O nosso laboratório desenvolveu um novo sistema de imagem automatizado de alto débito, que é útil para a detecção de vários comportamentos diferentes em larvas de peixe-zebra de 7 dias de idade. O sistema pode ser utilizado para detectar alterações subtis no comportamento após as larvas foram expostas a agentes tóxicos ambientais ou de produtos farmacêuticos.
Nós criamos um novo sistema de imagem de alto rendimento para a análise do comportamento em larvas do peixe de 7 dias de idade, em placas multi-pista. Este sistema mede comportamentos espontâneos ea resposta a um estímulo aversivo, o que é mostrado para as larvas através de uma apresentação de PowerPoint. As imagens gravadas são analisados com uma macro ImageJ, que divide automaticamente os canais de cor, subtrai o fundo, e aplica-se um limite de identificar a colocação larvas indivíduo nas pistas. Podemos, então, importar as coordenadas em uma folha de Excel para quantificar a velocidade de nado, preferência por borda ou na lateral da pista, o comportamento descansar, tigmotatismo, distância entre larvas e comportamento de evitação. Mudanças sutis no comportamento são facilmente detectados utilizando nosso sistema, tornando-o útil para análises comportamentais após a exposição a substâncias tóxicas ou produtos farmacêuticos ambientais.
Zebrafish estão se tornando um modelo popular de ciências genéticas, comportamentais e de desenvolvimento 1-4. Chocam de seus córions por 2-3 dias após a fertilização (dpf), desenvolver plenamente os órgãos que funcionam por 4-5 dpf, e exibem um grande número de comportamentos por 7 dpf 5,6. Larvas do peixe são ideais para análises de alto rendimento por causa de seu pequeno tamanho 7,8. O software está disponível comercialmente para análises automatizadas de comportamento em larva e adulto zebrafish 9-14. No entanto, este software pode ser caro e possui opções limitadas de medição comportamentos complexos de larvas de peixe-zebra em placas de multi-poços.
Criamos um novo sistema de imagem de alto rendimento que é barato para configurar e pode quantificar uma série de comportamentos diferentes em sete dpf larvas do peixe 15,16. O sistema permite testar de forma rápida e eficiente subtis alterações comportamentais após exposição embrionário para uma série deprodutos farmacêuticos e substâncias tóxicas ambientais 16-18.
O sistema foi construído com armários de madeira, que abrigam uma câmara digital na parte superior do gabinete. A câmara fique virada para baixo para a parte inferior do armário em que um computador portátil é colocado com a tela voltada para cima 15. Lapso de tempo de imagem é usado para capturar a colocação das larvas nas pistas. As larvas podem ser alojados em até quatro placas de poços múltiplos ou multi-lane que estão posicionados no topo da tela do laptop. Usamos uma apresentação do PowerPoint como um estímulo aversivo para que as larvas responder, afastando-se (esquiva) e nadar para a borda (tigmotatismo) 15,17. As imagens são importadas para ImageJ em que uma macro automática é usado para dividir os canais de cor, subtraia o fundo, e um limiar para identificar larvas individual. As coordenadas são listadas para cada larva em cada imagem e pode ser inserido num ficheiro Excel que usamos para quantificar evitação e thigmotacomportamento xis, peixe a distância dos peixes, nadar a velocidade ea quantidade de repouso 16.
Enquanto estamos melhorando continuamente nosso ensaio comportamental novela, tem sido sempre útil para a detecção de evasão e comportamento tigmotatismo em larvas do peixe 15. Muitos ensaios foram realizados a fim de optimizar os resultados do ensaio, tais como a cor do estímulo utilizada, o número ideal de larvas por pista, e duração de ensaio comportamental. Anteriormente, foram utilizados placas multi-poços (com 6 ou 12 poços) 15,17,18. No entanto, recentemente, criaram a novel pista molde para criar um espaço maior para a natação larvas que nos permite recolher um número maior de medições comportamentais num ensaio de 16 (Figura 5). Outras modificações incluem as variações do PowerPoint mostrado (circulação alterados ou comprimento de ensaio) e o tamanho das vias utilizadas (também temos moldes para pistas mais estreitas).
Atualmente, este sistema automatizado de alto rendimento é única em sua capacidade de medir uma grande variedade de comportamentos em ZEBRlarvas afish, ao mesmo tempo, tais como a velocidade, a evasão, a proximidade de outras larvas, e tigmotatismo em placas de multi-lane. Os resultados podem ser obtidos mais rapidamente e de um grande número de larvas podem ser analisados o tempo de imagiologia. O sistema é barata para construir e rápido e fácil de configurar. A limitação deste sistema é que os movimentos 3-D não pode ser avaliada em larvas do peixe-zebra. Os sistemas automatizados que acompanham peixe-zebra adulto tem a capacidade 3-D e pode identificar uma ampla gama de comportamentos tais como o movimento para cima ou para baixo na coluna de água 10,19. Outra limitação é que o nosso sistema de imagem atualmente não é otimizado para análises de alto rendimento em velocidade vídeo. Imaging velocidade vídeo é possível quando se configurar a câmera para uma resolução inferior 15, mas isso restringe a análise a um único prato.
Ao utilizar o método recentemente criado "pista", várias partes do ensaio necessária para ser executada de um modo preciso. Ao colocar as larvas em tele pistas, é fundamental para garantir que o nível de líquido é muito superficial, até as placas estão posicionadas no topo da tela do laptop. Se as pistas estão cheias de líquido, as larvas irão escapar para a periferia da placa. Além disso, quando se insere o molde em que a agarose, os cuidados devem ser tomados para baixar o molde muito lentamente. Se o molde é inserido demasiado depressa, formam-se bolhas de agarose e será identificada pelo J macro imagem como larvas adicional. É aconselhável que se as pistas de agarose tem até algumas bolhas, é melhor fazer novos.
No futuro, gostaríamos de otimizar nosso ensaio comportamental para analisar outros comportamentos complexos como a aprendizagem em larvas do peixe e examinar como o aprendizado pode ser afetado pela exposição a substâncias tóxicas e medicamentos no início do desenvolvimento. Estamos atualmente trabalhando em ensaios que podem ser úteis para analisar o comportamento de aprendizagem em que os resultados comportamentais podem facilitar a determinação de quais áreas do cérebro sãoafetados por certas substâncias tóxicas ou de produtos farmacêuticos durante o desenvolvimento. Ensaios automatizados foram desenvolvidos para medir a comportamentos em larvas do peixe 20 e estes ensaios de aprendizagem pode ser modificável para rastreio de alto rendimento, utilizando a resposta evitação robusto em placas de multi-lane.
Propomos que este ensaio comportamental poderia ser usada em estudos futuros para testar os efeitos do desenvolvimento de um grande número de produtos farmacêuticos e substâncias tóxicas. Tais estudos fornecem uma riqueza de informações sobre os fatores de risco específicos e contribuir para definir melhor as diretrizes de segurança e saúde para as mulheres grávidas e crianças.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Sean Pelkowski para assistência na otimização do ensaio comportamental. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, R01 HD060647 e do Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental, F32 e R03 ES021342 ES017755.
Reagent | |||
Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
Equipment | |||
One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
Camera Lens | Canon | EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens | |
Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
Software | |||
PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Excel 2010 | Microsoft | ||
Statistical software | SPSS 20 |