Vårt laboratorium utviklet en ny high-throughput automatisert avbildning, som er nyttig for påvisning av en rekke forskjellige virkemåter i 7 dager gamle larver zebrafisk. Systemet kan brukes for å påvise subtile endringer i atferd etter at larvene har vært utsatt for miljøgifter eller legemidler.
Vi har opprettet en ny high-throughput imaging system for analyse av atferd i syv dager gamle sebrafisk larver i flerfelts plater. Dette systemet måler spontane atferd og responsen på en motvilje stimulus, som er vist til larver via en PowerPoint-presentasjon. De innspilte bildene ble analysert med en ImageJ makro som automatisk deler fargekanalene, trekker bakgrunnen, og gjelder en terskel for å identifisere enkelte larver plassering i baner. Vi kan deretter importere koordinatene i et Excel-ark for å kvantifisere svømme hastighet, preferanse for edge eller på siden av kjørefelt, hvile atferd, thigmotaxis, avstand mellom larver, og unngåelsesatferd. Subtile endringer i atferd er lett oppdages ved hjelp av vårt system, noe som gjør det nyttig for atferdsmessige analyser etter eksponering for miljøgifter eller legemidler.
Sebrafisk er blitt en populær modell for genetiske, utviklingsmessige og atferdsmessige vitenskaper 1-4. De klekkes fra sine chorions etter 2-3 dager etter befruktning (DPF), utvikle fullt fungerende organer med 4-5 DPF, og viser et stort antall atferd ved 7 DPF 5,6. Sebrafisk larver er ideell for high-throughput analyser på grunn av sin lille størrelse 7,8. Programvaren er kommersielt tilgjengelig for automatiserte analyser av atferd i larve og voksen sebrafisk 9-14. Imidlertid kan denne programvaren være dyrt og har begrensede muligheter for å måle komplekse atferd av sebrafisk larver i multi-brønn plater.
Vi skapte en roman high-throughput imaging system som er billig å sette opp og kan kvantifisere en rekke forskjellige virkemåter i 7 DPF sebrafisk larver 15,16. Systemet gjør det mulig for oss å raskt og effektivt teste subtile atferdsmessige abnormiteter etter embryonale eksponering til en rekkelegemidler og miljøgifter 16-18.
Systemet ble bygget ved hjelp av tre skap, som huset et digitalt kamera på toppen av kabinettet. Kameraet vender nedover til bunnen av kabinettet hvor en bærbar PC er plassert med skjermen vendt opp 15. Tidsinnstilte avbildning brukes til å fange plassering av larvene i de baner. Larver kan bli plassert i opptil fire multi-brønn eller flerfelts plater som er plassert på toppen av den bærbare skjermen. Vi bruker en PowerPoint-presentasjon som en motvilje stimulans som larvene svare ved å gå bort (unngåelse) og svømming mot kanten (thigmotaxis) 15,17. Bildene er importert til ImageJ der en automatisert makro brukes til å splitte de fargekanalene, trekke bakgrunnen, og bruke en terskel for å identifisere individuelle larver. Koordinatene er oppført for hver larve i hvert bilde, og kan settes inn i en Excel-fil som vi bruker til å kvantifisere unngåelse og thigmotaXIS atferd, fisk til fisk avstand, svømme hastighet og mengde hvile 16.
Mens vi kontinuerlig forbedre vår roman atferdsmessige analysen, har det alltid vært nyttig for påvisning av unngåelse og thigmotaxis atferd i sebrafisk larver 15. Mange forsøk har blitt utført for å optimalisere resultatene av analysen, slik som farge av stimulus anvendes, ideelle antall larver pr lane, og lengden av atferdsmessige assay. Tidligere brukte vi multi-brønn plater (med 6 eller 12 brønner) 15,17,18. Men nylig har vi opprettet romanen kjørefelt mold å skape en større svømming plass for larvene slik at vi kan samle et større antall atferdsmessige tiltak i en enkelt analyse 16 (figur 5). Andre endringer inkluderer varianter av PowerPoint vist (endret bevegelse eller lengden på analyse) og størrelsen på banene som brukes (vi har også støpeformer for mer smale stier).
For tiden er dette high-throughput automatisert system unik i sin evne til å måle et stort spekter av atferd i zebrafish larver samtidig som hastighet, unngåelse, nærhet til andre larver, og thigmotaxis i flerfelts plater. Resultater kan oppnås raskt og et stort antall larver kan analyseres ved tidspunktet for avbildning. Systemet er både billig å bygge og rask og enkel å sette opp. En begrensning med dette systemet er at 3-D bevegelser ikke kan bli vurdert i sebrafisk larver. Automatiserte systemer som sporer voksen sebrafisk har 3-D evne og kan identifisere et bredere spekter av atferd som for eksempel bevegelse opp eller ned i vannsøylen 10,19. En annen begrensning er at vår imaging system er for øyeblikket ikke optimalisert for high-throughput analyser på video hastighet. Videohastigheten bildebehandling er mulig når du setter kameraet til en lavere oppløsning 15, men dette begrenser analysen til en enkelt plate.
Ved å bruke den nyopprettede "lane"-metoden, trengte flere deler av analysen skal utføres på en presis måte. Når du plasserer larvene i than baner, er det avgjørende å sikre at nivået av væsken er veldig grunt til platene er plassert på toppen av den bærbare skjermen. Dersom banene er også full av væske, vil larvene unnslippe inn i periferien av platen. I tillegg, ved innsetting i formen inn i agarosen, må man være forsiktig å senke støpeformen meget langsomt. Hvis formen er satt inn for raskt, vil det dannes bobler i agarose og vil bli identifisert med bilde J makro som ekstra larver. Det er oppmerksom på at hvis agarose baner har enda noen bobler, er det best å lage nye.
I fremtiden ønsker vi å optimalisere våre atferdsmessige analyse for å analysere andre komplekse atferd som for eksempel læring i sebrafisk larver og undersøke hvordan læring kan påvirkes av eksponering for miljøgifter og legemidler i tidlig utvikling. Vi jobber for tiden med analyser som kan være nyttig for å analysere læring atferd der de atferdsmessige resultater kan lette avgjøre hvilke områder av hjernen erpåvirkes av visse miljøgifter eller legemidler under utvikling. Automatiserte analyser er blitt utviklet for måling av læring atferd i zebrafisk larver 20, og disse prøvene kan være foranderlig for high-throughput screening ved hjelp av robuste unngåelse respons i flerfelts platene.
Vi foreslår at dette atferdsmessige analysen kunne brukes i fremtidige studier for testing av effektene på utvikling av et stort antall legemidler og giftstoffer. Slike studier vil gi et vell av informasjon om spesifikke risikofaktorer og bidra til å sette bedre helse og sikkerhet retningslinjer for gravide kvinner og barn.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Sean Pelkowski for å få hjelp i optimalisering av atferdsmessige analysen. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Child Health and Human Development, R01 HD060647 og National Institute of Environmental Health Sciences, F32 ES021342 og R03 ES017755.
Reagent | |||
Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
Equipment | |||
One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
Camera Lens | Canon | EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens | |
Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
Software | |||
PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Excel 2010 | Microsoft | ||
Statistical software | SPSS 20 |