인간 게놈의 8 %를 차지 인간 내인성 레트로 바이러스 (HERV)는, 부족한 코딩 능력 만 십만 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸) 유지. 사용자 지정 Affymetrix의 마이크로 어레이는 개별 HERV의 궤적 표현을 식별하도록 설계되었으며, 향후 임상 연구에 대한 개념의 증거로 전립선 암 조직에 사용되었다.
전립선 – 특이 항원 (PSA)은 임상 사용에서 전립선 암을위한 진단 바이오 마커 메인이지만, 특히 낮은 투여 한 값에, 특이성 및 감도 부족하다. 'PSA를 사용하는 방법'중 하나 명확한 감별법이 암과 noncancer 2 사이 또는 환자 다음에하는 것을 허용하지 않습니다 2.5-10 NG / ㎖의 혈청 농도에 해당하는 회색 영역으로 진단을 위해, 현재의 문제가 남아있다 업 수술 후 PSA의 분석으로 운동 매개 변수는 실용적인 응용 프로그램 3,4 상당한 도전을 제기 할 수 있습니다. 또한, 비 암호화 RNA를 (ncRNAs)는, 질병 등의 새로운 마커를 제공 전립선 암 5,6의 예 PCA3 종양 생물학의 특성화되지 않은 부분을 공개 할 잠재력을 지닌, 인간의 암의 핵심 분자로 부상하고있다. 또한 2012 년에 발표 된 ENCODE 프로젝트의 데이터는 다른 RNA 유형이 세대의 약 62 %를 커버 것으로 나타났다오메. 또한 전사 조절 모티브의 양이 단백질 – 코딩 엑손에 대응 한보다 적어도 4.5 배 더 높은 것으로 보인다. 그것은 전염성 레트로 바이러스에서의 기본 기능이기 때문에 따라서, 인간의 내인성 레트로 바이러스 (에 HERVs)의 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸는), 추정 / 후보 전사 조절 서열의 넓은 범위를 구성한다. 인간 게놈 전체에 퍼져에 HERVs는 복사 – 붙여 넣기 전파 과정 다음에 인간 게놈의 8 %를 차지하는 가족 (엑손은 우리의 게놈의 2 %에 걸쳐 있습니다 다중 사본을 선도 세균 라인 내 조상의 독립 감염에서 시작 ). 일부 HERV 궤적은 여전히 암 ~ 10 등 여러 가지 병리와 관련 된 단백질을 표현한다. 우리는 최적 나은 그들이 ncRNA 전사 또는 m을 구동하는 경우가, 활성화 될 수 있는지를 이해하기 위해, 개별 HERV 궤적 식의 특성을 목표로, 어피 메트릭스 형태로, 고밀도 마이크로 어레이를 설계했다odulate 유전자 발현을 코딩. 이 도구는 전립선 암 필드 (그림 1)에 적용되었습니다.
(도에 HERVs라고도 함) 인간의 내인성 레트로 바이러스는 우리의 게놈을 통해 확산됩니다. 그들은 복사 – 붙여 넣기 전파 프로세스에 의해 다음과 다수 체 가족에 이르는 세균 라인 내 조상의 독립 감염에서 유래. 오늘날, 그들은 더 이상 전염되지 않습니다하지만 그들은 인간 게놈의 8 %를 차지, 비교 지점으로, 엑손은 인간 게놈의 2 %에 걸쳐. 2012 년에 발표 된 ENCODE 프로젝트의 데이터는 다른 RNA의 종류가 intergenic 지역의 삼분 포함, 게놈의 약 62 %를 커버 것으로 나타났다. 또한, 전사 조절 모티프의 양이 단백질 – 코딩 엑손에 대응 한보다 적어도 4.5 배 더 높은 것으로 보인다. 그것은 전염성 레트로 바이러스에서의 일반적인 기능입니다로에 HERVs 긴 터미널 반복 (LTR)은 잠재적 인 전사 조절 인자의 넓은 범위를 나타냅니다. 역사적으로 떨어져 태반이나 고환으로 표현 몇 가지 유전자 좌에서, 그것은 일반적으로 HERV 인해 EP에 침묵 것으로 생각되었다igenetic 규제. 그러므로, 우리는 최적 나은 그들이 lncRNA 전사를 구동 또는 유전자 발현을 코딩 변조하는 경우가 활성화되어 있는지 여부를 이해하기 위해, 개별 HERV 궤적 식을 특성화 목표 Affymetrix의 형식으로, 고밀도 마이크로 어레이를 설계했다. HERV-V2 유전자 칩 불리는이 도구는 23,583 HERV의 probesets을 통합하고 5573 솔로 LTR에 의해 둘러싸 구성 별개의 HERV 요소뿐만 아니라 전체 및 부분 proviruses (그림 2)를 구별 할 수 있습니다.
진단, 평가 및 계획 :
전립선 암의 진단은 임상 실험에서 전립선 특이 항원 (PSA) 바이오 마커, 형태 전립선의 변경 및 병리학 자에 의해 관찰 마지막으로 전립선 생검을 평가하는 직장 수지 검사의 용량을 기반으로합니다. 전립선 암에 대한 PSA와 같은 기존의 암 바이오 마커 사이에 충분한 민감도와 특이도의 부족은 널리 AF를 인정 받고 있습니다임상 적 의미의 터 수십 년 1. 처음에, PSA는 전립선의 11 선암의 진단과 치료를 위해 제안되었다. 그것은 암 검사를 위해 제안하고 질병 (12)의 발전을 모니터 후자이었다. 그러나, 정기적으로 요구되는 질문은 남아있다 : 'PSA를 사용하는 방법'. (II) 두 개의 큰 코호트 연구는 유럽에서 수십만 명의 사람들을 등록하고, (I) 2.5-10 NG의 혈청 농도에 해당하는 회색 영역 / ㎖는 분명 차이가 암과 noncancer 2 사이에하는 것을 허용하지 않습니다 , 이론 심플, 같은 PSA 통관, PSA 속도와 시간을 두 배로으로 수술 후 PSA 운동 매개 변수 (III) 분석, 미국 질병 별 사망률 (13, 14)의 측면에서 검사의 유용성에 대한 명확한 결론에 도달하는 데 실패 실용적인 응용 프로그램의 3,4에 상당한 도전을 제기 할 수 있습니다. 우리는 바이오 마커 응용 프로그램에게, 앞으로 것을 예상 할 수 있습니다lications은 감시 대기보다 또는 종양의 표현형에 따라 덜 공격적 치료 사이의 임상 적 선택을 지원합니다. 병리학 자에 의해 렌더링 진단에 관한 제 제한 요인은 (많은 암이 샘플링에 의해 놓친) 전립선 생검 내에서 20 %의 위음성 진단에서 비롯됩니다. 두 번째 문제는 악영향을 제시 할 수있다 음 하나, 다음과 같은 추가적인 조직 검사 절차의 필요성 다룬다.
과격한 전립선은 현재 전립선 암의 표준 치료의 하나입니다. 이는, (10 글리슨 7), 특히 적극적인 패턴의 경우, 45-65년 노화, 건강한 환자에서 종양 병소 또는 명백한 종양을 제안한다. 그것은 지금 로봇 보조 수술을 사용하여 우리 부서에서 수행됩니다. 때문에 분자 마커는 향후 몇 년 동안 가장 중요있을 것이라는 점을 성장의 증거, 우리는 우리의 모든 환자에게 전립선을위한 프로그램에 참여의 가능성을 제안하기로 결정조직 은행. 더 정확하게, 전립선 암의 확대 분자 연구 프로그램은 전립선 절제 표본에서 높은 품질의 신선한 종양 조직에 대한 액세스에 대한 요구 증가로 이어질. 이 연구는, 특히 게놈 접근 방식은 높은 DNA / RNA 품질의 큰 샘플을 요구했다. 종 양성과 같은 환자에서 인접 '비 종양의'조직이 필요합니다. 급진적 prostatectomies을 처리하고 처리하기위한 권장 사항은 무대와 마진 상태함으로써 잠재적 인 추가 치료 및 예후를 결정하는 병리학 적 기능을 유지하도록 설계되어 있습니다. 어떤 신선한 조직 표본 추출 방법은, 따라서 진단에 수용 할 수 있도록 후속 병리학 적 평가에 손상을주지해야한다. 전립선의 거시적 해부 어렵고 큰 관심 마진 조직과 캡슐의 침략에 지불해야합니다 : 전립선 은행에 대한 해부는 항상 동의에 따라 훈련 uropathologist에 의해 수행되어야한다D 프로토콜입니다. 의료 교수진과 국가 의료 보드의 윤리위원회는 이러한 조사에 동의하고 모든 환자가 전립선 조직 은행에 포함에 대한 동의를 얻었다 알렸다.
지난 10 년 동안, HERV 발현 측정을위한 시도의 대부분은 RT-PCR 기법을 사용한 하나 HERV 장군 (25), (26) 내에서 일반적인 경향을 평가하는 폴 유전자의 상대 보전에 따라 특정 궤적 20-24 또는에 초점을 . 또한 HERV 패밀리 27,28의 발현을 검출하고 정량화하기위한 저밀도 마이크로 어레이와 결합 매우 퇴화 프라이머를 사용한 PCR의 증폭. 패밀리 내의 개별 궤적의 발현을 추적하기 위해, 클로닝 및 염기 서열과 결합 보존 영역의 PCR 증폭을 기반 접근법에 HML-2 29,30 또는 HERV E4.1-31 패밀리의 전사적으로 활성 고유 요소를 사용할 식별. 또한 복제 및 시퀀싱 단계로 끝나는, 활성 HML-2 특정 인간의 고독한 LTR에 의해 둘러싸 확인 반복 사이에 발기인을 파악하는 것을 목표로 게놈 반복 식 모니터링 기술 <sup> (32, 33). 우리는 연속적 가족 34,35 paralogous 내의 요소들 간의 상호 반응을 최소화하기 위해 반복 요소 프로브 설계를위한 적당한 방법론을 도입 HERV의 전 사체의 분석에 전용 고밀도 마이크로 어레이의 두 세대를 개발했다. HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2와 HERV-K HML-5 가족의 2,690 별개의 proviruses 및 2,883 솔로 LTR에 의해 둘러싸 대상으로 HERV-V2 칩은 발표 추정 전립선 암 바이오 마커의 식별 정보를 이용하여 본 논문에서 설명 조직 (35)의 넓은 범위에서 1,718 HERV의 궤적 (도 7a 및 B)의 식입니다. 또, 관련 궤적상의 여러 probesets의 사용은 그것의 전사 조절에 대해 유익하다. 첫째, U5 긍정적와 함께 U3 부정적인 신호가 발기인으로 LTR을 분류하고, 반대로 U3 긍정적 U5 부정적인 신호는 폴리아 데 닐화 역할을 반영 할 수있다. 우리는 그래서 난배열에 의해 제공이 U3-U5 이분법 정보를 기반으로 조직 (35)의 넓은 범위에서 326 프로모터 LTR에 의해 둘러싸 dentified, 우리가 제안하고 실험적으로 이러한 자율적 인 전사가 메틸화 따라 후생 유전 학적 과정 34 (그림에 의해 제어 된 몇 가지 선택된 경우에 확인 8). 태반이나 종양의 고환 34 ERVWE1/Syncytin1 발현 프로파일에 의해 그림과 같이 두 번째로, 예를 들어, LTR에서 신호의 검출, 개그와 ENV 독립 probesets 또는 특정 스플 라이스 접합을 대상으로 프로브에서 발행는 프로 바이러스 접합 전략에 대한 정보를합니다. 이 HERV 특정 프로브 선택의 과정은 (그림 8)로 효율적으로 기존의 유전자를 36으로, 조직 관련 접합 전략의 식별을 지원하기에 충분한 강력한 있음을 나타냅니다.
이 방법은 개별적 HERV 궤적 표현식을 식별하는 첫번째 시도어피 메트릭스 기술을 기반으로 정의 고밀도 마이크로 어레이를 사용. 마이크로 어레이 형식의 명확하게 식별의 장점은 (I)로 구성된 HERV의 사체를 해독하는 여러 HERV 가족의 조정 탐사 및 각 현장에 대한 다른 지역의 (II)를 동시에 독립적 인 분석, 예. 솔로 프로 바이러스 LTR에 의해 둘러싸, 개그 또는 ENV 지역 및 사전 HERV 요소의 기능에없는 프로 바이러스 구조와 관련된 가능한 접합 접합에 대한 U3 및 U5 도메인. 전망은 마이크로 어레이 관련 biocomputing 도구에서 주석의 개선에 의존한다. 이것은 하나의 예 입증 활동에 HERVs이 lncRNA 전사를 운전하거나 더 많거나 적은 근위 코딩 유전자 발현을 조절 여부와 같은 생물 학적 가설에 칩의 신호를 변환 할 수 있도록해야합니다. 사실, 이러한 가정은 V의 구성 요소를 포함하는 전립선 암 관련 ncRNA 성적 증명서를 확인 최근의 연구에 의해 지원됩니다HERV-K 내인성 레트로 바이러스의 가족이나 일부 바이러스 LTR 프로모터 영역 (37)의뿐만 아니라, 두 개의 유전자가 융합 이벤트 즉 HERV-K22q11-ETV1과 HERV-K17-ETV (38, 39)에서 iral의 ORF. 이와 함께, LTR 기능과 접합 전략 식별과 결합이 전체의 사체 방식은 트리거 만성 40, 41에 HERV 식의 구성 요소 및 감염 질환 42, 43 대 마커를 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 HERV-V2 프로토콜의 초기 개발 및 최적화에 기여를 위해 세실 Montgiraud, 줄리엣 Gimenez, 갈리 Jaillard와 버트 랜드 본느 와드 감사합니다. 우리는 또한 윤리적 고려 사항에 대한 자신의 지침을위한 hader Haidous을 감사드립니다.
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
EQUIPMENT | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
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HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |