המעבדה שלנו פיתחה מערכת שהיא שימושית לצורך זיהוי של כמה התנהגויות שונות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה רומן. המערכת יכולה לשמש לאיתור שינויים עדינים בהתנהגות לאחר הזחלים שנחשפו לרעלים או תרופות סביבתיים.
יצרנו מערכת הדמיה תפוקה גבוהה חדשנית לניתוח התנהגות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת בצלחות רב נתיבים. מערכת זו מודדת התנהגויות ספונטניות והתגובה לגירוי מרתיע, אשר מוצגת לזחלים באמצעות מצגת PowerPoint. את התמונות שתועדו מנותחות עם מאקרו ImageJ, אשר באופן אוטומטי מחלק את ערוצי הצבע, מחסיר את הרקע, וחל סף לזהות מיקום זחלים בודד בסמטאות. אז אנחנו יכולים לייבא את הקואורדינטות לגיליון Excel לכמת מהירות השחייה, העדפה לקצה או בצד של הנתיב, התנהגות מנוחה, thigmotaxis, מרחק בין זחלים, והתנהגות הימנעות. שינויים קלים בהתנהגות מזוהים בקלות באמצעות המערכת שלנו, מה שהופך אותו לשימושי עבור ניתוחים התנהגותיות לאחר חשיפה לרעלים או תרופות סביבתיים.
דג הזברה הופכת מודל פופולרי למדעים גנטיים, התפתחותי והתנהגותי 1-4. הם בוקעים מchorions על ידי לאחר הפריה ימים 2-3 (DPF), לפתח באופן מלא על ידי איברים מתפקדים DPF 4-5, ולהציג מספר גדול של התנהגויות של 7 DPF 5,6. זחלי דג הזברה מתאימים בצורה אידיאלית לניתוחי תפוקה גבוהה בגלל הגודל הקטן שלהם 7,8. תוכנה זמינה מסחרי עבור ניתוחים אוטומטיים של התנהגות בדג זברת הזחל ומבוגר 9-14. עם זאת, תוכנה זו יכולה להיות יקרה ויש לו אפשרויות מוגבלות למדידת התנהגויות מורכבות של זחלי דג הזברה בצלחות רב כן.
יצרנו מערכת הדמיה תפוקה גבוהה רומן שהיא זול להקמה ויכול לכמת את מספר ההתנהגויות שונות ב7 זחלי דג הזברה DPF 15,16. המערכת מאפשרת לנו לבחון במהירות וביעילות הפרעות התנהגותיות עדינות לאחר חשיפה עוברית למספרתרופות וtoxicants סביבתי 16-18.
המערכת נבנתה באמצעות ארונות מעץ, שבית מצלמה דיגיטלית בחלק העליון של הארון. המצלמה פונה כלפי מטה אל החלק התחתון של הארון שבו מחשב נייד ממוקם עם המסך כלפי מעלה 15. זמן לשגות הדמיה משמשת כדי ללכוד את המיקום של הזחלים בסמטאות. זחלים יכולים להיות שוכנו בעד ארבע צלחות רבת או רב גם מסלולים אשר ממוקמות על גבי מסך המחשב הנייד. אנו משתמשים במצגת PowerPoint כגירוי מרתיע כדי שהזחלים להגיב על ידי מתרחק (הימנעות) ושוחה לכיוון הקצה (thigmotaxis) 15,17. את התמונות מיובאות לImageJ הבמשמש מאקרו אוטומטי לפצל את ערוצי הצבע, לחסר רקע, ולהחיל את סף לזהות זחלי פרט. קואורדינטות רשומות לכל זחל בכל תמונה ויכולות להיות מוכנסת לתוך קובץ Excel שבו אנו משתמשים כדי לכמת והימנעות thigmotaהתנהגות xis, דגים למרחק דגים, לשחות במהירות, וסכום של מנוחה 16.
בעוד אנו שיפור assay התנהגותי הרומן שלנו ללא הרף, זה תמיד היה שימושי לזיהוי של הימנעות והתנהגות thigmotaxis בזחלי דג הזברה 15. ניסויים רבים בוצעו כדי לייעל את התוצאות של assay, כגון צבע של גירוי בשימוש, מספר האידיאלי של זחלים לכל נתיב, ואורך של assay התנהגותית. בעבר, השתמשנו בצלחות רב היטב (עם 6 או 12 בארות) 15,17,18. עם זאת, לאחרונה יצרנו את תבנית נתיב הרומן ליצור מרחב שחייה גדול יותר לזחלים ומאפשרים לנו לאסוף מספר גדול יותר של אמצעים התנהגותיים בassay אחת 16 (איור 5). שינויים נוספים כוללים וריאציות של שהעל"ל המוצג PowerPoint (תנועה או אורך שונים של assay) ואת הגודל של הנתיבים בשימוש (יש לנו גם תבניות לסמטאות צרות יותר).
נכון לעכשיו, מערכת האוטומטית של תפוקה גבוהה זה היא ייחודית ביכולתו למדוד מגוון רחב של התנהגויות בzebrזחלי afish באותו הזמן, כגון מהירות, הימנעות, קרבה לזחלים אחרים, וthigmotaxis בצלחות רב נתיבים. ניתן להשיג תוצאות במהירות ובמספר גדול של זחלים ניתן לנתח בזמן ההדמיה. המערכת היא גם זולה לבנות ומהירה וקלה להתקנה. מגבלה של שיטה זו היא שלא ניתן להעריך את תנועות 3-D בזחלי דג הזברה. מערכות אוטומטיות העוקבות אחר דג הזברה מבוגר שיש לו את יכולת 3-D וניתן לזהות מגוון רחב יותר של התנהגויות כגון תנועה למעלה או למטה בעמודת המים 10,19. מגבלה נוספת היא שמערכת ההדמיה שלנו כיום אינה מותאמת לניתוחי תפוקה גבוהה במהירות וידאו. ההדמיה מהירות וידאו אפשרית בעת הגדרת המצלמה לרזולוציה נמוכה יותר 15, אבל זה מגביל את הניתוח לצלחת אחת.
בשימוש בשיטה חדש שנוצרה "הנתיב", כמה חלקים של assay צריכים להיות מוצאים להורג באופן מדויק. כאשר מניחים את הזחלים בtהוא נתיבים, זה הוא קריטי כדי לוודא את רמת הנוזל היא מאוד רדודה עד שהצלחות ממוקמות על גבי מסך המחשב הנייד. אם הנתיבים מלאים מדי של נוזל, הזחלים יהיו להימלט אל שולי הצלחת. בנוסף, בעת הכנסת התבנית לתוך agarose, יש להקפיד להוריד את התבנית באיטיות רבה. אם העובש מוכנס במהירות רבה מדי, בועות יהוו בagarose ותזוהינה על ידי מאקרו J התמונה כזחלים נוספים. מומלץ כי אם יש לי נתיבי agarose אפילו כמה בועות, עדיף לעשות חדשות.
בעתיד, ברצוננו לייעל את assay ההתנהגות שלנו לנתח התנהגויות אחרות מורכבות כגון למידה בזחלי דג הזברה ולבחון כיצד למידה יכולה להיות מושפעת מחשיפה לרעלים ותרופות בשלבי פיתוח מוקדם. אנחנו עובדים כרגע על מבחני שעשויות להיות שימושית לניתוח התנהגות למידה בה את התוצאות התנהגותיות עשויות להקל על קביעה אילו אזורים במוח הםמושפע toxicants או תרופות מסוימים במהלך פיתוח. מבחני אוטומטיים פותחו למדידת למידת התנהגויות בדג זברת זחלים 20 ומבחנים אלה עשויים להיות amendable להקרנת תפוקה גבוהה על ידי שימוש בתגובת ההימנעות החזקה בצלחות רב נתיבים.
אנו מציעים כי התנהגות assay זה יכול לשמש במחקרים עתידיים לבדיקת ההשפעות התפתחותיות של מספר רב של תרופות וtoxicants. מחקרים מסוג זה מספקים שפע של מידע על גורמי סיכון ספציפיים ולתרום לקביעת הנחיות בטיחות ובריאות טובות יותר לנשים בהריון וילדים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים שון Pelkowski לסיוע באופטימיזציה של assay התנהגותית. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם, R01 HD060647 והמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, F32 ES021342 וR03 ES017755.
Reagent | |||
Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
Equipment | |||
One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
Camera Lens | Canon | EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens | |
Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
Software | |||
PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Excel 2010 | Microsoft | ||
Statistical software | SPSS 20 |