Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Optimerade protokoll för doi: 10.3791/50620 Published: March 23, 2014

Summary

Mycobacterium leprae, vilka smittämnen av spetälska, inte växer in vitro. Vi beskriver en lätt att följa protokollet för att förbereda en bacillär fjädring för att säkerställa bevarandet av stora mängder M. leprae för en mängd olika tillämpningar. Protokoll för förökning av mus trampdynan ympning, utvärdering av lönsamheten, frysning och upptining bacillär lager beskrivs i detalj.

Abstract

Spetälska, som orsakas av Mycobacterium leprae, är en viktig infektionssjukdom som fortfarande är endemisk i många länder runt om i världen, bland annat Brasilien. Det finns för närvarande inga kända metoder för att odla M. leprae in vitro, presenterar ett stort hinder i studiet av denna patogen i laboratoriet. Därför, underhåll och tillväxt av M. leprae stammar är företrädesvis i atymiska nakna möss (NU-Foxn1 nu). Laboratorie villkoren för att använda möss är lätt tillgängliga, lätta att utföra, och tillåta standardisering och utveckling av protokoll för att uppnå reproducerbara resultat. I denna rapport beskriver vi ett enkelt protokoll för rening av baciller från nakenmus trampdynorna med användning av trypsin, vilket ger en suspension med minimal cellrester och med hög bakteriell viabilitet, enligt bestämning med fluorescensmikroskopi. En ändring av standardmetod för bacillär räkning av Ziehl-Neelsenfärgning och ljusmikroskopi är också visat. Dessutom beskriver vi ett protokoll för frysning och upptining bacillär bestånd som alternativ protokoll för underhåll och förvaring av M. leprae stammar.

Introduction

Spetälska, en sjukdom som orsakas av Mycobacterium leprae, är ett viktigt folkhälsoproblem i många länder världen över 1,2. Trots att vara känd som en smittsam sjukdom som drabbar både hud och perifera nerver, finns det fortfarande flera brister i kunskap om de mekanismer som är involverade i den komplexa immunpatogenes av sjukdomen.

Bland de utmanande egenskaper M. leprae som hindrar sin studie är dess oförmåga att växa i artificiell odlingsmedia och dess relativt långa fördubbling tid (ca 14 dagar) 3,4. De flesta experimentella procedurer som använder M. leprae sätts upp med baciller renade från hudskador av spetälska patienter eller från experimentella djurmodeller, såsom bältdjur och flera stammar av möss 5,6.

Under många år har forskare beroende rening av M. leprae från hudskador av multibacillary leprOSY patienter för användning i experimentella procedurer. Flera laboratorieförhållanden för odling in vitro eller underhåll av levande M. leprae har försökts, men till dags dato har djurmodeller visat sig vara mest lämplig för forskningsändamål. Under 1960 och 1970, forskare började använda möss och bältdjur för kartläggning och bedömning av M. leprae viabilitet, övervaka bakterietillväxt som svar på anti-M. leprae droger, och i tillväxten och underhållet av mykobakteriestammar 2,4.

I djurmodeller har vissa begränsningar, särskilt i bältdjur och icke-mänskliga primater, däribland etiska frågor, kostnader för underhåll, särskild infrastruktur som behövs för djurens underhåll och dålig reproducerbarhet av resultat och slut avkastning. För närvarande, möss är den föredragna modellen djur för spetälska forskning. Laboratorie villkoren för att använda möss är lätt tillgängliga, lätta att utföra, och möjliggöra standardiserade protokoll M. leprae stammar eftersom, även med låga viabla bacillär belastningar leder den T-cell-deficient immunsvar på översvallande granulombildning och god bacillär multiplikation. Således har denna djurmodell vunnit bred acceptans inom spetälska forskarsamhället.

I denna rapport beskriver vi ett enkelt protokoll för enzymatisk rening av baciller från naken mus trampdynorna, avsedd för framställning av en M. leprae fjädring med minimal cellfragment och med hög bakteriell viabilitet. Viabiliteten bestäms genom fluorescerande mikroskopi, som snabbt kan utföras i laboratoriet. Vi visar också en ändring av standardmetod för bacillär räkning av kall Ziehl-Neelsen färgning och ljusmikroskop. Dessutom presenterar vi ett alternativt protokoll för underhåll och förvaring av M. leprae stammar, så att frysning och upptining av bacillär stocks.

Protocol

1. Beredning av Mycobacterium leprae Suspension

  1. Innan euthanizing den atymiska nakna musen (NU-Foxn1 nu), förbereda trypsin lösningen och odlingsmedia (Protokollet av reagenserna - Protokollen 1, 2, och 3). Euthanize nakna möss 4-5 månader efter inokulering med M. leprae enligt AVMA Riktlinjer för eutanasi av djur: 2013 Edition 10 (experiment och användning av bilder av djur godkändes och genomfördes i enlighet med riktlinjerna i Animal Care kommitté Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). Inne i ett biologiskt säkerhetsskåp som används för hantering av djur, rengöra hela musen med 70% etanol alkohol.
  2. Håll den bakre tassen med hjälp hemostatiska pincett distala till den böjd gemensamt. Skär tassen av med sax nedan tången och sänk ned tass i 2% jod i 20 min. Sedan upprepar du proceduren för den andra bakre tassen.
  3. Överför tassar till enrent biologiskt säkerhetsskåp för det fortsatta arbetet. Ta tassar ut i 2% jod, torka dem med steril gasbinda och sedan hämta de två trampdynorna med hjälp av nummer 22 eller 23 skalpell blad, ta bort alla mjukdelar (dermis, epidermis, senor och nerver) nära benet. Ta bort metatarsalbenen ben och den 1: a och 5: e falanger. Placera materialet i en steril petriskål och avlägsna epidermis, genom att skrapa bort det med skalpellblad. Skär vävnaden i små bitar med sax och överföra dem till en rundbottnad röret. Vikt vävnaden och tillsätt 1 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Håll röret på is för att undvika uppvärmning av provet.
  4. Lägg ytterligare 1 ml HBSS och homogenisera provet med en vävnadshomogenisator.
    1. Första homogenisering cykel: 3 pulser av 15 sek vid hastighet 4 (14.450 rpm).
    2. Överför supernatanten till ett sterilt 50 ml koniskt rör, passerar den genom ett cellfilter för att eliminera den kvarvarande skräp. Låt lösningen passera genom gravitet.
    3. Lägg till ytterligare 2 ml HBSS och upprepa homogenisering cykel (avsnitt 1.4.1), och passerar proverna genom cell sil igen.
    4. Skölj silen genom att lägga HBSS att bringa volymen till 9 ml. Kassera cell sil.
  5. Tina en alikvot av 0,5% trypsin-lösning. Tillsätt 1 ml trypsin till 9 ml av cellsuspensionen för att erhålla en slutlig koncentration 0,05% trypsin. Kassera återstående tinade trypsin. Inkubera i 60 minuter i ett 37 ° C vattenbad. Efter inkubation, ta upp volymen till 40 ml genom tillsats av steril koksaltlösning för att späda ut trypsin.
  6. Centrifugera vid 1700 x g under 30 min vid 4 ° C.
  7. Kasta bort supernatanten genom att försiktigt vända röret. Resuspendera pelleten genom att knacka på röret och tillsätt sedan 1 ml steril saltlösning. Överför suspensionen i ett annat koniskt rör mäta den slutliga volymen av suspensionen (för att beräkna utbytet / gram vävnad).
  8. Homogenisera bacillär suspensionen med 1 mspruta l insulin med en 26 G nål samtidigt överföra suspensionen till ett nytt rör.
  9. Utför mikrobiologisk kontroll av suspensionen genom att placera två droppar (50 ul) av det i varje medium: 7H9 och Lowenstein-Jensen-medium och inkubera vid 37 ° C under 30 dagar, för detektion av kontaminerande mykobakterier. Likaså ympa ett medium Brain Heart Infusion (BHI) och inkubera under 24 h vid 37 ° C, för detektion av kontaminerande aeroba bakterier.
  10. Alikvotera suspensionen i rör för färgning: 35 ul för Cold Ziehl-Neelsen färgning (protokoll 2), och 200 ul för viabilitet (protokoll 3).
  11. Efter Ziehl-Neelsen färgning (ZN), beräkna antalet syrafasta stavar / ml (AFB / ml). För nakna möss ympning, förbereda en 1 x 10 8 AFB / ml suspension, se till att ha tillräckligt med volym för att ympa 30 l / trampdynan / djur (protokoll 5), och hålla suspensionen kallt tills ympning. För frysning, förbereda en 1 x 10 7 AFB / ml suspension (protokoll 4).

2. Kall Ziehl-Neelsen färgning

  1. Innan färgningen, förbereda serum / fenollösning och ZN färgningslösningar (Protokoll av reagenserna - protokoll 4 och 5). Rita tre cirklar (inre diameter 10 mm) på tre glasskivor med hjälp av en immunohistokemi penna. Identifiera glasen: (1) normal eller outspädda, (2) 01:10, och (3) 1:100 med hjälp av ett antal 2 penna (Obs: vissa grafit bleknar bort efter ZN färgning).
  2. Späd bacillär fjädring (steg 1.10) till 1:10 och 1:100 spädningar, dvs tillsätt 5 ìl av outspädd fjädring och 45 l av koksaltlösning, sedan ta 5 pl 01:10 och tillsätt 45 l av koksaltlösning.
  3. Tillsätt 5 pl av serum / fenollösning och 10 pl bakteriell suspension per cirkel. Homogenisera och fördela det jämnt runt det område av den cirkel med handtaget av en engångs-slinga. Vänta tills suspensionen att torka på en planade bord.
  4. Efter dRying, fixa smeta genom att sliden 3 gånger över det blå låga i en bunsenbrännare (ca 20 sek totalt) 11.
  5. För färgning täcka hela ytan av objektglaset med filtrerad Ziehl-Neelsen carbofuchsine (cirka 5 ml) under 20 min.
  6. Skölj objektglaset i rinnande vatten (långsamt flöde).
  7. Täck objektglaset med en 10% syra alkohollösning under ca 20 sek.
  8. Tvätta bilden igen i rinnande vatten.
  9. Täck objektglaset med en lösning av metylenblått under 5 min.
  10. Skölj objektglaset i rinnande vatten och låt den torka i rumstemperatur.
  11. Räkna 20 fält / cirkel (totalt 60 fält / bild) med hjälp av en 100X oljeimmersionsobjektiv. Beräkningen av syrafasta stavar / ml (AFB / ml) görs på följande sätt, enligt beskrivningen i Laboratory Tekniker för Spetälska 12:
    AFB / fält = totalt antal baciller som finns i de tre cirklarna (60 fält) dividerat med 60.
    AFB / ml = AFB / fält x konstant (område av cirkelnx 100 dividerat med område av objektiv bländare), och om att räkna en utspädd suspension, multiplicera antalet AFB / ml med utspädningsfaktorn (10 eller 100).

3. Viabiliteten Bestämning

  1. Innan du börjar, förbereda autoklaveras M. leprae fjädring (Protokollet av reagenserna - Protokoll 7). Använd rätt kit (se tabell av reagenser och utrustning) för kvalitativ bestämning av M. leprae livskraft i suspensionen. Späd lösningarna enligt följande (alla procedurer bör utföras under dåliga ljusförhållanden): utspädd lösning A med en faktor 10 i saltlösning (1 pl lager plus 9 pl saltlösning), utspädd lösning B 20 med en faktor i saltlösning (1 pl lager plus 19 ^ il saltlösning).
  2. Lägg till 3.6 l av utspädd lösning A och 6 pl av utspädd lösning B till 200 l av den bacillär fjädring som ska testas (steg 1,10). En tidigare autoklaveras M. leprae fjädring används rutinmässigt som enegative kontroll för viabilitetsfärgning.
  3. Inkubera suspensioner i 15 min vid rumstemperatur i mörker.
  4. Centrifugera röret vid 10.600 xg under 5 min vid 4 ° C.
  5. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 15 pl av 10% glycerol. Applicera 8 pl till ytan av ett rent objektglas och täck den med en liten täckglas. Analysera bilden med hjälp av en fluorescerande mikroskop, som innehåller lämpliga filter (se Molecular Probes rekommendationer). Utvärdera resultaten genom att jämföra Syto 9 (Sy) färgning med propidiumjodid (PI) färgning.
    OBS: Sy fläcken tränger 100% av både döda och levande bakterier, och PI fläcken tränger bara bakterier med skadade membran. Den autoklaverade suspensionen (negativ kontroll) kan bilda klumpar av bakterier på grund av närvaron av cellrester. Den semikvantitativ skala som används för levande / döda utvärdering varierar från 0 till 2 +, 0 indikerar att mindre än 30% av cellerna är positiva för PI fläcken, 1 + innebär mellan 30 -50% av cellerna är positiva för PI fläcken; 2 + betyder mer än 50% av cellerna är positiva för PI-färgning. En poäng på 0 anses vara mest lämpliga för användning.

4. Frysning / upptining M. leprae Suspension

  1. Innan du börjar, förbereda frysmediet (Protokollet av reagenserna - Protokoll 6). För frysning bör de steg som beskrivs nedan:
    1. Tillsätt 150 | il av suspensionen innehållande 1 x 10 7 AFB / ml till en steril köldkärlet tillsammans med en ml frysmedium.
    2. Placera cryovial i en frys behållare och lagra behållaren vid -80 ° C under 24 timmar.
    3. För över den frusna flaskan till en förvaringsbox och förvaras vid -80 ° C.
  2. För upptining, använd de steg som beskrivs nedan:
    1. Avlägsna köldkärlet med den frusna suspensionen från -80 ° C och placera den i ett 37 ° C vattenbad för att starta upptining av suspensionen.
    2. Häll suspensionen i ett rör innehållande 20 ml steriltsaltlösning. Blanda suspensionen försiktigt tills upptining är klar.
    3. Centrifugera suspensionen under 30 min vid 1700 xg vid 4 ° C.
    4. Kasta bort supernatanten och tillsätt tillräckligt med steril koksaltlösning för att uppnå önskad volym. Homogeni suspensionen genom att låta den passera genom en spruta (steg 1,8).
    5. För ZN färgning, viabilitet och ympning, följer protokoll 2, 3 och 5.

5. Mus Inokulering

  1. Två personer behövs för detta förfarande, för att man hålla musen och en annan för att administrera ympen. De djur som skall ympas ska hanteras enligt etiska riktlinjer och bestämmelser och alla förfaranden ska godkännas av den institutionella Animal Care och användning kommittén. Hindra den nakna musen genom nackskinnet med tassarna uppåt.
  2. Homogeni suspensionen genom att låta den passera genom en 26 G-nål. Med en 1 ml spruta, aspirera tillräckligt bacillär suspensionen till inokulatte två fotplattor (30 l / trampdynan).
  3. Håll den bakre tassen, rengör trampdynan med 70% etanol alkohol före injektion och införa nålen intradermalt med avfasning av nålen riktad uppåt, från den proximala till den distala sidan av trampdynan. Injicera 30 ìl av suspensionen. Fotsulan injektioner kan utföras i sövda möss.
  4. Vänta 5 sekunder innan nålen dras ut från huden för att förhindra återflöde av ympen. Möss bör hållas på mjuka sängar efter inokulering, och bör övervakas förflyttningar och tecken på självstympning.

Representative Results

Framgången av protokollet kan bedömas på tre sätt. För det första är utvärdering av kvaliteten av ympen bestäms av mängden av cellrester och den erhållna andelen livskraftiga bakterier i den slutliga suspensionen (Se protokoll 3). Såsom visas i figurerna 1 och 2, den sista bacillär suspensionen innehöll mycket lite celldebris och hög viabilitet (poäng 0 +); notera att de flesta baciller färgades med Syto 9 grönt fluorescerande fläck (fläck penetrerar 100% av både döda och levande bakterier, Figur 1) och endast några baciller färgas med den röda PI fluorescerande fläck (fläck tränger bara bakterier med skadade membran, figur 2).

Figur 1
Figur 1. Syto 9 färgning av M.leprae fjädring. Grön fluorescens visar förekomsten av levande och döda M. leprae. 400X.

Figur 2
Figur 2. PI färgning av M. leprae fjädring. Red fluorescens visar det lilla antalet döda M. leprae. 400X.

För det andra kommer ett inokulat med hög viabilitet påverka förökningen av baciller i trampdynorna hos djur efter 4-5 månader efter inokulering, med utveckling av uppenbar makroskopisk lesion, såsom visas i videon (protokoll 1). Det tredje sättet att bedöma framgången med protokollet är genom att utvärdera överlevnad och förökning av AFB i mus trampdynorna inokulerade med baciller som hade frysts under olika perioder (se protokoll nr 4).

"Cellspacing =" 0 "> Experiment (djur) Antal AFB / ml frusen vid dag 0 Bärkraft poäng / dag 0 Frysning period (dagar) Antal AFB inokulerades efter frysning Livskraft poäng efter frysning Antal AFB / ml återvunnits efter 7 månader 1 (1) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 2,3 x 10 8 1 (2) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 3,8 x 10 7 1 (3) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 8,5 x 10 7 1 (4) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 <td> 1 + 4,6 x 10 7 2 (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 1,7 x 10 7 2 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 4,8 x 10 6 2 (3) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 8,6 x 10 6 3 (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,2 x 10 7 3 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (3) 1,0 x 10 7 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (4) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 2,6 x 10 7 3 (5) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 3,7 x 10 6

Tabell 1. Resultat av M. leprae multiplikation med hjälp av post frysning upphävanden.

Tabell 1 visar resultaten av M. leprae tillväxt med hjälp av upphävanden efter frysning. Den livskraft poäng av upphängning efter upptining var 1 +. Frysning protokoll utfördes i tre oberoende experiment för att testa olika frysperioder. I båda experimenten med inokulat fryst i 15 eller 60 dagar, resultatet var liknande, propagation efter frysning gav 10-1000 gånger ökning av antalet AFB återhämtat sig från varje trampdyna efter 7 månader av ympning (tabell 1). Därför frysning av M. leprae suspensioner i 7H9 medium med tillsats OADC (oljesyra-albumin-dextros-katalas) resulterade i underhåll av livskraft.

Tre inokulat användes för att utvärdera M. leprae multiplikation efter två olika frysperioder (15 och 60 dagar). Efter 7 månader, var baciller återhämtat sig från trampdynor inokulerade möss och räknades efter Ziehl-Neelsen färgning. Semikvantitativ viabilitet skala: 0 medel frånvarande upp till 30% av PI-färgade celler; 1 + betyder mellan 30 till 50% av PI-färgade celler; 2 + innebär framför 50% av PI-färgade celler. AFB: syrafasta stavar.

Discussion

En detaljerad beskrivning av en väl illustrerad, framgångsrik protokoll för förökning av M. är stort behov leprae. Vår studie visar att protokollet av inokulat förberedelse genom filtrering och trypsin matsmältning gör att inokulat som skall uppnås med mycket liten cellrester och med hög lönsamhet för baciller (poäng 0 +). Natriumhydroxid har använts för att dela upp den vävnad för rening av baciller 6. Studier utförda i vårt laboratorium med hjälp av natriumhydroxid för rening av M. leprae resulterade i bildning av klumpar av baciller, vilket bromsar homogenisering av suspensionen för viabilitet och djur ympning (data visas ej).

Potentiella problem med inokulat förberedelse genom filtrering och trypsin matsmältningen inkluderar stor mängd cellrester och förorening av inokulat med bakterie-eller svampmedel. I händelse av stora mängder cellulärt DEBRär observeras efter rening, antingen trypsin är inte längre aktiv eller om det finns en överdriven mängd biologiskt material. Enzymatisk aktivitet av trypsin stamlösning måste utvärderas. Vid misstanke om överdriven mängd inledande biologiskt material, skall det material som delas upp i portioner och protokollet bör ske i omgångar. För att undvika kontaminering av inokulat med bakterie-eller svampmedel, måste man för att bearbeta materialet under aseptiska förhållanden. Om svamp-och / eller bakteriell kontamination upptäcks suspensionen kasseras.

En begränsning av våra protokoll är den subjektiva utvärderingen viabilitet med användning av den beskrivna semi-kvantitativ metod. Livskraft bedömas halv kvantitativt är mer praktiskt, men mindre exakt än den publicerade kvantitativ metod 6. Viabilitet poäng av 0 + och 1 + är tillfredsställande för underhåll av förökning och frysning avM. leprae. Lahiri et al. har redan visat att nakna möss inokulerade med 80 till 90% viabla inokulum, resultera i trampdynorna som är lämpliga för att skörda (hög viabilitet baciller) vid 4-5 månader efter inokulation. Därför är det bästa skörden tidig infektion (ca 4 månader). För skörd av frysta inokulat, mössen i det nuvarande protokollet bibehålls ympade under längre perioder (7 månader) för att garantera tillväxtkurvor. Ett kritiskt steg för att säkerställa tillräcklig lönsamhet är användningen av färska baciller suspensioner, helst inom 24 timmar efter insamling av biologiskt material från värden och bearbetning. Dessutom är kvaliteten på de reagenser, nylagade utspädda trypsin och viabilitetsfärgning lösningar, är nödvändiga för att säkerställa reproducerbara resultat.

En annan begränsning med detta protokoll är att det slutliga M. leprae fjädring är inte fri från värd DNA, RNA, protein, osv. Därför måste andra reningssteg läggas to få en M. leprae fjädring utan värdkomponenter cell.

En metod för att upprätthålla livskraftiga baciller genom att frysa hela vävnadsprover av M. leprae skador har rapporterats 9. Men studien av Portaels et al. visade betydande förlust av livskraft, som sträcker sig mellan 65-97% efter frysning och upptining av M. leprae infekterade vävnadsprover erhållna från bältdjur 9. Vår protokoll visade att lönsamheten index observerats i M. leprae suspensioner efter frysning och upptining sjunkit jämfört med den alikvot som inte hade varit fruset (Tabell 1). Faktum är att frysa M. leprae suspension i frysmediet gav viabilitet som sträcker sig från 50-70%, med viabilitet betyget 1 +, medan viabilitet Poäng 0 + erhölls i den ofrysta suspensionen. Ändå förökningen av M. leprae var tillfredsställande efter 7 månader efter ympning av nakna möss ( M. leprae suspension i frysning media, istället för infekterade vävnadsprover, är effektivare. Ett kritiskt steg i våra protokoll är den långsamma frysningen av AFB i en frysbehållare, nödvändigt för att upprätthålla baciller livskraftig, vilket framgår av Colston och Hilson 8. Framtida experiment kommer att genomföras för att bedöma lönsamheten för baciller efter längre frysningsperioder.

I sammanfattning, eftersom M. leprae växer inte in vitro, gör våra protokoll för ett snabbt och enkelt alternativ för underhåll av livskraftiga inokulat, och den framgångsrika fryssteget möjliggör underhåll av stammar utan kontinuerlig passage i djur, vilket gör det möjligt att inrätta en bank av definierade stammar.

Det här avsnittet innehåller anvisningar för att förbereda reagenser för att utföra detta protokoll.

1. Trypsin

Trypsin 0,5 g
Destillerat vatten upp till 100 ml

Filter sterilisera. Förvara vid -20 ° C.

2. 7H9

7H9 buljong bas 4,7 g
40% glycerol lager 5 ml
Destillerat vatten upp till 900 ml

Blanda bas med vatten, sedan tillsätt glycerol under omröring. Autoklavera vid 121 ° C under 20 min för att sterilisera. Förvaras vid 4 ° C.

3. Brain Heart Infusion (BHI)

BHI 37 g
Destillerat vatten upp till 1000 ml

Autoklavera vid 121 ° C under 15 min för att sterilisera. Förvaras vid 4 ° C.

4. Fenol serum

4.1) 5% fenol

Fenol 5 ml
Destillerat vatten upp till 100 ml

4.2) Serum fenol

fetalt bovint serum 2 ml
5% fenol 98 ml

Förvaras vid 4 ° C.

5. Lösningar för kall Ziehl-Neelsen Stain

5,1) CarboFuchsin

Fuchsin 1 g
Fenol kristaller fuserad till 60 ° C 5 ml
Ren etylalkohol 10 ml
Destillerat vatten upp till 100 ml

Filtrera före varje användning.

5.2) metylenblått Base

Methylene Blue 3 g
95% etylalkohol upp till 200 ml

5.3) Alkohol acid

70% alkohol 990 ml
chloridric syra 10 ml

6. Medium för frysning:

OADC 10 ml
Glycerol 20 ml
7H9-medium upp till 100 ml

Autoklav glycerol före användning och sterilisera OADC genom filtrering.

7. Autoklaverad M. leprae suspension

Autoklavera vid 121 ° C under 20 min. Förvara vid -20 ° C.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro och Claudia PM Carvalho för tekniskt stöd. Vi tackar Pranab K. Das för att stödja inrättandet av djuranläggningen. Vi tackar Lais RR Costa för ändring av manuskriptet. Denna studie har finansierats med bidrag från Fundação Paulista contra Hanseníase och Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BacLight Bacterial Viability Kit Invitrogen; Molecular Probes L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9269
Cryo 1 °C Freezing Container Nalgene 5100001
Lowenstein-Jensen medium LB Laborclin 901122
Saline TEK Nova Inc S5812
Pen Dako S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base TPP 91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon BD Falcon 352340
Trypsin Sigma T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base Sigma-Aldrich M0178 Fluka
Glycerol Gibco BRL 15514011
Brain heart infusion (BHI) Oxoid LTDA CM1135
Fuchsin Merck Millipore 1159370025
Phenol  Invitrogen 15509037
Ethyl alcohol Merck Millipore EX02764
Cloridric acid Merck 1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) Becton Dickinson 211886
Fetal bovine serum Gibco; LifeTechnologies 26140079

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saúde, M. inistérioda, Brasil, Secretaria de Vigilância em Saúde: situação epidemiológica da hanseníase no Brasil. Informe epidemiológico 2008. Forthcoming.
  2. Scollard, D. M., Adams, L. B., Gillis, T. P., Krahenbuhl, J. L., Truman, R. W., Williams, D. L. The continuing challenges of leprosy. Clin. Microbiol. Rev. 19, (2), 338-381 (2006).
  3. Rosa, P. S., Belone, A. deF., Lauris, J. R., Soares, C. T. Fine-needle aspiration may replace skin biopsy for the collection of material for experimental infection of mice with Mycobacterium leprae and Lacazia loboi. Int. J. Infect. Dis. 14, 49-53 (2010).
  4. Truman, R. W., Krahenbuhl, J. L. V. iableM. leprae as a research reagent. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 69, (1), 1-12 (2001).
  5. Levy, L., Ji, B. The mouse foot-pad technique for cultivation of Mycobacterium leprae. Lepr. Rev. 77, (1), 5-24 (2006).
  6. Lahiri, R., Randhawa, B., Krahenbuhl, J. Application of a viability-staining method for Mycobacterium leprae derived from the athymic (nu/nu) mouse foot pad. J. Med. Microbiol. 54, (3), 235-242 (2005).
  7. Katoch, V. M. The contemporary relevance of the mouse foot pad model for cultivating. 80, (2), 2-120 (2009).
  8. Colston, M. J., Hilson, G. R. The effect of freezing and storage in liquid nitrogen on the viability and growth of Mycobacterium leprae. J. Med. Microbiol. 12, (1), 1-137 (1979).
  9. Portaels, F., Fissette, K., De Ridder, K., Macedo, P. M., De Muynck, A., Silva, M. T. Effects of freezing and thawing on the viability and the ultrastructure of in vivo grown mycobacteria. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 56, (4), 580-587 (1988).
  10. American Veterinary Medical Association. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. Edition. Schaumburg, Illinois, USA, https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf. 1-102 (2013).
  11. Saúde, M. inistérioda, Brasil, Guia de procedimentos técnicos - Baciloscopia em hanseníase, Série A: Normas e manuais técnicos. (2010).
  12. Health Organization, W. orld, Geneva, Laboratory techniques for leprosy Forthcoming.
Optimerade protokoll för<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Draghantering: Fryst Stock Bevarande och underhåll i atymiska nakna möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).More

Trombone, A. P. F., Pedrini, S. C. B., Diório, S. M., Belone, A. d. F. F., Fachin, L. R. V., do Nascimento, D. C., Rosa, P. S. Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice. J. Vis. Exp. (85), e50620, doi:10.3791/50620 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter