Mycobacterium leprae, vilka smittämnen av spetälska, inte växer in vitro. Vi beskriver en lätt att följa protokollet för att förbereda en bacillär fjädring för att säkerställa bevarandet av stora mängder M. leprae för en mängd olika tillämpningar. Protokoll för förökning av mus trampdynan ympning, utvärdering av lönsamheten, frysning och upptining bacillär lager beskrivs i detalj.
Spetälska, som orsakas av Mycobacterium leprae, är en viktig infektionssjukdom som fortfarande är endemisk i många länder runt om i världen, bland annat Brasilien. Det finns för närvarande inga kända metoder för att odla M. leprae in vitro, presenterar ett stort hinder i studiet av denna patogen i laboratoriet. Därför, underhåll och tillväxt av M. leprae stammar är företrädesvis i atymiska nakna möss (NU-Foxn1 nu). Laboratorie villkoren för att använda möss är lätt tillgängliga, lätta att utföra, och tillåta standardisering och utveckling av protokoll för att uppnå reproducerbara resultat. I denna rapport beskriver vi ett enkelt protokoll för rening av baciller från nakenmus trampdynorna med användning av trypsin, vilket ger en suspension med minimal cellrester och med hög bakteriell viabilitet, enligt bestämning med fluorescensmikroskopi. En ändring av standardmetod för bacillär räkning av Ziehl-Neelsenfärgning och ljusmikroskopi är också visat. Dessutom beskriver vi ett protokoll för frysning och upptining bacillär bestånd som alternativ protokoll för underhåll och förvaring av M. leprae stammar.
Spetälska, en sjukdom som orsakas av Mycobacterium leprae, är ett viktigt folkhälsoproblem i många länder världen över 1,2. Trots att vara känd som en smittsam sjukdom som drabbar både hud och perifera nerver, finns det fortfarande flera brister i kunskap om de mekanismer som är involverade i den komplexa immunpatogenes av sjukdomen.
Bland de utmanande egenskaper M. leprae som hindrar sin studie är dess oförmåga att växa i artificiell odlingsmedia och dess relativt långa fördubbling tid (ca 14 dagar) 3,4. De flesta experimentella procedurer som använder M. leprae sätts upp med baciller renade från hudskador av spetälska patienter eller från experimentella djurmodeller, såsom bältdjur och flera stammar av möss 5,6.
Under många år har forskare beroende rening av M. leprae från hudskador av multibacillary leprOSY patienter för användning i experimentella procedurer. Flera laboratorieförhållanden för odling in vitro eller underhåll av levande M. leprae har försökts, men till dags dato har djurmodeller visat sig vara mest lämplig för forskningsändamål. Under 1960 och 1970, forskare började använda möss och bältdjur för kartläggning och bedömning av M. leprae viabilitet, övervaka bakterietillväxt som svar på anti-M. leprae droger, och i tillväxten och underhållet av mykobakteriestammar 2,4.
I djurmodeller har vissa begränsningar, särskilt i bältdjur och icke-mänskliga primater, däribland etiska frågor, kostnader för underhåll, särskild infrastruktur som behövs för djurens underhåll och dålig reproducerbarhet av resultat och slut avkastning. För närvarande, möss är den föredragna modellen djur för spetälska forskning. Laboratorie villkoren för att använda möss är lätt tillgängliga, lätta att utföra, och möjliggöra standardiserade protokoll <sup> 7,8,9. Nakna möss har använts i underhållet av M. leprae stammar eftersom, även med låga viabla bacillär belastningar leder den T-cell-deficient immunsvar på översvallande granulombildning och god bacillär multiplikation. Således har denna djurmodell vunnit bred acceptans inom spetälska forskarsamhället.
I denna rapport beskriver vi ett enkelt protokoll för enzymatisk rening av baciller från naken mus trampdynorna, avsedd för framställning av en M. leprae fjädring med minimal cellfragment och med hög bakteriell viabilitet. Viabiliteten bestäms genom fluorescerande mikroskopi, som snabbt kan utföras i laboratoriet. Vi visar också en ändring av standardmetod för bacillär räkning av kall Ziehl-Neelsen färgning och ljusmikroskop. Dessutom presenterar vi ett alternativt protokoll för underhåll och förvaring av M. leprae stammar, så att frysning och upptining av bacillär stocks.
En detaljerad beskrivning av en väl illustrerad, framgångsrik protokoll för förökning av M. är stort behov leprae. Vår studie visar att protokollet av inokulat förberedelse genom filtrering och trypsin matsmältning gör att inokulat som skall uppnås med mycket liten cellrester och med hög lönsamhet för baciller (poäng 0 +). Natriumhydroxid har använts för att dela upp den vävnad för rening av baciller 6. Studier utförda i vårt laboratorium med hjälp av natriumhydroxid för rening av M. leprae resulterade i bildning av klumpar av baciller, vilket bromsar homogenisering av suspensionen för viabilitet och djur ympning (data visas ej).
Potentiella problem med inokulat förberedelse genom filtrering och trypsin matsmältningen inkluderar stor mängd cellrester och förorening av inokulat med bakterie-eller svampmedel. I händelse av stora mängder cellulärt DEBRär observeras efter rening, antingen trypsin är inte längre aktiv eller om det finns en överdriven mängd biologiskt material. Enzymatisk aktivitet av trypsin stamlösning måste utvärderas. Vid misstanke om överdriven mängd inledande biologiskt material, skall det material som delas upp i portioner och protokollet bör ske i omgångar. För att undvika kontaminering av inokulat med bakterie-eller svampmedel, måste man för att bearbeta materialet under aseptiska förhållanden. Om svamp-och / eller bakteriell kontamination upptäcks suspensionen kasseras.
En begränsning av våra protokoll är den subjektiva utvärderingen viabilitet med användning av den beskrivna semi-kvantitativ metod. Livskraft bedömas halv kvantitativt är mer praktiskt, men mindre exakt än den publicerade kvantitativ metod 6. Viabilitet poäng av 0 + och 1 + är tillfredsställande för underhåll av förökning och frysning avM. leprae. Lahiri et al. har redan visat att nakna möss inokulerade med 80 till 90% viabla inokulum, resultera i trampdynorna som är lämpliga för att skörda (hög viabilitet baciller) vid 4-5 månader efter inokulation. Därför är det bästa skörden tidig infektion (ca 4 månader). För skörd av frysta inokulat, mössen i det nuvarande protokollet bibehålls ympade under längre perioder (7 månader) för att garantera tillväxtkurvor. Ett kritiskt steg för att säkerställa tillräcklig lönsamhet är användningen av färska baciller suspensioner, helst inom 24 timmar efter insamling av biologiskt material från värden och bearbetning. Dessutom är kvaliteten på de reagenser, nylagade utspädda trypsin och viabilitetsfärgning lösningar, är nödvändiga för att säkerställa reproducerbara resultat.
En annan begränsning med detta protokoll är att det slutliga M. leprae fjädring är inte fri från värd DNA, RNA, protein, osv. Därför måste andra reningssteg läggas to få en M. leprae fjädring utan värdkomponenter cell.
En metod för att upprätthålla livskraftiga baciller genom att frysa hela vävnadsprover av M. leprae skador har rapporterats 9. Men studien av Portaels et al. visade betydande förlust av livskraft, som sträcker sig mellan 65-97% efter frysning och upptining av M. leprae infekterade vävnadsprover erhållna från bältdjur 9. Vår protokoll visade att lönsamheten index observerats i M. leprae suspensioner efter frysning och upptining sjunkit jämfört med den alikvot som inte hade varit fruset (Tabell 1). Faktum är att frysa M. leprae suspension i frysmediet gav viabilitet som sträcker sig från 50-70%, med viabilitet betyget 1 +, medan viabilitet Poäng 0 + erhölls i den ofrysta suspensionen. Ändå förökningen av M. leprae var tillfredsställande efter 7 månader efter ympning av nakna möss ( <sTrong> Tabell 1). Inympning av nakna möss med rekonstituerade prover underhålls fryst i 60 dagar resulterade i genomsnittliga 100 gånger ökar i antalet baciller jämfört med den ursprungliga ympen. Det framgår att en frysning av M. leprae suspension i frysning media, istället för infekterade vävnadsprover, är effektivare. Ett kritiskt steg i våra protokoll är den långsamma frysningen av AFB i en frysbehållare, nödvändigt för att upprätthålla baciller livskraftig, vilket framgår av Colston och Hilson 8. Framtida experiment kommer att genomföras för att bedöma lönsamheten för baciller efter längre frysningsperioder.
I sammanfattning, eftersom M. leprae växer inte in vitro, gör våra protokoll för ett snabbt och enkelt alternativ för underhåll av livskraftiga inokulat, och den framgångsrika fryssteget möjliggör underhåll av stammar utan kontinuerlig passage i djur, vilket gör det möjligt att inrätta en bank av definierade stammar.
Det här avsnittet innehåller anvisningar för att förbereda reagenser för att utföra detta protokoll.
1. Trypsin
Trypsin | 0,5 g |
Destillerat vatten | upp till 100 ml |
Filter sterilisera. Förvara vid -20 ° C.
2. 7H9
7H9 buljong bas | 4,7 g |
40% glycerol lager | 5 ml |
Destillerat vatten | upp till 900 ml |
Blanda bas med vatten, sedan tillsätt glycerol under omröring. Autoklavera vid 121 ° C under 20 min för att sterilisera. Förvaras vid 4 ° C.
3. Brain Heart Infusion (BHI)
BHI | 37 g |
Destillerat vatten | upp till 1000 ml |
Autoklavera vid 121 ° C under 15 min för att sterilisera. Förvaras vid 4 ° C.
4. Fenol serum
4.1) 5% fenol
Fenol | 5 ml |
Destillerat vatten | upp till 100 ml |
4.2) Serum fenol
fetalt bovint serum | 2 ml |
5% fenol | 98 ml |
Förvaras vid 4 ° C.
5. Lösningar för kall Ziehl-Neelsen Stain
5,1) CarboFuchsin
Fuchsin | 1 g |
Fenol kristaller fuserad till 60 ° C | 5 ml |
Ren etylalkohol | 10 ml |
Destillerat vatten | upp till 100 ml |
Filtrera före varje användning.
5.2) metylenblått Base
Methylene Blue | 3 g |
95% etylalkohol | upp till 200 ml |
5.3) Alkohol acid
70% alkohol | 990 ml |
chloridric syra | 10 ml |
6. Medium för frysning:
OADC | 10 ml |
Glycerol | 20 ml |
7H9-medium | upp till 100 ml |
Autoklav glycerol före användning och sterilisera OADC genom filtrering.
7. Autoklaverad M. leprae suspension
Autoklavera vid 121 ° C under 20 min. Förvara vid -20 ° C.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro och Claudia PM Carvalho för tekniskt stöd. Vi tackar Pranab K. Das för att stödja inrättandet av djuranläggningen. Vi tackar Lais RR Costa för ändring av manuskriptet. Denna studie har finansierats med bidrag från Fundação Paulista contra Hanseníase och Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo1°C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova INC | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer – 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |