हमारी प्रयोगशाला 7 दिन पुरानी zebrafish लार्वा में कई अलग अलग व्यवहार का पता लगाने के लिए उपयोगी है कि एक उपन्यास उच्च throughput स्वचालित इमेजिंग प्रणाली विकसित की है. प्रणाली लार्वा पर्यावरण विषैले पदार्थ या दवाइयों को उजागर किया गया है के बाद व्यवहार में सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम बहु – लेन प्लेटों में 7 दिन पुरानी zebrafish लार्वा में व्यवहार के विश्लेषण के लिए एक उपन्यास उच्च throughput इमेजिंग सिस्टम बनाया है. यह प्रणाली एक प्रस्तुति के माध्यम से लार्वा को दिखाया गया है जो सहज व्यवहार और एक aversive उत्तेजना के जवाब के उपाय. दर्ज की छवियों, स्वचालित रूप से रंग चैनलों विभाजन जो एक ImageJ मैक्रो, साथ विश्लेषण कर रहे हैं पृष्ठभूमि घटाता है, और गलियों में व्यक्तिगत लार्वा नियुक्ति की पहचान करने के लिए एक सीमा लागू होता है. हम तो तैरने की गति, लेन के किनारे या पक्ष के लिए वरीयता, आराम व्यवहार, thigmotaxis, लार्वा के बीच की दूरी, और परिहार व्यवहार यों के लिए एक एक्सेल शीट में निर्देशांक आयात कर सकते हैं. व्यवहार में सूक्ष्म परिवर्तन आसानी पर्यावरण विषैले पदार्थ या दवाइयों से संपर्क के बाद व्यवहार विश्लेषण के लिए यह उपयोगी है, जिससे हमारी प्रणाली का उपयोग कर पता चला रहे हैं.
Zebrafish आनुवंशिक, विकास और व्यवहार विज्ञान 1-4 के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बनते जा रहे हैं. वे 2-3 दिन बाद निषेचन (DPF) द्वारा उनके chorions से पक्षियों के बच्चे 4-5 DPF द्वारा पूरी तरह से कार्य अंगों का विकास, और 7 DPF 5,6 द्वारा व्यवहार की एक बड़ी संख्या में दिखा रहे हैं. Zebrafish लार्वा आदर्श क्योंकि उनके छोटे आकार 7,8 के उच्च throughput विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. सॉफ्टवेयर लार्वा और वयस्क zebrafish 9-14 में व्यवहार के स्वचालित विश्लेषण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है. हालांकि, इस सॉफ्टवेयर का महंगा होना और बहु अच्छी तरह प्लेटें में zebrafish लार्वा की जटिल व्यवहार को मापने के लिए सीमित विकल्प हैं कर सकते हैं.
हम स्थापित करने के लिए और 7 DPF zebrafish लार्वा 15,16 में अलग व्यवहार के एक नंबर यों सकता है सस्ता है कि एक उपन्यास उच्च throughput इमेजिंग सिस्टम बनाया. प्रणाली का एक नंबर करने के लिए भ्रूण प्रदर्शन के बाद हमें जल्दी से और कुशलता से सूक्ष्म व्यवहार असामान्यताएं का परीक्षण करने की अनुमति देता हैफार्मास्यूटिकल्स और पर्यावरण विषैले पदार्थ 16-18.
प्रणाली कैबिनेट के शीर्ष पर जो घर एक डिजिटल कैमरा लकड़ी अलमारियाँ, का उपयोग कर बनाया गया था. कैमरा एक लैपटॉप 15 सामना करना पड़ रहा स्क्रीन के साथ रखा गया है, जहां कैबिनेट के नीचे करने के लिए नीचे चेहरे. समय चूक इमेजिंग गलियों में लार्वा की नियुक्ति पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. लार्वा लैपटॉप स्क्रीन के शीर्ष पर तैनात कर रहे हैं जो चार बहु अच्छी तरह से या बहु लेन प्लेटें में रखे जा सकते हैं. हम लार्वा धार (thigmotaxis) 15,17 दिशा में दूर जा रहा है (परिहार) और तैराकी से प्रतिक्रिया करने के लिए जो एक aversive प्रोत्साहन के रूप में एक प्रस्तुति का उपयोग करें. छवियाँ एक स्वचालित मैक्रो, रंग चैनलों विभाजित पृष्ठभूमि घटाना, और व्यक्ति के लार्वा की पहचान करने के लिए एक सीमा लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें ImageJ में आयात किया जाता है. निर्देशांक प्रत्येक छवि में प्रत्येक लार्वा के लिए सूचीबद्ध कर रहे हैं और हम परिहार और thigmota यों के लिए जो प्रयोग एक एक्सेल फ़ाइल में सम्मिलित किया जा सकता हैxis व्यवहार, मछली दूरी के मछली, गति, और बाकी 16 की राशि तैरना.
हम लगातार अपने उपन्यास व्यवहार परख में सुधार कर रहे हैं, यह हमेशा परिहार और zebrafish लार्वा 15 में thigmotaxis व्यवहार का पता लगाने के लिए उपयोगी हो गया है. कई परीक्षणों इस तरह इस्तेमाल किया प्रोत्साहन के रंग के रूप में, परख के परिणामों का अनुकूलन करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, लेन प्रति लार्वा, और व्यवहार परख की लंबाई के आदर्श संख्या. इससे पहले, हम बहु अच्छी तरह प्लेटें (6 या 12 कुओं के साथ) 15,17,18 इस्तेमाल किया. हालांकि, हाल ही में हम हमें एक भी परख 16 (चित्रा 5) में व्यवहार उपायों की एक बड़ी संख्या को इकट्ठा करने के लिए अनुमति लार्वा के लिए एक बड़ा स्विमिंग स्थान बनाने के लिए उपन्यास लेन ढालना बनाया है. अन्य संशोधनों को PowerPoint दिखाई के रूपांतरों (परख की बदल आंदोलन या लंबाई) और (हम भी अधिक संकरी गलियों के लिए नए नए साँचे है) का इस्तेमाल किया गलियों का आकार शामिल हैं.
वर्तमान में, इस उच्च throughput स्वचालित प्रणाली zebr में व्यवहार की एक बड़ी रेंज के लिए उपाय करने की क्षमता में अद्वितीय हैऐसी गति, परिहार, अन्य लार्वा को निकटता, और बहु लेन प्लेटों में thigmotaxis के रूप में एक ही समय में afish लार्वा. परिणाम जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है और लार्वा की एक बड़ी संख्या इमेजिंग के समय में विश्लेषण किया जा सकता है. प्रणाली स्थापित करने के लिए निर्माण करने के लिए सस्ता और त्वरित और आसान दोनों है. इस प्रणाली की एक सीमा 3 डी आंदोलनों zebrafish लार्वा में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है. वयस्क zebrafish ट्रैक कि स्वचालित प्रणालियों 3 डी की क्षमता है और इस तरह के आंदोलन को ऊपर या नीचे पानी स्तंभ 10,19 भीतर के रूप में व्यवहार का एक व्यापक रेंज की पहचान कर सकते हैं. एक और सीमा हमारे इमेजिंग प्रणाली वर्तमान में वीडियो गति से उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुकूल नहीं है. एक कम संकल्प 15 के लिए कैमरा सेट करने के दौरान वीडियो इमेजिंग गति संभव है, लेकिन यह एक ही थाली के लिए विश्लेषण सीमित.
नव निर्मित "गली" विधि का उपयोग में, परख के कई भागों एक सटीक ढंग से क्रियान्वित किया जा करने की जरूरत है. टी में लार्वा रखनेवह गलियों, यह प्लेटें लैपटॉप स्क्रीन के शीर्ष पर तैनात कर रहे हैं जब तक तरल पदार्थ का स्तर बहुत उथला है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. गलियों तरल का भी पूरा कर रहे हैं, लार्वा प्लेट की परिधि में बच जाएगा. इसके अलावा, agarose में ढालना सम्मिलित करते समय, देखभाल बहुत धीरे ढालना कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. ढालना भी जल्दी से डाला जाता है, तो बुलबुले agarose में बनेगी और अतिरिक्त लार्वा के रूप में छवि जम्मू मैक्रो द्वारा की पहचान की जाएगी. यह agarose गलियों भी कुछ बुलबुले है, यह नए लोगों को बनाने के लिए सबसे अच्छा है की सलाह दी है.
भविष्य में, हम इस तरह के zebrafish लार्वा में सीखने के रूप में अन्य जटिल व्यवहार का विश्लेषण करने और सीखने के प्रारंभिक विकास में विषैले पदार्थ और दवाइयों के लिए जोखिम से प्रभावित हो सकता है कि कैसे की जांच करने के लिए हमारे व्यवहार परख अनुकूलन करने के लिए करना चाहते हैं. वर्तमान में हम व्यवहार परिणामों मस्तिष्क क्षेत्र हैं जो निर्धारित करने की सुविधा हो सकती है जिसमें सीखने के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हो सकता है कि assays पर काम कर रहे हैंविकास के दौरान कुछ विषैले पदार्थ या दवाइयों से प्रभावित. स्वचालित assays के zebrafish लार्वा 20 और इन assays में व्यवहार सीखने बहु लेन प्लेटों में मजबूत परिहार प्रतिक्रिया का उपयोग करके उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए सुधारने योग्य हो सकता है मापने के लिए विकसित किया गया है.
हम इस व्यवहार परख दवाइयों और विषैले पदार्थ की एक बड़ी संख्या के विकास के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रस्ताव. इस तरह के अध्ययन विशिष्ट जोखिम वाले कारकों के बारे में जानकारी का एक धन उपलब्ध कराने और गर्भवती महिलाओं और बच्चों के लिए बेहतर स्वास्थ्य और सुरक्षा के दिशा निर्देशों की स्थापना में योगदान होगा.
The authors have nothing to disclose.
हम व्यवहार परख के अनुकूलन में सहायता के लिए शॉन Pelkowski धन्यवाद. इस काम के बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के राष्ट्रीय संस्थान है, R01 HD060647 और पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान, F32 ES021342 और R03 ES017755 द्वारा समर्थित किया गया था.
Reagent | |||
Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
Equipment | |||
One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
Camera Lens | Canon | EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens | |
Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
Software | |||
PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Excel 2010 | Microsoft | ||
Statistical software | SPSS 20 |