Retrovirus endogeni umani (HERV), che occupano l'8% del genoma umano, mantengono la capacità di codifica scarse, ma centinaia di migliaia di lunga ripetizioni terminali (litri). Un microarray Affymetrix personalizzato è stato progettato per identificare l'espressione individuale HERV locus ed è stato utilizzato su tessuti di carcinoma della prostata come un proof of concept per i futuri studi clinici.
L'antigene prostatico specifico (PSA) è il principale biomarker diagnostico per il cancro della prostata in uso clinico, ma manca di specificità e sensibilità, in particolare bassi valori di dosaggio 1. 'Come usare PSA' rimane un problema di corrente, sia per la diagnosi come una zona grigia corrispondente ad una concentrazione nel siero di 2,5-10 ng / ml che non permette una chiara differenziazione da effettuare tra cancro e noncancer 2 o per follow paziente -come l'analisi del PSA post-operatorio parametri cinetici possono porre notevoli sfide per la loro applicazione pratica 3,4. In alternativa, RNA non codificanti (ncRNAs) stanno emergendo come molecole chiave nel cancro umano, con la possibilità di servire come nuovi marcatori di malattia, ad esempio PCA3 nel carcinoma della prostata 5,6 e rivelare aspetti non caratterizzate della biologia tumorale. Inoltre, i dati del progetto ENCODE pubblicato nel 2012 ha mostrato che i diversi tipi di RNA coprono circa il 62% della generazioneome. Risulta inoltre che la quantità di motivi regolatori trascrizionali è almeno 4,5 volte superiore a quella corrispondente al esoni codificanti proteine. Così, ripetizioni terminali lunghe (LTR) di retrovirus endogeni umani (HERVs) costituiscono una vasta gamma di putative / candidati sequenze regolatrici trascrizionali, in quanto è la loro funzione primaria nei retrovirus infettivi. HERVs, che sono diffuse in tutto il genoma umano, provengono da infezioni ancestrali e indipendenti all'interno della linea germinale, seguiti da processi di propagazione copia-incolla e portano a Multicopy famiglie che occupano l'8% del genoma umano (notare che esoni coprono il 2% del nostro genoma ). Alcuni loci HERV esprimere ancora le proteine che sono stati associati con diverse patologie tra cui il cancro 7-10. Abbiamo progettato un microarray ad alta densità, in formato Affymetrix, al fine di caratterizzare in modo ottimale espressione individuale HERV loci, al fine di comprendere meglio se possono essere attivi, se guidano ncRNA trascrizione o modulate codifica genica. Questo strumento è stato applicato nel campo del cancro della prostata (Figura 1).
Retrovirus endogeni umani (chiamati anche HERVs) sono sparsi in tutto il nostro genoma. Essi provengono da infezioni ancestrali e indipendenti all'interno della linea germinale, seguiti da processi di propagazione copia-incolla e conducono alle famiglie multicopia. Oggi, essi non sono più infettive ma occupano 8% del genoma umano, come punto di confronto, esoni abbracciano 2% del genoma umano. Dati del progetto ENCODE pubblicato nel 2012 ha dimostrato che diversi tipi di RNA coprono circa il 62% del genoma, compreso un terzo in regioni intergeniche. Inoltre, sembra che la quantità di motivi regolatori trascrizionali è almeno 4,5 volte superiore a quella corrispondente al esoni codificanti proteine. Ripetizioni HERVs lungo terminali (LTR) rappresentano una vasta gamma di potenziali elementi regolatori trascrizionali, come lo è la loro funzione abituale nei retrovirus infettivi. Storicamente, a parte alcuni loci espresso nella placenta o testicolo, si credeva che HERV tacciono a causa di epregolamento igenetic. Pertanto, abbiamo progettato un microarray ad alta densità, in formato Affymetrix, al fine di caratterizzare in modo ottimale espressione individuale HERV loci, al fine di comprendere meglio se sono attivi, se guidano lncRNA trascrizione o modulano l'espressione genica codificante. Questo strumento soprannominato HERV-V2 GeneChip integra 23.583 probesets HERV e può discriminare 5.573 elementi HERV distinti composti da LTR solisti così come provirus complete e parziali (Figura 2).
Diagnosi, Valutazione, e il Piano:
La diagnosi di cancro alla prostata è basato sul dosaggio dell'antigene prostatico specifico (PSA) biomarker in laboratorio clinico, un esame rettale digitale per valutare alterazione morfologica della prostata e infine biopsie prostatiche osservati dal patologo. La mancanza di specificità e sensibilità sufficiente tra biomarker tumorali convenzionali, come PSA per il cancro alla prostata, è stato ampiamente riconosciuto after decenni di implicazioni cliniche 1. Inizialmente, PSA è stato proposto per la diagnosi e il trattamento di adenocarcinoma della prostata 11. Era quest'ultimo proposto per lo screening del cancro e monitorare lo sviluppo della malattia 12. Tuttavia, rimane una domanda che viene regolarmente chiesto: 'come usare PSA'. (I) Una zona grigia che corrisponde ad una concentrazione nel siero di 2,5-10 ng / ml non consente una chiara differenza deve essere fatta tra il cancro e non oncologico 2; (ii) due studi di coorte grandi iscrivendosi centinaia di migliaia di persone in Europa e USA non è riuscito a giungere ad una chiara conclusione circa l'utilità dello screening in termini di malattia mortalità specifica 13,14, (iii) analisi dei parametri cinetici di PSA post-operatorio come liquidazione PSA, PSA velocity e tempo di raddoppio, anche se semplice in teoria, può porre notevoli sfide in pratica 3,4 applicazione. Possiamo aspettarci che nei prossimi anni, biomarker appcazioni sosterranno una scelta clinica tra vigile attesa e più o trattamenti meno aggressivi a seconda del tumore fenotipo. Per quanto riguarda la diagnosi reso dal patologo, un primo fattore limitante proviene da una falsa diagnosi negativa del 20% entro biopsie prostatiche (molti tumori sono mancati per campionamento). Una seconda preoccupazione occupa della necessità di una procedura biopsia ulteriore seguente uno negativo, che possono presentare effetti avversi.
La prostatectomia radicale è attualmente uno dei trattamenti standard per il cancro alla prostata. Si propone in pazienti sani, invecchiamento 45-65 anni, soprattutto nel caso di modelli aggressivi (Gleason 7 a 10), tumore multifocale o tumore palpabile. Ora è fatto nel nostro reparto con chirurgia robotica assistita. A causa della crescente evidenza che i marcatori molecolari avranno fondamentale importanza nei prossimi anni, abbiamo deciso di proporre a tutti i nostri pazienti la possibilità di partecipare a un programma per la prostatabanche di tessuti. Più precisamente, i programmi di ricerca in espansione molecolari sul cancro alla prostata hanno portato ad una richiesta crescente di accesso ai tessuti tumorali freschi di alta qualità da campioni prostatectomia. Questa ricerca, in particolare gli approcci genomici, richiesto grandi campioni di qualità elevata DNA / RNA. Tumorali e tessuti adiacenti "non tumorali" dello stesso paziente sono necessari. Raccomandazioni per la gestione e l'elaborazione prostatectomies radicali sono progettati per preservare le caratteristiche patologiche che determinano palco e lo stato dei margini e così il potenziale ulteriore trattamento e la prognosi. Qualsiasi metodo di campionamento tessuto fresco, quindi, non dovrebbe compromettere successive valutazioni patologiche per essere accettabile per la diagnosi. Dissezione macroscopica della prostata è difficile e grande attenzione deve essere prestata ai tessuti di margine e capsulare invasione: qualsiasi dissezione per la prostata bancario dovrebbe essere sempre condotta da un esperto uropathologist in base a un accordod protocollo. Il comitato etico della facoltà di medicina e la scheda medica stato convenuto di queste indagini e il consenso informato è stato ottenuto per tutti i pazienti inclusi nel tessuto della prostata bancario.
Negli ultimi 10 anni, la maggior parte dei tentativi di misurazione espressione HERV hanno utilizzato tecniche di RT-PCR a concentrarsi su un locus specifico 20-24 oppure sulla base della relativa conservazione dei geni pol Per valutare le tendenze generali all'interno HERV generi 25,26 . Inoltre, amplificazioni PCR con primer altamente degenerati accoppiato con microarray a bassa densità destinati a rilevare e quantificare l'espressione di famiglie HERV 27,28. Al fine di rintracciare l'espressione del locus individuo all'interno di una famiglia, metodi basati sulla PCR di regioni conservate in combinazione con successiva clonazione e il sequenziamento abilitato elementi distinti trascrizionalmente attivi delle HML-2 29,30 o HERV-E4.1 31 famiglie a essere identificati. Finendo anche dalla clonazione e sequenziamento passi, la tecnica di monitoraggio espressione del genoma di ripetizione al fine di individuare i promotori tra ripetizioni identificati attivi HML-2 specifici LTR solitarie umani <sup> 32,33. Abbiamo successivamente sviluppato due generazioni di microarrays ad alta densità dedicate all'analisi del trascrittoma HERV, introducendo opportune metodologie per ripetuta progettazione sonda elemento al fine di minimizzare reazioni incrociate tra elementi paraloghe all'interno di una famiglia 34,35. Il chip HERV-V2 che si rivolge 2690 provirus distinti e 2883 LTR solisti del HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 e HERV-K HML-5 famiglie, ha presentato il espressione di 1.718 HERV loci (Figure 7A e B) in una vasta gamma di tessuti 35, illustrate in questo documento per l'identificazione di putativi prostata biomarker tumorali. Inoltre, l'utilizzo di più probesets su un dato locus è informato sulla sua regolazione trascrizionale. In primo luogo, un segnale negativo U3 in combinazione con un U5 positivo classifica il LTR come promotore, e segnali negativi viceversa U3 positivi e U5 può riflettere un ruolo poliadenilazione. Abbiamo così identified 326 LTR promotore in una vasta gamma di tessuti 35 e, basandosi su questa U3-U5 dicotomica informazioni fornite dalla matrice, abbiamo proposto e confermato sperimentalmente per alcuni casi selezionati che tale trascrizione autonoma era controllata da un processo dipendente metilazione epigenetica 34 (Figura 8). In secondo luogo, l'individuazione di segnali provenienti ad esempio LTR, gag ed env probesets indipendenti o emessi da sonde destinate specifico svincolo Splice è informato sulla strategia di splicing provirale, come dimostra il profilo di espressione ERVWE1/Syncytin1 in placenta o nel testicolo tumorale 34. Questo indica che il processo di HERV selezione specifica sonda è abbastanza robusto per sostenere l'individuazione di una strategia splicing tessuto-associata, nel modo più efficiente per geni convenzionali 36 (Figura 8).
Questo metodo è il primo tentativo di identificare l'espressione locus individualmente HERVutilizzando un microarray ad alta densità personalizzato basato sulla tecnologia Affymetrix. I vantaggi chiaramente identificati formato microarray di decifrare transcriptome HERV costituito da (i) l'esplorazione coordinata di diversi famiglie HERV e (ii) l'analisi simultanea e indipendente dalle regioni differenti per ciascun locus, ad es. Domini U3 e U5 per solista e LTR provirali, le regioni del bavaglio o env ed eventuali giunzioni di splicing associati alle strutture provirali, senza alcun a priori sulla funzionalità dell'elemento HERV. Le prospettive si basano su un miglioramento delle annotazioni negli strumenti di bioinformatica microarray associati. Ciò dovrebbe permettere di convertire i segnali di chip in ipotesi biologiche, ad esempio se HERVs attivi rappresentati in auto lncRNA trascrizione o modulano più o meno prossimale codifica l'espressione genica. Infatti, tale ipotesi è supportata da recenti studi che hanno identificato prostata cancro associato trascritti ncRNA contenenti componenti di vORF IRAL della famiglia HERV-K endogeno retrovirus o più parti di una regione del promotore LTR virale 37, così come due eventi gene di fusione ovvero HERV-K22q11-ETV1 e HERV-K17-ETV 38,39. Nel loro insieme, questo approccio intero trascrittoma combinata con la funzione LTR e splicing identificazioni strategia può aiutare a decifrare il marcatore contro gli elementi di innesco di espressione HERV a 40,41 croniche e le malattie infettive 42,43.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard e Bertrand Bonnaud per il loro contributo allo sviluppo iniziale e ottimizzazione del protocollo HERV-V2. Desideriamo inoltre ringraziare Hader Haidous per la sua guida su considerazioni etiche.
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
EQUIPMENT | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
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HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |