Vårt laboratorium utvecklat en ny high-throughput automatiserad bildbehandling system som är användbart för att upptäcka flera olika beteenden i 7 dagar gamla zebrafisk larver. Systemet kan användas för att upptäcka subtila förändringar i beteende efter larverna har utsatts för miljögifter eller läkemedel.
Vi har skapat en ny high-throughput imaging system för analys av beteendet i 7 dagar gamla zebrafisk larver i flerfiliga plattor. Detta system mäter spontana beteenden och svaret på en aversiv stimulus, som bevisligen larverna via en PowerPoint-presentation. De inspelade bilderna analyseras med en ImageJ makro som automatiskt delar upp färgkanaler, subtraherar bakgrunden, och tillämpar en tröskel för att identifiera enskilda larver placering i körfält. Vi kan sedan importera koordinaterna i ett Excel-ark för att kvantifiera simma hastighet, preferens för kant eller sida av körfältet, vila beteende, thigmotaxis, avståndet mellan larver, och undvikande beteende. Subtila förändringar i beteende kan lätt upptäckas med hjälp av vårt system, vilket gör det lämpligt för beteendeanalyser efter exponering för miljögifter eller läkemedel.
Zebrafisk blir en populär modell för genetiska, utvecklings-och beteendevetenskap 1-4. De kläcks ur sina chorions med 2-3 dagar efter befruktningen (DPF), utvecklas fullt fungerande organ med 4-5 dpf, och uppvisar ett stort antal beteenden från 7 DPF 5,6. Zebrafisk larver är idealiska för high-throughput analyser på grund av sin ringa storlek 7,8. Programvaran är kommersiellt tillgängliga för automatiserade analyser av beteendet i larver och vuxna zebrafisk 9-14. Dock kan detta program vara dyra och har begränsade alternativ för att mäta komplexa beteenden av zebrafisk larver i flerbrunnsplattor.
Vi skapade en ny high-throughput bildhanteringssystem som är billig att installera och kan kvantifiera ett antal olika beteenden i 7 DPF zebrafisk larver 15,16. Systemet gör att vi snabbt och effektivt testa subtila beteendeavvikelser efter embryonal exponering mot ett antalläkemedel och miljögifter 16-18.
Systemet byggdes med hjälp av trä skåp, vilket hus en digital kamera på toppen av skåpet. Kameran är riktad nedåt mot botten av skåpet där en bärbar dator är placerad med skärmen vänd uppåt 15. Time lapse avbildning används för att fånga placeringen av larver i de banorna. Larver kan hållas i upp till fyra med flera brunnar eller flerfilig plattor som är placerade på toppen av den bärbara skärmen. Vi använder en PowerPoint-presentation som en obehaglig stimulans som larverna svara genom att flytta bort (undvikande) och simma mot kanten (thigmotaxis) 15,17. Bilderna importeras till ImageJ där en automatiserad makro används för att dela upp färgkanaler, subtrahera bakgrunden, och tillämpar ett tröskelvärde för att identifiera enskilda larver. Koordinater listas för varje larv i varje bild och kan sättas in i en Excel-fil som vi använder för att kvantifiera undvikande och thigmotaX är beteende, fisk till fisk avstånd, bada hastighet och mängd vila 16.
Medan vi ständigt förbättra vår nya beteende analys, har det alltid varit användbara för detektion av undvikande och thigmotaxis beteende i zebrafisk larver 15. Många försök har gjorts för att optimera resultaten av analysen, t.ex. färg användes av stimulus, ideal antalet larver per körfält och längd beteende analys. Tidigare använde vi flerbrunnsplattor (med 6 eller 12 brunnar) 15,17,18. Men nyligen har vi skapat den nya körfält formen för att skapa ett större bad utrymme för larverna att tillåta oss att samla ett större antal beteendemässiga åtgärder i en enda analys 16 (Figur 5). Andra modifieringar innefattar variationer av PowerPoint visad (förändrad rörelse eller längd assay) och storleken på de köer som används (vi har även formar för mer smala körfält).
För närvarande är denna hög genomströmning automatiserat system unik i sin förmåga att mäta ett stort spektrum av beteenden i zebrafish larver samtidigt som hastighet, undvikande, närhet till andra larver, och thigmotaxis i flerfiliga plattor. Resultat kan erhållas snabbt och ett stort antal larver kan analyseras vid tiden för avbildning. Systemet är både billig att bygga och snabb och enkel att installera. En begränsning av detta system är att 3-D-rörelserna inte kan bedömas i zebrafisk larver. Automatiserade system som spårar vuxna zebrafisk har 3-D-förmåga och kan identifiera ett bredare spektrum av beteenden såsom rörelse upp eller ned i vattenmassan 10,19. En annan begränsning är att vårt bildsystem för närvarande inte är optimerad för hög kapacitet analyser på video hastighet. Video speed imaging är möjligt när du ställer in kameran till en lägre upplösning 15, men detta begränsar analysen till en enda skylt.
Vid användning av den nyskapade "lane" metoden, behövs flera delar av analysen som ska utföras på ett exakt sätt. Vid placering av larver i tHan körfält, är det viktigt att se till att vätskenivån är väldigt grunt tills plattorna är placerade ovanpå den bärbara skärmen. Om banorna är alltför fullt av vätska, så kommer larverna fly in i plattans periferi. Dessutom, vid insättning formen i agarosen, måste försiktighet iakttas för att sänka formen mycket långsamt. Om formen är insatt för snabbt, kommer bubblor bildas i agaros och kommer att identifieras av Image J makro som extra larver. Det rekommenderas att om agarospartiklar körfält har även några bubblor, är det bäst att göra nya.
I framtiden vill vi optimera vår beteende analys för att analysera andra komplexa beteenden såsom lärande i zebrafisk larver och undersöka hur lärande kan påverkas av exponering för miljögifter och läkemedel i tidig utveckling. Vi arbetar för närvarande på analyser som kan vara användbara för att analysera lärande beteende där de beteendemässiga resultaten kan underlätta avgöra vilka hjärnområden ärpåverkas av vissa toxiska substanser eller läkemedel under utveckling. Automatiserade analyser har utvecklats för att mäta inlärning beteenden i zebrafisk larver 20 och dessa analyser kan vara möjligt att ändra för high-throughput screening med hjälp av robusta undvikande svar i flerfiliga plattor.
Vi föreslår att detta beteende analys skulle kunna användas i framtida studier för att testa de utvecklingseffekter av ett stort antal läkemedel och gifter. Sådana studier skulle ge en mängd information om specifika riskfaktorer samt bidra till bildandet bättre hälsa och säkerhet riktlinjer för gravida kvinnor och barn.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Sean Pelkowski för hjälp i optimering av beteendemässiga analysen. Detta arbete stöddes av National Institute of Child Health and Human Development, R01 HD060647 och National Institute of Environmental Health Sciences, F32 ES021342 och R03 ES017755.
Reagent | |||
Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
Equipment | |||
One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
Camera Lens | Canon | EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens | |
Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
Software | |||
PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Excel 2010 | Microsoft | ||
Statistical software | SPSS 20 |