Summary
Nuestro laboratorio ha desarrollado un sistema automatizado de imágenes de alto rendimiento novedoso que es útil para la detección de varios comportamientos diferentes en-7 días de edad, las larvas de pez cebra. El sistema se puede utilizar para detectar cambios sutiles en el comportamiento después de las larvas han sido expuestos a sustancias tóxicas ambientales o productos farmacéuticos.
Abstract
Hemos creado un sistema de imágenes de alto rendimiento novedoso para el análisis del comportamiento de 7 días de edad, las larvas de pez cebra en placas de varios carriles. Este sistema mide los comportamientos espontáneos y la respuesta a un estímulo aversivo, que se muestra a las larvas a través de una presentación de PowerPoint. Las imágenes grabadas se analizaron con una macro ImageJ, que divide automáticamente los canales de color, resta el fondo, y se aplica un umbral para identificar la colocación de larvas individuales en los carriles. A continuación, puede importar las coordenadas en una hoja de Excel para cuantificar la velocidad de nado, la preferencia por el borde o en el lado de la calle, el comportamiento descansando, thigmotaxis, la distancia entre la larva y la conducta de evitación. Los cambios sutiles en el comportamiento se detectan fácilmente con nuestro sistema, por lo que es útil para el análisis del comportamiento después de la exposición a los tóxicos ambientales o productos farmacéuticos.
Introduction
El pez cebra se están convirtiendo en un modelo popular para las ciencias genéticas, de desarrollo y de conducta 1-4. Ellos salen de sus chorions en 2-3 días después de la fertilización (dpf), desarrollar plenamente órganos funcionen por 4-5 dpf, y presentan un gran número de comportamientos de 7 dpf 5,6. Larvas de pez cebra son ideales para análisis de alto rendimiento debido a su pequeño tamaño 7,8. El software está disponible comercialmente para los análisis automatizados de comportamiento en larvas y adultos de pez cebra 9-14. Sin embargo, este software puede ser caro y tiene opciones limitadas para la medición de comportamientos complejos de larvas de pez cebra en placas de múltiples pocillos.
Hemos creado un sistema de imágenes de alto rendimiento de la novela que es barato de instalar y se puede cuantificar una serie de comportamientos en 7 dpf larvas de pez cebra 15,16. El sistema nos permite comprobar de forma rápida y eficiente las anomalías sutiles de comportamiento después de la exposición de embriones a un número deproductos farmacéuticos y sustancias tóxicas ambientales 16-18.
El sistema fue construido con gabinetes de madera, que albergan una cámara digital en la parte superior del gabinete. La cámara mira hacia abajo a la parte inferior de la caja donde se coloca un ordenador portátil con la pantalla hacia arriba 15. Lapso de tiempo de imágenes se utiliza para capturar la colocación de las larvas en los carriles. Las larvas pueden ser alojados en un máximo de cuatro placas de múltiples pocillos o varios carriles que se colocan en la parte superior de la pantalla del portátil. Utilizamos una presentación de PowerPoint como un estímulo aversivo a los que las larvas responden al alejarse (evitación) y nadar hacia el borde (thigmotaxis) 15,17. Las imágenes se importan en ImageJ en el que una macro automatizado se utiliza para dividir los canales de color, restar el fondo, y aplicar un umbral para identificar larvas individuales. Las coordenadas se enumeran para cada larva en cada imagen y se pueden insertar en un archivo de Excel que se utiliza para cuantificar la evitación y thigmotaxis comportamiento, pescado a la distancia los peces, la velocidad y cantidad de descanso 16 de nadar.
Protocol
1. Recolección de embriones de pez cebra y provocar larvas
- Pyrex platos de cristal con hierba "falso" (realizado en lana verde) (Figura 1) se deben insertar en los tanques en la madrugada y se dejan en durante dos horas con el fin de recoger los embriones de pez cebra. Los platos de vidrio que contienen los embriones se vierte sobre un tamiz de mano y se aclararon con agua desionizada. Los embriones se deben cultivarse en agua huevo. El agua de huevo contiene 60 mg / L de Instant Ocean en agua desionizada y 0,25 mg / l de azul de metileno, que se utiliza como un inhibidor de moho.
- Dependiendo de la hipótesis del experimento individual, los embriones pueden ser tratadas inmediatamente o durante etapas específicas de desarrollo utilizando sustancias tóxicas o productos farmacéuticos. Las sustancias tóxicas y productos farmacéuticos se disuelven habitualmente en DMSO (a una concentración de 1000 X) y se deben diluir aún más directamente en el medio de agua de huevo.
- Durante el tratamiento de embriones y larvas con productos farmacéuticos o sustancias tóxicass, las larvas y embriones puede ser alojado en platos Petri profundas a una densidad de alrededor de 50 a 60 larvas por cada 50 ml hasta los análisis de comportamiento en 7 dpf (solución del agua del huevo se debe cambiar por lo menos cada dos días para evitar el crecimiento de hongos / bacterias a partir de embriones muertos).
2. Preparación de los moldes de Análisis del comportamiento
- Especialmente desarrollado moldes de plástico que miden 11,7 cm x 7,6 cm x 5 mm se construyó por encargo de la casa. Se necesitan los moldes para crear carriles utilizando agarosa que se vierte en placas de plástico así individuales de Thermo Scientific. El único pozo medida placas 12,4 cm x 8,1 cm x 1,2 cm.
- Los moldes contienen cinco carriles en la que los lados están inclinados en 60 °. Los carriles en los moldes son de 3,5 mm de alto con una base de 18 mm en la parte superior, que es la más amplia, mientras que la anchura del fondo es de 14 mm. Hay una brecha de 4 mm entre los carriles en el molde (Figura 2).
- Para preparar los carriles vierten 50 ml de agarosa fundida (0,8% de agarosa en desionizard agua con 60 mg / L Instant Ocean) en una sola placa así. El molde entonces se debe colocar muy lentamente en la parte superior de la agarosa líquido para eliminar cualquier formación de burbujas y se puede quitar cuando la agarosa se haya enfriado (que tarda aproximadamente 45 min).
- Los carriles de agarosa deben hacerse no antes de un día antes del experimento conductual se va a ejecutar (para evitar la agarosa seque) Las pistas se pueden almacenar a temperatura ambiente con las tapas de los platos para un máximo de aproximadamente 36 horas. Los carriles de agarosa se deben utilizar solamente para un experimento y luego deben ser desechados.
3. Captura de imagen
- Hasta 20 larvas se colocan en cada carril de las placas. Típicamente 5 larvas por carril se utilizan para facilitar el seguimiento más exacto de la velocidad de nado y para reducir el número de larvas que se necesitan por experimento. Los carriles se pueden llenar con agua de huevo con o sin productos farmacéuticos o las sustancias tóxicas, dependiendo del experimento. Sin embargo, los carriles no deben ser filled todo el camino hasta que se colocan en los gabinetes de imagen, lo que evitará que rebose. Por razones de coherencia, las larvas debe tener un período de aclimatación de diez minutos después de que se colocan en los moldes de agarosa y se colocan en la parte superior de la pantalla del portátil. Mover eficientemente las larvas de la placa de Petri en el carril de agarosa ayudará a reducir el estrés larvas. Esto es más fácil cuando las larvas se alojan en tanques poco profundos o los platos de Petri.
- Los gabinetes de imagen incluyen una cámara digital Canon utilizada para fotografía de lapso de tiempo y un ordenador portátil. La cámara debe ser colocado en la parte superior del armario y en dirección a la parte inferior del armario, donde un ordenador portátil de pantalla 15,6 pulgadas debe colocarse con la pantalla hacia arriba (Figura 3). Cuatro placas deben colocarse a mano directamente sobre la parte superior de la pantalla del portátil. En este momento los carriles pueden ser rematado con agua huevo o tratamiento químico para que esté a nivel con la parte superior del carril (para eliminar las sombras en los bordes de la lanestesia en las imágenes).
- Una presentación de PowerPoint se utiliza como un estímulo aversivo para las larvas. En los últimos móviles bolas rojas se mostraron como las larvas de pez cebra en 6 o 12 placas de pocillos múltiples 15,17,18. El PowerPoint actual comienza con un fondo blanco en blanco durante 15 minutos, seguido de 15 minutos de una barra roja en movimiento en la mitad superior de la placa (Figura 4). A fin de eliminar las larvas de sobrecalentamiento, lo mejor es comprar un ordenador portátil con una pantalla en la que la temperatura no supera los 28 ° C. Para evitar la evaporación del líquido dentro de los carriles de agarosa, el tiempo de proyección de imagen máxima debe mantenerse a menos de una hora.
- La cámara digital debe ser programado para fotografía de lapso de tiempo, tomando fotos cada 6 segundos para un total de 300 imágenes por experimento. Sin embargo, la frecuencia y la longitud se pueden ajustar dependiendo del experimento y la cuantificación del comportamiento. En los últimos tiempos prolongados imágenes se emplearon con intervalos más largos entre cada imagen. El camera se puede programar a resolución inferior para las imágenes de vídeo a una velocidad (30 cuadros por segundo). Si bien la resolución más baja limita las grabaciones a una sola placa de múltiples pocillos, las grabaciones de vídeo son apropiados para imágenes rápidas pruebas de natación 15.
4. Análisis de Imagen
- Las imágenes deben ser abiertos con ImageJ y utilizados con una macro que fue escrito específicamente en el local. La macro divide automáticamente los canales de color para que el color rojo se puede quitar, resta el fondo, se aplica un umbral, e identifica las larvas mediante el análisis de partículas. La macro más reciente de cinco carriles análisis larval es Zebrafish_macro25k. Utilice las instrucciones en la macro para establecer el número de imágenes, color que se debe restar, el umbral de la imagen, etc
- Después de que todas las imágenes son administrados a través de la ImageJ macro, se mostrará un archivo de resultados y contendrá coordenadas x, y de las larvas individual para cada imagen junto con el número de la imagen y el número de carriles. El archivo de resultados se debe guardar en un formato Excel y ordenadas en base a fondo en blanco contra fondo barra en movimiento y luego el número también. Una plantilla de Excel debe ser usado que tiene ecuaciones construido en la que determina automáticamente la colocación de las larvas en los pozos, la distancia entre las larvas, la velocidad de movimiento y la cantidad de descanso. El modelo más reciente de Excel se crea 25ib en el laboratorio Creton, que está disponible bajo petición. Gráficos que muestran diversos grupos de tratamiento debe ser incorporado en la hoja de Excel, junto con las pruebas t para la comparación entre los grupos de tratamiento y control. Además el análisis estadístico se puede realizar con el programa SPSS.
Representative Results
En nuestros ensayos anteriores, utilizando la pelota rebotando estímulo aversivo, larvas de tipo salvaje que no están tratados responder a la pelota en movimiento al nadar en el pozo (conducta de evitación) y hacia los bordes del pozo (comportamiento thigmotaxis) 15. Se confirmó más tarde que el comportamiento thigmotaxis en este ensayo es una medida del comportamiento relacionado con la ansiedad en larvas de pez cebra 17. No hubo diferencias significativas en el movimiento de las larvas de la pelota y la preferencia por el borde, en comparación con el fondo en blanco. Estas conductas también han sido confirmados en el nuevo ensayo utilizando la barra roja en movimiento y son aún más sólida 16. Además, ahora podemos probar a un mayor número de comportamientos en un único ensayo incluyendo velocidad de nado, el descanso, la preferencia por el extremo o al lado del pozo, y la distancia entre los peces (Figura 5). Larvas de control crecido en agua de huevo muestran un aumento de preferencia a estar abajo en el plato y en el borde del carril de unespués de que se les presenta un estímulo aversivo (moviendo barra roja). Se obtienen resultados similares cuando las larvas se cultivan en agua huevo que contiene 1 mg / ml de DMSO, un disolvente que se utiliza comúnmente para disolver diversos productos farmacéuticos y sustancias tóxicas como soluciones madre 1000 X.
Los resultados representativos se muestran en la Figura 5 en las larvas tratadas con agua huevo y DMSO (como controles) y concentraciones variables de un pesticida organofosfato se encuentran comúnmente en los alimentos no orgánicos. Los resultados que se muestran son una muestra de un experimento. Sin embargo, cuando se repite, los resultados indican que la velocidad de nado y el comportamiento thigmotaxis se altera por bajas concentraciones de pesticidas organofosforados, que imitan los niveles en el consumo de alimento humano 18.
Figura 1. Bandejas de recogida. Pyrex platos de vidrio se utilizan para recoger embryos de los tanques de peces adultos. Las tapas de los platos de Pyrex se cortaron y se insertan con rejillas de plástico y hilo verde fue cosido en las rejillas en el plástico. Esto crea un ambiente de cultivo para el pez cebra adultos imitando el entorno natural.
Figura 2. Molde de plástico y los carriles de agarosa. A) El molde se muestra a la izquierda. 0,8% de agarosa se vierte en una placa de una sola así, el molde se inserta lentamente y luego se retira cuando la agarosa se haya enfriado B) La placa de la derecha muestra los carriles creados en agarosa por el molde de plástico..
Figura 3. Gabinetes de imágenes. Armarios imágenes fueron specially construido en nuestro laboratorio y se utiliza para los análisis de comportamiento de alto rendimiento. Una cámara digital de 15 megapíxeles se adjunta a la parte superior de la cabina hacia abajo con el fin de recopilar imágenes de lapso de tiempo de las larvas en placas de varios carriles colocados en la parte superior de la pantalla de un ordenador portátil. Entre las placas y la pantalla hay un difusor de plástico que se utiliza para prevenir los patrones de moiré en las imágenes recogidas.
La Figura 4. Fondo en blanco y PowerPoint estímulo aversivo. Este es el PowerPoint actual que se utiliza para evocar los cambios de comportamiento en larvas de pez cebra. Proporciona las diferencias de comportamiento entre los robustos A) el fondo en blanco y B), la barra roja movimiento.
Figura 5. Comportamientos cuantificados en el ensayo de alto rendimiento. Ejemplo de las conductas que se cuantifican de nuestro ensayo de comportamiento dentro de la hoja de cálculo de Excel que se utiliza para x, y las coordenadas de las larvas. Las barras blancas muestran los datos de las larvas expuestas a un fondo en blanco y las barras rojas muestran los datos de las larvas expuestas a la barra móvil rojo en el PowerPoint. Los gráficos indican las mediciones que se pueden obtener a partir de análisis de comportamiento A) Porcentaje de larvas hacia abajo en el carril, B) Porcentaje de larvas en el extremo del carril, C) Porcentaje de larvas en el borde de la pista, D) Distancia entre los pescado (mm), E) la velocidad de las larvas (mm / min), F) Porcentaje resto de las larvas nadar. En los gráficos que se muestran, los datos es de Tratamientoiento de las larvas con el control DMSO y varias concentraciones de un pesticida que van de 0,001 a 0,1 micras (niveles que se encuentran comúnmente en la dieta humana). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Discussion
A pesar de que constantemente mejoramos nuestro ensayo conductual novela, siempre ha sido de gran utilidad para la detección de la evasión y el comportamiento thigmotaxis larvas de pez cebra 15. Muchos ensayos se han realizado para optimizar los resultados del ensayo, tales como el color de estímulo utilizado, número ideal de larvas por carril, y la longitud del ensayo de comportamiento. Anteriormente, se utilizaron placas de múltiples pocillos (con 6 o 12 pozos) 15,17,18. Sin embargo, recientemente hemos creado la novela molde carril para crear un espacio más grande para la natación de las larvas que nos permite reunir un mayor número de medidas de comportamiento en un único ensayo 16 (Figura 5). Otras modificaciones incluyen variaciones del PowerPoint se muestra el movimiento alterado (o la longitud de ensayo) y el tamaño de las vías utilizadas (también tenemos moldes para carriles más estrechos).
Actualmente, este sistema automatizado de alto rendimiento es único en su capacidad de medir una amplia gama de comportamientos en Zebrlarvas afish al mismo tiempo, como la velocidad, la evitación, la proximidad a otras larvas, y thigmotaxis en placas de varios carriles. Los resultados se pueden conseguir de forma rápida y un gran número de larvas pueden ser analizados en el momento de formación de imágenes. El sistema es barato de construir y rápida y fácil de configurar. Una limitación de este sistema es que los movimientos 3-D no pueden ser evaluados en las larvas de pez cebra. Los sistemas automatizados que hacen un seguimiento de pez cebra adultos tienen la capacidad de 3-D y pueden identificar una gama más amplia de comportamientos tales como el movimiento hacia arriba o hacia abajo dentro de la columna de agua 10,19. Otra limitación es que nuestro sistema de imagen actualmente no se optimiza para análisis de alto rendimiento a velocidad de video. Velocidad de imágenes de vídeo es posible cuando se configura la cámara a una resolución más baja 15, pero esto restringe el análisis a una sola placa.
En el método de "carril" recién creado, varias partes del ensayo necesarios para ser ejecutado de una manera precisa. Al colocar las larvas en tque los carriles, es fundamental asegurarse de que el nivel de líquido es muy bajo hasta que las placas se colocan en la parte superior de la pantalla del portátil. Si los carriles están demasiado llenos de líquido, las larvas se escape hacia la periferia de la placa. Además, al insertar el molde en la agarosa, se debe tener cuidado para bajar el molde muy lentamente. Si el molde se inserta demasiado rápido, se formarán burbujas en la agarosa y serán identificados por el J macro imagen como larvas adicional. Se aconseja que si las pistas de agarosa tienen incluso algunas burbujas, lo mejor es hacer nuevos.
En el futuro, queremos optimizar nuestro ensayo de comportamiento para analizar otros comportamientos complejos como el aprendizaje en larvas de pez cebra y examinar cómo el aprendizaje puede verse afectado por la exposición a sustancias tóxicas y productos farmacéuticos en el desarrollo temprano. Actualmente estamos trabajando en los ensayos que pueden ser útiles para analizar el comportamiento de aprendizaje en el que los resultados conductuales pueden facilitar la determinación de qué áreas del cerebro estánafectados por ciertas sustancias tóxicas o productos farmacéuticos durante el desarrollo. Ensayos automatizados se han desarrollado para la medición de los comportamientos en larvas de pez cebra 20 y estos ensayos de aprendizaje puede ser modificable para el cribado de alto rendimiento mediante el uso de la respuesta de evitación robusta en placas de varios carriles.
Proponemos que este ensayo de comportamiento podría ser utilizado en estudios futuros para probar los efectos en el desarrollo de un gran número de productos farmacéuticos y sustancias tóxicas. Estos estudios proporcionan una gran cantidad de información sobre los factores de riesgo específicos y contribuir al establecimiento de mejores normas de seguridad y salud para las mujeres embarazadas y los niños.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Sean Pelkowski de ayuda en la optimización del ensayo conductual. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano, R01 HD060647 y el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental, F32 y R03 ES021342 ES017755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
| Equipment | |||
| One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
| Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
| Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
| Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
| Camera Lens | Canon | EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens | |
| Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
| Software | |||
| PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Excel 2010 | Microsoft | ||
| Statistical software | SPSS 20 | ||
References
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