mus footpads ved hjelp av trypsin, noe som gir en suspensjon med et minimum av cellerester og med høy bakteriell levedyktighet indeks, bestemt ved fluorescerende mikroskop. En modifikasjon av standard metode for basillær telling av Ziehl-Neelsenbeising og lys-mikroskopi fremkommer også. I tillegg beskriver vi en protokoll for frysing og tining bacillary aksjer som et alternativ protokoll for vedlikehold og lagring av M. leprae stammer.

Introduction

Spedalskhet, en sykdom forårsaket av Mycobacterium leprae, er et viktig folkehelseproblem i mange land rundt om i verden 1,2. Til tross for å være kjent som en smittsom sykdom som påvirker både hud og perifere nerver, er det fortsatt flere kunnskapshull om mekanismene som er involvert i den komplekse immunpatogenese av sykdommen.

Blant de utfordrende egenskapene til M. leprae som hindrer dens studien er dens manglende evne til å vokse i kunstig kultur media og dens relativt lang dobling tid (ca 14 dager) 3,4. De fleste eksperimentelle prosedyrer som bruker M. leprae er satt opp med basiller renset fra hudlesjoner av spedalskhet pasienter eller fra eksperimentelle dyremodeller, for eksempel beltedyr og flere stammer av mus 5,6.

I mange år har forskerne avhengig av rensing av M. leprae fra hudlesjoner av multibacillary leprOSY pasienter for anvendelse i eksperimentelle prosedyrer. Mange laboratoriebetingelser for in vitro kultiveringen eller vedlikehold av levende M. leprae har vært forsøkt, men til dags dato, har dyremodeller vist seg å være mest egnet for forskningsformål. I 1960 og 1970 begynte forskere ved hjelp av mus og beltedyr for påvisning og vurdering av M. leprae levedyktighet, overvåking bakteriell vekst som respons på anti-M. leprae narkotika, og i vekst og vedlikehold av mykobakterier stammer 2,4.

De dyremodeller har noen begrensninger, særlig i beltedyr og ikke-menneskelige primater, inkludert etiske spørsmål, kostnadene ved vedlikehold, spesielle infrastruktur som trengs for dyr vedlikehold og dårlig reproduserbarhet av resultater og endelige avkastning. Foreløpig foretrekker datamus modelldyr for spedalskhet forskning. Den laboratorieforhold for bruk av mus er lett tilgjengelig, lett å utføre og tillater standardiserte protokoller M. leprae stammer fordi, selv med lave levedyktige bacillary belastninger fører til T-celle-manglende immunrespons mot strømmende dannelse av arrvev og god basillær multiplikasjon. Dermed har denne dyremodell fått bred aksept innenfor det spedalskhet forskningsmiljøet.

I den foreliggende rapport beskriver vi en enkel protokoll for enzymatisk rensing av bakterier fra nakne mus footpads, beregnet for fremstilling av en M. leprae suspensjon med minimal celle rusk og med høy bakteriell overlevelsesindeks. Levedyktigheten er bestemt av fluorescerende mikroskop, som kan bli hurtig gjennomført i laboratoriet. Vi viser også en modifikasjon til standardmetoden for basillær telling av kulde Ziehl-Neelsen flekker og lys mikroskopi. I tillegg presenterer vi en alternativ protokoll for vedlikehold og lagring av M. leprae stammer, slik at frysing og tining av smitteførende stocks.

Protocol

En. Utarbeidelse av Mycobacterium leprae Suspension

  1. Før euthanizing den atymisk naken mus (NU-Foxn1 nu), klar trypsin-løsning og kulturmedia (Protocol av reagensene - Protocols 1, 2 og 3). Avlive nakenmus 4-5 måneder etter vaksinasjon med M. leprae ifølge AVMA Retningslinjer for Avliving av dyr: 2013 Edition 10 (eksperimenter og bruk av bilder av dyr ble godkjent og gjennomført i samsvar med retningslinjene for Animal Care Komiteen Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). Inne i en biologisk sikkerhetskabinett for håndtering av dyr, rengjøre hele mus med 70% etanol alkohol.
  2. Hold den bakre pote hjelp hemostatic tang fjernt til tarsal felles. Skjær pote av med saks under tang og dypp labben i 2% jod i 20 min. Deretter gjentar du prosessen med det andre bak labben.
  3. Overfør potene til enren biologisk sikkerhetskabinett for videre arbeid. Ta poter ut av 2% jod, tørk dem med steril kompress og deretter samle de to footpads bruker nummer 22 eller 23 skalpell blad, fjerne alt bløtvev (dermis, epidermis, sener og nerver) nær til beinet. Fjern metatarsals bein og den første og femte phalanges. Plasser materialet i en steril petriskål og fjerne overhuden, ved å skrape det med skalpellen blad. Skjær vev i små biter med saks, og overføre dem til en rundbunnet rør. Vekt vevet og tilsett 1 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Hold røret på is for å unngå oppvarming av prøven.
  4. Legg ytterligere 1 ml HBSS og homogenisere prøven ved hjelp av en vev-homogenisator.
    1. Først homogenisering syklus: 3 pulser av 15 sek på hastighet 4 (14 450 rpm).
    2. Overfør supernatanten til et sterilt 50 ml konisk rør, passerer det gjennom en celle sil for å fjerne den gjenværende rester. La løsningen passerer grateten.
    3. Legg ytterligere 2 ml HBSS, og gjenta syklusen homogenisering (avsnitt 1.4.1), og passerer prøvene gjennom cellen sil nytt.
    4. Skyll silen ved å tilsette HBSS for å bringe volumet til 9 ml. Kast celle sil.
  5. Tin en alikvot av 0,5% trypsin-løsning. Tilsett 1 ml av trypsin til 9 ml av cellesuspensjonen for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,05% trypsin. Kast gjenværende tint trypsin. Inkuber i 60 min i et 37 ° C vannbad. Etter inkubasjon bringe volumet opp til 40 ml ved tilsetning av sterilt saltvann for å fortynne trypsin.
  6. Sentrifuger ved 1700 x g i 30 min ved 4 ° C.
  7. Kast supernatanten ved forsiktig røret ble snudd. Resuspender pellet ved å banke røret og deretter legge til en ml sterilt saltvann. Overfør suspensjonen i et nytt konisk rør måle sluttvolumet av suspensjonen (for å beregne utbyttet / gram vev).
  8. Homogenisere basillær suspensjonen med en 1 ml insulinsprøyte med en 26 G nål ved overføring av suspensjonen til et nytt rør.
  9. Utfør mikrobiologisk kontroll av suspensjonen ved å plassere to dråper (50 ul) av det i hvert medium: 7H9 og Lowenstein-Jensen medium og inkuber ved 37 ° C i 30 dager, for påvisning av kontaminerende mykobakterier. Tilsvarende inokulere en hjerne-hjerte-infusjon (BHI) medium og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C, for påvisning av kontaminerende aerobe bakterier.
  10. Alikvot av suspensjonen inn i rørene for farging: 35 pl for Cold Ziehl-Neelsen farging (protokoll 2), og 200 pl for levedyktighet bestemmelse (protokoll 3).
  11. Etter Ziehl-Neelsen farging (Zn), beregne antall syrefaste staver / ml (AFB / ml). For nakenmus inokulasjon, utarbeide en 1 x 10 8 AFB / ml suspensjon, sørg for å ha nok volum til å vaksinere 30 mL / footpad / dyr (Protokoll 5), og holde suspensjon kaldt før vaksinasjonen. For frysing, utarbeide en 1 x 10 7 AFB / ml suspensjon (protokoll 4).

2. Cold Ziehl-Neelsen Farging

  1. Før start av fargingen, forberede serum / fenol-løsningen og ZN, fargeløsninger (Protokoll av reagensene - Protokoller 4 og 5). Tegn tre sirkler (indre diameter 10 mm) på tre glassplater ved hjelp av en immunhistokjemi penn. Identifiser lysbildene: (1) normal eller ufortynnet, (2) 01:10, og (3) 1:100 ved hjelp av en rekke 2 blyant (Merk: noen grafitt fades ut etter ZN flekker).
  2. Fortynne basillær suspensjon (Step 1.10) til 1:10 og 1:100 seriefortynning, dvs. legge 5 mL av ufortynnet fjæring og 45 mL av saltvann, så ta 5 mL av 1:10 og legge 45 mL av saltvann.
  3. Tilsett 5 ul av serum / fenol-løsning og 10 ul av smitteførende suspensjon per sirkel. Homogen og fordeles jevnt over hele området av sirkelen med håndtaket på en engangs-sløyfe. Vent til suspensjonen for å tørke på en planert tabell.
  4. Etter dTEKING, fikse smøre ved å sende raset tre ganger over den blå flamme av en Bunsen-brenner (rundt 20 sek totalt) 11.
  5. For farging, dekker hele overflaten av lysbildet med filtrert Ziehl-Neelsen carbofuchsine (ca 5 ml) i 20 min.
  6. Skyll raset i rennende vann (slow flow).
  7. Dekk lysbilde med en 10% syre alkohol løsning for ca 20 sek.
  8. Vask raset igjen i rennende vann.
  9. Dekk lysbilde med en metylen-blått-løsning i 5 min.
  10. Skyll raset i rennende vann og la det tørke i romtemperatur.
  11. Teller 20 felt / sirkel (totalt 60 felt / slide) med en 100X oljeneddyppingsobjektivet. Beregningen av syrefaste staver / ml (AFB / ml) er gjort som følger, i henhold til beskrivelsen i laboratoriet Teknikker for spedalskhet 12:
    AFB / felt = totalt antall bakterier som finnes i de tre sirklene (60 felt) delt på 60 år.
    AFB / ml = AFB / felt x konstant (område av sirkelenx 100 delt på området av objektivets blenderåpning), og hvis telle en fortynnet suspensjon, multiplisere antall AFB / ml med fortynningsfaktoren (10 eller 100).

Tre. Levedyktighet Bestemmelse

  1. Før du starter, forberede autoclaved M. leprae suspensjon (Protokoll av reagenser - Protokoll 7). Bruk riktig kit (se tabell av reagenser og utstyr) for kvalitativ bestemmelse av M. leprae levedyktighet i suspensjon. Fortynn de løsningene som følger (alle prosedyrer skulle utføres under svakt lys): fortynne oppløsningen A med en faktor på 10 i saltløsning (1 ul stam pluss 9 ul saltoppløsning), fortynnes oppløsningen B 20 med en faktor på i saltløsning (1 ul stam pluss 19 mL saltvann).
  2. Til 3,6 mL av fortynnet oppløsning A og 6 pl av fortynnet oppløsning B til 200 pl av den bacillary suspensjon som skal testes (trinn 1.10). En tidligere autoclaved M. leprae suspensjonen blir rutinemessig brukt som enegative kontroll for levedyktighet farging.
  3. Inkuber suspensjoner i 15 minutter, ved romtemperatur i mørket.
  4. Sentrifuger i røret på 10 600 xg i 5 min ved 4 ° C.
  5. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 15 pl 10% glyserol. Påfør 8 mL til overflaten av et rent glass lysbilde og dekke den med et lite dekkglass. Analyser lysbildet bruker et fluorescerende mikroskop, som inneholder de riktige filtrene (se molekylære prober anbefalinger). Evaluere resultatene ved å sammenligne Syto 9 (Sy) flekker å Propidium jodid (PI) flekker.
    Merk: Sy flekken penetrerer 100% av både døde og levende bakterier, og PI flekken penetrerer bare bakterier med ødelagte membraner. Den autoklaverte suspensjon (negativ kontroll) kan danne klumper av bakterier på grunn av tilstedeværelsen av cellerester. Den semikvantitativ skala som brukes for levende / døde evaluering varierer fra 0 til 2 +, 0 angir at mindre enn 30% av cellene er positive for PI flekken, 1 + vil si mellom 30 -50% av cellene er positive for PI flekken, 2 + betyr at mer enn 50% av cellene er positive for PI flekken. En score på 0 anses mest tilfredsstillende for bruk.

4. Frysing / tining M. leprae Suspension

  1. Før du starter, forberede frysing medium (Protokoll av reagenser - Protocol 6). For frysing, bruker du fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor:
    1. Tilsett 150 ul av suspensjonen inneholdende 1 x 10 7 AFB / ml til et sterilt cryovial sammen med 1 ml iskaldt medium.
    2. Plasser cryovial i en frysebeholder og lagre beholderen ved -80 ° C i 24 timer.
    3. Overfør den frosne hetteglass til en oppbevaringsboks og lagre det ved -80 ° C.
  2. For tining, bruker du fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor:
    1. Fjern cryovial med frossen suspensjon fra -80 ° C og legg den i en 37 ° C vannbad for å begynne å tine suspensjon.
    2. Hell suspensjonen inn i et rør inneholdende 20 ml steriltsaltvann. Bland suspensjonen forsiktig til tining er fullført.
    3. Sentrifuger suspensjonen i 30 min, ved 1700 xg, ved 4 ° C.
    4. Kast supernatanten og tilsett tilstrekkelig sterilt saltvann for å oppnå det ønskede volum. Homogensuspensjonen ved å føre den gjennom en sprøyte (trinn 1.8).
    5. For ZN farging, levedyktighet besluttsomhet og inokulasjon, følg Protokoller to, tre og fem.

5. Mus Pode

  1. To personer er nødvendig for denne prosedyren, til man holde musa og en annen for å administrere pode. Dyret skal vaksinert må skje i henhold til etiske retningslinjer og regler, og alle prosedyrer skal godkjennes av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komité. Beherske naken mus ved nakkeskinnet med potene opp.
  2. Homogensuspensjonen ved å føre det gjennom en 26 G nål. Med en 1 ml sprøyte, aspirer nok basillær suspensjon til inokulaterte to footpads (30 mL / footpad).
  3. Hold den bakre labb, rense fotpute med 70% etanol alkohol før injeksjon og innføre nålen intradermalt med skråkant av nålen peker opp, fra den nære til den distale side av fotpute. Injisere 30 mL av suspensjon. Footpad injeksjoner kan utføres i anesteserte mus.
  4. Vent 5 sek før kanylen trekkes ut av huden for å unngå refluks av podestoffet. Mus bør bli plassert på myke senger innlegg inokulasjon, og ambulation og tegn på selvskading bør overvåkes.

Representative Results

Suksessen av protokollen kan vurderes på tre måter. For det første er vurdering av kvaliteten av inokulum bestemmes av mengden av cellerester, og den resulterende prosentandel av levedyktige bakterier i den endelige suspensjon (Se protokoll 3). Som vist i figur 1 og 2, inneholdt det endelige basillær suspensjon meget liten celleavfall og høy levedyktighet (skår 0 +); merke seg at de fleste Bacillus farget med Syto 9 grønt fluorescerende flekk (stain penetrerer 100% i begge døde og levende bakterier figur 1), og bare et fåtall bacilli farget med den røde PI fluorescerende flekk (stain penetrerer kun bakterier med skadede membraner, figur 2).

Figur 1
Figur 1. Syto 9 farging av M. leprae suspensjon. Grønn fluorescens demonstrerer tilstedeværelse av levende og døde M. leprae. 400X.

Fig. 2
Figur 2. PI farging av M. leprae suspensjon. Red fluorescens viser det lave antallet døde M. leprae. 400X.

For det andre vil et inokulum med høy levedyktighet av betydning for multiplikasjon av bacilli i footpads av dyr etter 4-5 måneder etter inokulering, med utvikling av tydelig makroskopisk lesjon, slik som vist i video (protokoll 1). Den tredje måten å vurdere suksessen av protokollen er ved å evaluere overlevelse og formering av AFB i muse footpads inokulert med basiller som hadde vært frosset for ulike perioder (Se protokoll 4).

"Cellspacing =" 0 "> Experiment (dyr) Antall AFB / ml frosset ved dag 0 Livskraftig poengsum / dag 0 Frysing periode (dager) Antall AFB vaksinert etter frysing Livskraftig poengsum etter frysing Antall AFB / ml utvinnes etter syv måneder 1 (1) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 2,3 x 10 8 1 (2) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 3,8 x 10 7 1 (3) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 8,5 x 10 7 1 (4) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 <td> 1 + 4,6 x 10 7 2 (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 1,7 x 10 7 2 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 4,8 x 10 6 2 (3) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 8,6 x 10 6 3. (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,2 x 10 7 3 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (3) 1,0 x 10 7 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (4) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 2,6 x 10 7 3 (5) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 3,7 x 10 6

Tabell 1. Resultater av M. leprae multiplikasjon med post frysing suspensjoner.

Tabell 1 viser resultatene av M. leprae vekst ved hjelp av suspensjoner etter frysing. Levedyktighet poengsum av suspensjoner etter tining var en +. Fryse protokollen ble utført i tre uavhengige eksperimenter for å teste ulike fryseperioder. I begge forsøkene med inokulater frosset i 15 eller 60 dager, utfallet var lik, propagation etter frysing ga 10-1,000 ganger økning i antall AFB gjenvunnet fra hver fotpute etter 7 måneders inokulering (Tabell 1). Derfor frysing av M. leprae suspensjoner i 7H9-medium supplert med OADC (oljesyre-albumin-dekstrose-katalase) resulterte i opprettholdelse av levedyktighet.

Tre inokulater ble brukt til å evaluere M. leprae multiplikasjon etter to ulike fryseperioder (15 og 60 dager). Etter syv måneder, ble basiller utvinnes fra footpads av inokulert mus og telles etter Ziehl-Neelsen farging. Semikvantitativ levedyktighet skala: 0 midler fraværende inntil 30% av PI fargede celler; 1 + betyr mellom 30-50% av PI fargede celler; 2 + betyr over 50% av PI fargede celler. AFB: syrefaste staver.

Discussion

En detaljert beskrivelse av en godt illustrert vellykket protokoll for forplantning av M. leprae er sterkt nødvendig. Vårt studium viser at protokollen for inokulum preparatet ved filtrering og trypsin fordøyelse tillater inokula som kan oppnås med meget liten cellerester og med høy levedyktighet bacilli (skår 0 +). Natriumhydroksyd har vært brukt til å disaggregate vevet for rensing av bacilli 6.. Studier som er utført i vårt laboratorium ved hjelp av natrium-hydroksyd for rensing av M. leprae, resulterte i dannelse av klumper av bacilli, hindrer homogenisering av suspensjonen for levedyktighet bestemmelse og dyr inokulering (data ikke vist).

Potensielle problemer som oppstår med inokulatet preparatet ved filtrering og trypsin fordøyelse omfatter store mengder celle-debris, og forurensning av inokulum med bakterie-eller soppmidler. I tilfelle av store mengder cellulær Debrer observeres etter rensing, enten trypsin ikke lenger er aktiv, eller det er en overdreven mengde av biologisk materiale. Enzymatisk aktivitet av trypsin-stamløsning må evalueres. Hvis overdreven mengde innledende biologisk materiale man mistenker, bør materialet deles opp i alikvoter og protokollen må utføres i flere omganger. For å unngå forurensning av inokulumet med bakterie-eller soppmidler, må man sørge for å behandle materialet under aseptiske forhold. Hvis sopp-og / eller bakteriell forurensning oppdages suspensjon skal kasseres.

En begrensning av vår protokollen er en subjektiv levedyktighet evaluering ved hjelp av den beskrevne semi-kvantitativ metode. Levedyktighet vurderes semi-kvantitativt er mer praktisk, men mindre nøyaktig enn den publiserte kvantitativ metode 6. Livskraftig score på 0 + og 1 + er tilfredsstillende for vedlikehold av forplantning og frysing avM. leprae. Lahiri et al. har allerede vist at nakne mus inokulert med 80-90% levedyktig pode, resultere i footpads egnet for høsting (høy levedyktighet basiller) på 4-5 måneder med vaksinasjonen. Derfor er tidlig infeksjon (rundt 4 måneder) den beste høsting tid. For høsting av frossen inokulater, ble musene i denne protokoll opprettholdes inokulerte for lengre perioder (7 måneder) for å garantere vekstkurver. Et kritisk trinn for å sikre tilstrekkelig levedyktighet er bruk av friske bacilli suspensjoner, fortrinnsvis innen 24 timer etter oppsamling av biologisk materiale fra verten og prosessering. Videre er kvaliteten av de anvendte reagenser, tilberedes fortynnede trypsin og levedyktighet, fargeløsninger, er nødvendig for å sikre reproduserbare resultater.

En annen begrensning av denne protokollen er at den endelige M. leprae suspensjon er ikke fri for verts DNA, RNA, protein, etc. Derfor må det tilsettes andre rensetrinn to få en M. leprae suspensjon fri for vertscellekomponenter.

En fremgangsmåte for å opprettholde levedyktige bakterier ved frysing hele vevsprøver av M. leprae lesjoner har vært rapportert ni. Imidlertid er undersøkelse av Portaels et al. demonstrert betydelig tap av levedyktighet, og varierer mellom 65-97% etter frysing og tining av M. leprae infisert vevsprøver hentet fra armadillo ni. Vår protokoll viste at overlevelsesindeks observert i M. leprae suspensjoner etter frysing og tining var nede i forhold til den delmengde som ikke hadde vært frosset (tabell 1). Faktisk, frysing M. leprae suspensjon kuldemedier ga levedyktighet alt fra 50-70%, med levedyktighet poengsum 1 +, mens levedyktighet poengsum 0 + ble oppnådd i gassform suspensjon. Likevel, multiplikasjon av M. leprae var tilfredsstillende etter syv måneder etter vaksinasjonen av nakne mus ( M. leprae suspensjon i frysemediet, i stedet for infiserte vev prøver, er mer effektive. Et kritisk trinn i protokollen er langsom frysing av AFB i et innfrysningskar, som er nødvendig for å opprettholde levedyktige bakterier, som påvist ved Colston og Hilson 8.. Fremtidige eksperimenter vil bli utført for å vurdere levedyktigheten til basiller etter lengre frysing perioder.

I sammendrag, fordi M. leprae ikke vokser in vitro, tillater vår protokoll for en rask og enkelt alternativ for vedlikehold av levedyktige podestoff, og en vellykket frysing trinnet muliggjør opprettholdelse av stammene uten kontinuerlig passasje i dyr, og muliggjør opprettelse av en bank av definerte stammer.

Denne delen inneholder instruksjoner for å forberede reagenser for å utføre denne protokollen.

En. Trypsin

Trypsin 0,5 g
Destillert vann opp til 100 ml

Filter sterilisere. Oppbevares ved -20 ° C.

2. 7H9

7H9 buljong basen 4,7 g
40% glyserol lager 5 ml
Destillert vann opp til 900 ml

Bland basen med vann og tilsett glycerol under omrøring. Autoklav ved 121 ° C i 20 minutter for å sterilisere. Oppbevar ved 4 ° C.

Tre. Hjerne hjerte infusjon (BHI)

BHI 37 g
Destillert vann opp til 1000 ml

Autoklav ved 121 ° C i 15 minutter for å sterilisere. Oppbevar ved 4 ° C.

4. Fenol serum

4.1) 5% fenol

Fenol 5 ml
Destillert vann opp til 100 ml

4.2) Serum fenol

føtalt bovint serum 2 ml
5% fenol 98 ml

Oppbevar ved 4 ° C.

5. Løsninger for kaldt Ziehl-Neelsen Stain

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin 1 g
Fenol krystaller smeltet til 60 ° C 5 ml
Pure etylalkohol 10 ml
Destillert vann opp til 100 ml

Filter før hver bruk.

5.2) metylenblått Base

Metylenblått 3 g
95% etylalkohol opp til 200 ml

5.3) Alkohol syre

70% alkohol 990 ml
kloridisk syre 10 ml

6. Medium for frysing:

OADC 10 ml
Glyserol 20 ml
7H9 medium opp til 100 ml

Autoklav glyserol før bruk og sterilisere OADC ved filtrering.

7. Autoclaved M. leprae suspensjon

Autoklav ved 121 ° C i 20 min. Oppbevares ved -20 ° C.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro og Claudia PM Carvalho for teknisk assistanse. Vi takker Pranab K. Das for å støtte etableringen av dyret anlegget. Vi takker Lais RR Costa for å revidere manuskriptet. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Fundação Paulista contra Hanseníase og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BacLight Bacterial Viability Kit Invitrogen; Molecular Probes L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9269
Cryo 1 °C Freezing Container Nalgene 5100001
Lowenstein-Jensen medium LB Laborclin 901122
Saline TEK Nova Inc S5812
Pen Dako S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base TPP 91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon BD Falcon 352340
Trypsin Sigma T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base Sigma-Aldrich M0178 Fluka
Glycerol Gibco BRL 15514011
Brain heart infusion (BHI) Oxoid LTDA CM1135
Fuchsin Merck Millipore 1159370025
Phenol  Invitrogen 15509037
Ethyl alcohol Merck Millipore EX02764
Cloridric acid Merck 1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) Becton Dickinson 211886
Fetal bovine serum Gibco; LifeTechnologies 26140079

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saúde, M. inistérioda, Brasil, Secretaria de Vigilância em Saúde: situação epidemiológica da hanseníase no Brasil. Informe epidemiológico 2008. Forthcoming.
  2. Scollard, D. M., Adams, L. B., Gillis, T. P., Krahenbuhl, J. L., Truman, R. W., Williams, D. L. The continuing challenges of leprosy. Clin. Microbiol. Rev. 19, (2), 338-381 (2006).
  3. Rosa, P. S., Belone, A. deF., Lauris, J. R., Soares, C. T. Fine-needle aspiration may replace skin biopsy for the collection of material for experimental infection of mice with Mycobacterium leprae and Lacazia loboi. Int. J. Infect. Dis. 14, 49-53 (2010).
  4. Truman, R. W., Krahenbuhl, J. L. V. iableM. leprae as a research reagent. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 69, (1), 1-12 (2001).
  5. Levy, L., Ji, B. The mouse foot-pad technique for cultivation of Mycobacterium leprae. Lepr. Rev. 77, (1), 5-24 (2006).
  6. Lahiri, R., Randhawa, B., Krahenbuhl, J. Application of a viability-staining method for Mycobacterium leprae derived from the athymic (nu/nu) mouse foot pad. J. Med. Microbiol. 54, (3), 235-242 (2005).
  7. Katoch, V. M. The contemporary relevance of the mouse foot pad model for cultivating. 80, (2), 2-120 (2009).
  8. Colston, M. J., Hilson, G. R. The effect of freezing and storage in liquid nitrogen on the viability and growth of Mycobacterium leprae. J. Med. Microbiol. 12, (1), 1-137 (1979).
  9. Portaels, F., Fissette, K., De Ridder, K., Macedo, P. M., De Muynck, A., Silva, M. T. Effects of freezing and thawing on the viability and the ultrastructure of in vivo grown mycobacteria. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 56, (4), 580-587 (1988).
  10. American Veterinary Medical Association. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. Edition. Schaumburg, Illinois, USA, https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf. 1-102 (2013).
  11. Saúde, M. inistérioda, Brasil, Guia de procedimentos técnicos - Baciloscopia em hanseníase, Série A: Normas e manuais técnicos. (2010).
  12. Health Organization, W. orld, Geneva, Laboratory techniques for leprosy Forthcoming.
Optimaliserte protokoller for<em&gt; Leprabasill</em&gt; Strain Management: Frozen Stock Bevaring og vedlikehold i atymiske Nude Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).More

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter