الفيروسات القهقرية داخلية المنشأ البشرية (هيرفي)، التي تحتل 8٪ من الجينوم البشري، في الحفاظ على قدرات الترميز النادرة ولكن مائة ألف يكرر محطة الطويلة (لترا). تم تصميم مخصص [أفمتريإكس] ميكروأري لتحديد الفرد التعبير هيرفي مكان، وكان يستخدم على الأنسجة سرطان البروستاتا كدليل على مفهوم للدراسات السريرية في المستقبل.
مستضد البروستات محددة (PSA) هو التشخيص الرئيسي العلامات البيولوجية لسرطان البروستاتا في الاستخدام السريري، ولكنه يفتقر إلى الدقة والحساسية، وبخاصة في القيم جرعة منخفضة 1. "كيفية استخدام PSA 'يبقى العدد الحالي، إما للتشخيص كمنطقة رمادي المقابلة لتركيز في مصل الدم من 2،5 حتي 10 نانوغرام / مل الذي لا يسمح تمايز واضح ليكون بين السرطان وnoncancer 2 أو متابعة المريض المتابعة عن تحليل PSA بعد الجراحة يمكن أن المعلمات الحركية تشكل تحديات كبيرة لتطبيقها العملي 3،4. بدلا من ذلك، غير المكودة الرنا (ncRNAs) آخذة في الظهور كما الجزيئات الرئيسية في سرطان الإنسان، مع احتمال أن تكون علامات الرواية اعتبارا من المرض، مثل سرطان البروستاتا PCA3 في 5،6 والكشف عن جوانب uncharacterized البيولوجيا الورم. علاوة على ذلك، أظهرت بيانات من مشروع ترميز نشرت في عام 2012 أن أنواع RNA مختلفة تغطي حوالي 62٪ من جنراللى بعد. ويبدو أيضا أن كمية الزخارف التنظيمية النسخي هو 4.5X على الأقل أعلى من واحد المقابلة لالإكسونات الترميز البروتين. وبالتالي، يكرر محطة الطويلة (لترا) من الفيروسات القهقرية داخلية المنشأ البشرية (HERVs) تشكل مجموعة واسعة من المفترضة / مرشح متواليات التنظيمية النسخي، كما هو وظيفتها الأساسية في الفيروسات القهقرية المعدية. HERVs، والتي تنتشر في جميع أنحاء الجينوم البشري، تنشأ من الالتهابات الأجداد ومستقلة داخل الخط الجرثومية، تليها عمليات نشر النسخ واللصق ويؤدي إلى multicopy أسر الاحتلال 8٪ من الجينوم البشري (لاحظ أن تمتد الإكسونات 2٪ من الجينوم لدينا ). بعض مواضع هيرفي يزال التعبير عن البروتينات التي ارتبطت مع العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان 7-10. لقد قمنا بتصميم ميكروأري عالية الكثافة، في شكل [أفمتريإكس]، والتي تهدف إلى تميز الفرد على النحو الأمثل التعبير هيرفي مواضع، من أجل فهم أفضل لما إذا كان يمكن أن تكون نشطة، وإذا كانت قيادة ncRNA النسخ أو مodulate الترميز التعبير الجيني. وقد تم تطبيق هذه الأداة في مجال سرطان البروستاتا (الشكل 1).
وتنتشر الفيروسات القهقرية داخلية المنشأ الإنسان (وتسمى أيضا HERVs) في جميع أنحاء الجينوم لدينا. أنها تنشأ من الالتهابات الأجداد ومستقلة داخل الخط الجرثومية، تليها عمليات نشر النسخ واللصق ويؤدي إلى الأسر multicopy. اليوم، فإنها ليست أكثر المعدية ولكنها تحتل 8٪ من الجينوم البشري؛ كنقطة المقارنة، الإكسونات تمتد 2٪ من الجينوم البشري. وأظهرت بيانات من مشروع ترميز نشرت في عام 2012 أن أنواع RNA مختلفة تغطي حوالي 62٪ من الجينوم، بما في ذلك الثلث في المناطق بين الجينات. وعلاوة على ذلك، يبدو أن كمية الزخارف التنظيمية النسخي هو 4.5X على الأقل أعلى من واحد المقابلة لالإكسونات الترميز البروتين. يكرر HERVs محطة الطويلة (LTR) تمثل مجموعة واسعة من العناصر التنظيمية النسخي المحتملة، كما هو وظيفتها المعتادة في الفيروسات القهقرية المعدية. تاريخيا، باستثناء عدد قليل من مواضع أعرب في المشيمة أو الخصية، وكان يعتقد عموما أن هيرفي صامتون بسبب الجيش الشعبيتنظيم igenetic. لذلك، قمنا بتصميم ميكروأري عالية الكثافة، في شكل [أفمتريإكس]، والتي تهدف إلى تميز الفرد على النحو الأمثل التعبير هيرفي مواضع، من أجل فهم أفضل سواء كانت نشطة، وإذا كانت قيادة lncRNA النسخ أو تعدل الترميز التعبير الجيني. هذه الأداة يطلق عليها اسم هيرفي-V2 GeneChip يدمج 23583 probesets هيرفي ويمكن تمييز عناصر 5،573 هيرفي متميزة تتألف من ترا منفردا وكذلك proviruses الكاملة والجزئية (الشكل 2).
التشخيص، والتقييم، والخطة:
ويستند تشخيص سرطان البروستاتا على جرعة من مستضد البروستات المعين (بي إس) العلامات البيولوجية في المختبرات السريرية، وفحص المستقيم الرقمية لتقييم التعديلات الشكلية البروستاتا وأخيرا خزعات البروستاتا لوحظ من قبل الطبيب الشرعي. عدم وجود خصوصية وحساسية كافية بين المؤشرات الحيوية سرطان التقليدية، مثل دعم البرامج والإدارة للكشف عن سرطان البروستاتا، فقد تم الاعتراف على نطاق واسع بالعربيةثالثا عدة عقود من الآثار السريرية 1. في البداية، اقترح PSA لتشخيص وعلاج غدية في البروستاتا 11. كان الأخير المقترحة لفحص سرطان ورصد تطور هذا المرض 12. ومع ذلك، لا يزال هناك السؤال الذي يطرح بانتظام: 'كيفية استخدام PSA'. (ط) المنطقة الرمادية المقابلة لتركيز في مصل الدم من 2،5 حتي 10 نانوغرام / مل لا تسمح لفرق واضح إلى أن يتم بين السرطان وnoncancer 2، (ب) دراستين فوج كبير الالتحاق مئات الآلاف من الناس في أوروبا و الولايات المتحدة الأمريكية فشلت في التوصل إلى استنتاج واضح حول جدوى الفحص من حيث الوفيات الناجمة عن مرض معين 13،14، (ج) تحليل PSA المعلمات الحركية بعد الجراحة مثل إزالة PSA، PSA السرعة ومضاعفة الوقت، على الرغم بسيطة من الناحية النظرية، يمكن أن تشكل تحديات كبيرة في عملية 3،4 التطبيق. ونحن قد نتوقع أن في السنوات المقبلة، العلامات البيولوجية التطبيقسوف lications دعم خيار السريرية بين الانتظار الساهرة وأكثر أو أقل عدوانية العلاجات اعتمادا على النمط الظاهري الورم. بشأن التشخيص المقدمة من قبل الطبيب الشرعي، وهو عامل يحد من أول يأتي من 20٪ التشخيص سلبية كاذبة في خزعات البروستاتا (وغاب عن العديد من أنواع السرطان بأخذ عينات). ومصدر القلق الثاني يتعامل مع الحاجة لإجراء خزعة الإضافية التالية واحد سلبي، والتي قد تعرض آثار ضارة.
استئصال البروستاتا تعد حاليا واحدة من العلاجات القياسية لسرطان البروستاتا. يقترح في المرضى الأصحاء، والشيخوخة 45-65 سنة، لا سيما في حالة أنماط عدوانية (جليسون 7-10)، الورم متعدد البؤر أو ورم واضح. يتم ذلك الآن في قسمنا استخدام الجراحة الروبوتية بمساعدة. بسبب أدلة متزايدة على أن الواسمات الجزيئية سيكون لها أهمية قصوى في السنوات المقبلة، قررنا أن يقترح على جميع مرضانا إمكانية المشاركة في برنامج لالبروستاتاالمصرفية الأنسجة. بتعبير أدق، أدت برامج البحوث الجزيئية التوسع في سرطان البروستاتا في مطلب زيادة للوصول إلى جودة عالية أنسجة الورم الطازجة من العينات استئصال البروستاتا. هذا البحث، ولا سيما النهج الجيني، مطلوب عينات واسعة من نوعية عالية DNA / RNA. وهناك حاجة إلى الورم و 'غير الورم' الأنسجة المجاورة من نفس المريض. وقد صممت للتعامل مع توصيات ومعالجة جراحات استئصال البروستاتا للحفاظ على ميزات المرضية التي تحدد المرحلة والوضع الهامش ومزيد من العلاج والتشخيص وبالتالي المحتملة. أي طريقة جديدة أخذ عينات الأنسجة، وبالتالي، لا ينبغي التنازل التقييمات المرضية اللاحقة من أجل أن تكون مقبولة من التشخيص. تشريح العيانية البروستات أمر صعب ويحتاج إلى عناية كبيرة لدفعها إلى الهامش والأنسجة غزو المحفظة: ينبغي إجراء أي تشريح للأعمال المصرفية البروستاتا دائما من قبل المدربين uropathologist وفقا لتوافقد البروتوكول. لجنة أخلاقيات كلية الطب والمجلس الطبي الدولة وافق على هذه التحقيقات وأبلغت تم الحصول على الموافقة لجميع المرضى المدرجة في أنسجة البروستاتا المصرفي.
على مدى السنوات ال 10 الماضية، فإن معظم المحاولات لقياس هيرفي التعبير استخدمت تقنيات RT-PCR إما التركيز على مكان معين أو 20-24 على أساس الحفاظ النسبي للجينات بول لتقييم الاتجاهات العامة داخل هيرفي أجناس 25،26 . بالإضافة إلى ذلك، التكبير PCR باستخدام بادئات تدهورت للغاية إلى جانب ميكروأرس منخفض الكثافة تهدف إلى كشف وتحديد التعبير عن الأسر هيرفي 27،28. من أجل اقتفاء أثر التعبير عن موضع الفرد داخل الأسرة، على أساس نهج التضخيم PCR من مناطق الحفظ جنبا إلى جنب مع الاستنساخ والتسلسل اللاحق تمكين العناصر المتميزة النشطة transcriptionally من HML-2 أو 29،30 هيرفي-E4.1 31 عائلة ل يتم التعرف عليها. تنتهي أيضا عن طريق الاستنساخ وتسلسل الخطوات، الجينوم تكرار تقنية الرصد التعبير تهدف إلى تحديد المروجين بين يكرر حددت HML-2 لتر الانفرادي الإنسان محددة نشط <sup> 32،33. وضعنا على التوالي جيلين من ميكروأرس عالية الكثافة المخصصة لتحليل Transcriptome على هيرفي، وإدخال منهجيات مناسبة لتكرار تصميم عنصر التحقيق من أجل تقليل التفاعلات المتبادلة بين العناصر paralogous داخل الأسرة 34،35. رقاقة هيرفي-V2 الذي يستهدف 2،690 proviruses متميزة و2،883 لترا منفردا من هيرفي-W، هيرفي-H، هيرفي-E 4.1، هيرفي-FRD، هيرفي-K HML-2-K وهيرفي HML-5 عائلات، كشف التعبير عن 1،718 هيرفي مواضع (أرقام 7A وباء) في مجموعة واسعة من أنسجة 35، ويتضح في هذه الورقة عن طريق تحديد المؤشرات الحيوية المفترضة البروستاتا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، استخدام probesets متعددة على مكان معين هو بالمعلومات عن تنظيم النسخي لها. الأولى، وهي إشارة سلبية U3 بالتزامن مع واحدة إيجابية U5 يصنف LTR كمشجع، وربما يعكس إشارات سلبية على العكس U3 إيجابية وU5 دورا تذييل بعديد الأدينيلات. وبالتالي فإننا طdentified 326 لترا المروج في مجموعة واسعة من أنسجة 35، وبناء على هذه المعلومات شيئين U3-U5 التي تقدمها مجموعة، اقترحنا وأكد تجريبيا لبعض حالات مختارة أن هذه النسخ الحكم الذاتي والسيطرة عليها من قبل مثيلة عملية جينية تعتمد 34 (الشكل 8). الثانية، والكشف عن إشارات من مثل LTR، هفوة والحياة الفطرية probesets مستقلة أو صدر من تحقيقات تستهدف تقاطع لصق محددة بالمعلومات حول استراتيجية الربط proviral، كما يتضح من البيانات الشخصية ERVWE1/Syncytin1 التعبير في المشيمة أو في الخصية الورم 34. هذا يشير إلى أن عملية اختيار هيرفي التحقيق المحددة هي قوية بما يكفي لدعم تحديد استراتيجية الربط المرتبطة الأنسجة، وبكفاءة كما لجينات التقليدية 36 (الشكل 8).
هذا الأسلوب هو أول محاولة لتحديد مكان التعبير بشكل فردي هيرفيباستخدام ميكروأري عالية الكثافة المخصصة القائمة على التكنولوجيا [أفمتريإكس]. مزايا محددة بوضوح من تنسيق ميكروأري فك Transcriptome على هيرفي تتكون من (ط) استكشاف منسقة من عدة عائلات هيرفي و (ب) تحليل في وقت واحد ومستقل من المناطق المختلفة لكل مكان، على سبيل المثال. U3 وU5 المجالات لمنفردا وترا proviral والمناطق هفوة أو الحياة الفطرية وتقاطعات ممكن تقسم الهياكل المرتبطة proviral، دون أي بداهة على وظيفة من العنصر هيرفي. آفاق تعتمد على حدوث تحسن من الشروح في أدوات biocomputing المرتبطة ميكروأري. هذا ينبغي أن يسمح احد لتحويل الإشارات رقاقة في الفرضيات البيولوجية مثل ما إذا HERVs نشطة يتضح دفع lncRNA النسخ أو تعدل أكثر أو أقل الداني الترميز التعبير الجيني. في الواقع، ويدعم هذه الفرضية من خلال الدراسات الحديثة أن حددت البروستاتا المرتبطة بالسرطان النصوص ncRNA تحتوي على مكونات الخامسORFS iral من عائلة هيرفي-K الذاتية الارتجاعي أو أجزاء من منطقة المروج الفيروسية LTR 37، فضلا عن اثنين من الأحداث الانصهار الجين وهي هيرفي-K22q11-ETV1 وهيرفي-K17-ETV 38،39. أخذت معا، فإن هذا النهج Transcriptome على كله جنبا إلى جنب مع وظيفة LTR والتعرف استراتيجية الربط قد تساعد على فك علامة مقابل مكونات الزناد من هيرفي التعبير في المزمنة والأمراض المعدية 40،41 42،43.
The authors have nothing to disclose.
نشكر سيسيل Montgiraud، جولييت جيمينيز، مجلي جايار وبرتراند بوناود عن مساهمتها في التطوير الأولي وتعظيم الاستفادة من بروتوكول هيرفي-V2. ونود أيضا أن نشكر هادر Haidous لقيادته على الاعتبارات الأخلاقية.
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
EQUIPMENT | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
|
HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |