Menselijke endogene retrovirussen (HERV), die 8% van het menselijk genoom bezet, behoudt schaarse coderende capaciteit maar honderdduizend lange terminale herhalingen (LTR). Een aangepaste Affymetrix microarray werd ontworpen om individuele herv locus expressie te identificeren en werd gebruikt op prostaatkanker weefsels als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.
De prostaat-specifiek antigeen (PSA) is de belangrijkste diagnostische biomarker voor prostaatkanker gebruikt, maar het mist specificiteit en gevoeligheid, vooral bij weinig doseringswaarden 1. 'Hoe PSA gebruiken' blijft een actueel onderwerp, hetzij voor diagnose als een grijze zone overeenkomt met een concentratie in serum van 2,5-10 ng / ml die niet toelaat een duidelijk onderscheid worden gemaakt tussen kanker en noncancer 2 of patiëntfollow -up als analyse van post-operatieve PSA kinetische parameters kunnen aanzienlijke uitdagingen met zich meebrengen voor de praktische toepassing 3,4. Als alternatief, niet-coderende RNA's (ncRNAs) zijn in opkomst als de belangrijkste moleculen in kanker bij de mens, met de potentie om als nieuwe markers van de ziekte te dienen, bijvoorbeeld PCA3 bij prostaatkanker 5,6 en ongekarakteriseerde aspecten van de tumor biologie onthullen. Bovendien zijn de gegevens van het project CODEREN gepubliceerd in 2012 aangetoond dat verschillende RNA omvatten ongeveer 62% van het genome. Verder blijkt dat de hoeveelheid transcriptionele regelende motieven ten minste 4,5 x hoger dan hetgene voor eiwit coderende exons. Aldus, lange eindstandige herhalingen (LTR's) van humaan endogene retrovirussen (HERVs) vormen een groot aantal vermeende / kandidaat transcriptionele regulerende sequenties, omdat het de primaire functie van infectieuze retrovirussen. HERVs, die verspreid liggen over het menselijk genoom, afkomstig van voorouderlijke en onafhankelijke infecties in de kiem lijn, gevolgd door een copy-paste vermeerdering worden geïntegreerd en waarbij MultiCopy families bezetten 8% van het menselijk genoom (merk op dat exons overspannen 2% van ons genoom ). Sommige HERV loci uiting voor eiwitten die zijn geassocieerd met verschillende pathologieën waaronder kanker 7-10. We ontwierpen een hoge dichtheid microarray, in Affymetrix formaat doel optimaal karakteriseren individuele HERV loci expressie, om beter begrijpen of ze actief kunnen zijn, als ze rijden ncRNA transcriptie of modulate codering genexpressie. Deze methodologie werd toegepast prostaatkanker veld (figuur 1).
Human endogene retrovirussen (ook wel HERVs) liggen verspreid over ons genoom. Ze zijn afkomstig van voorouderlijke en onafhankelijke infecties in de kiem lijn, gevolgd door een copy-paste propagatie processen en leidt tot multicopy families. Vandaag zijn ze niet meer besmettelijk maar bezetten 8% van het menselijk genoom, als vergelijkingspunt, exons omvatten 2% van het menselijk genoom. Gegevens van het ENCODE project gepubliceerd in 2012 aangetoond dat verschillende RNA omvatten ongeveer 62% van het genoom, waarvan een derde intergene gebieden. Bovendien blijkt dat de hoeveelheid transcriptionele regelende motieven ten minste 4,5 x hoger dan hetgene voor eiwit coderende exons. HERVs long terminal repeats (LTR) vertegenwoordigen een breed scala van mogelijke transcriptionele regulerende elementen, zoals hun gebruikelijke functie infectieuze retrovirussen. Historisch, afgezien van enkele loci uitgedrukt in de placenta en testis, werd algemeen aangenomen dat HERV zwijgen door epigenetic regelgeving. Daarom hebben we een hoge dichtheid microarray, in Affymetrix formaat doel optimaal karakteriseren individuele HERV loci expressie, om beter te begrijpen of zij actief zijn, wanneer zij aandrijving lncRNA transcriptie of moduleren coderende genexpressie. Deze tool nagesynchroniseerde herv-V2 GeneChip integreert 23.583 herv probesets en kan 5573 verschillende herv elementen bestaat uit solo LTRs evenals volledige en gedeeltelijke provirussen (figuur 2) discrimineren.
Diagnose, Assessment, en Plan:
Diagnose van prostaatkanker gebaseerd op dosering van de prostaat specifiek antigeen (PSA) biomarker in klinisch laboratorium, een digitaal rectaal onderzoek morfologische verandering van de prostaat en tenslotte prostaatbiopsieën waargenomen door de patholoog evalueren. Het ontbreken van voldoende specificiteit en sensitiviteit tussen conventionele kanker biomarkers, zoals PSA voor prostaatkanker, is algemeen erkend after tientallen jaren van klinische implicaties 1. Aanvankelijk werd PSA voorgesteld voor de diagnose en behandeling van adenocarcinoom van de prostaat 11. Het laatste was voorgesteld kankeronderzoek en bewaken van de ontwikkeling van de ziekte 12. Er blijft echter een vraag die regelmatig wordt gesteld: 'hoe PSA gebruiken'. (I) Een grijze zone overeenkomt met een concentratie in serum van 2,5-10 ng / ml niet mogelijk een duidelijk onderscheid te maken tussen kanker en noncancer 2, (ii) twee grote cohort studies inschrijven honderdduizenden mensen in Europa USA geen duidelijke conclusie over het nut van screening qua ziektespecifieke mortaliteit 13,14 komen, (iii) analyse van postoperatieve PSA kinetische parameters zoals klaring PSA, PSA snelheid en verdubbelingstijd, hoewel eenvoudig in theorie, kan aanzienlijke uitdagingen in de praktische toepassing 3,4 opleveren. We kunnen verwachten dat in de komende jaren, biomarker appcaties zal een klinische keuze tussen een afwachtend beleid en meer of minder agressieve behandelingen, afhankelijk van de tumor fenotype ondersteunen. Met betrekking tot de diagnose gemaakt door de patholoog, een eerste beperkende factor is afkomstig van een 20% vals negatieve diagnose binnen prostaatbiopsieën (vele kankers worden gemist door bemonstering). Een tweede probleem heeft betrekking op de noodzaak voor een extra biopsie procedure na een negatieve, nadelige effecten kunnen presenteren.
Radicale prostatectomie is momenteel een van de standaard behandelingen voor prostaatkanker. Voorgesteld bij gezonde patiënten ouder 45-65 jaar, vooral bij agressieve patronen (Gleason 7 tot 10), multifocale tumor of voelbare tumor. Het wordt nu gedaan in onze afdeling met behulp van robot geassisteerde chirurgie. Vanwege het groeiende bewijs dat de moleculaire markers het grootste belang zal hebben in de komende jaren, hebben we besloten om aan al onze patiënten de mogelijkheid om deel te nemen aan een programma voor prostaatweefselbanken. Meer precies, het uitbreiden van moleculaire onderzoeksprogramma's op prostaatkanker hebben geleid tot een toenemende behoefte aan toegang tot hoogwaardige verse tumorweefsel na prostatectomie. Dit onderzoek, in het bijzonder de genomische benaderingen, vereist grote steekproeven van hoge DNA / RNA kwaliteit. Tumorale en naastgelegen niet tumorale 'weefsel van dezelfde patiënt nodig. Aanbevelingen voor het omgaan met en het verwerken van radicale prostatectomies zijn ontworpen om pathologische kenmerken die fase en marge status en daardoor mogelijk verdere behandeling en de prognose bepalen behouden. Geen vers weefsel bemonsteringsmethode, daarom niet latere pathologische evaluaties compromissen om tot de diagnose aanvaardbaar zijn. Macroscopische dissectie van de prostaat is moeilijk en moet veel aandacht worden besteed aan de marge weefsels en kapsel-invasie: elke dissectie voor prostaat bank moet altijd worden uitgevoerd door een getrainde uropathologist volgens een overeenkomstd protocol. De ethische commissie van de medische faculteit en de staat medische raad ingestemd met deze onderzoeken en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten die in de prostaat weefsels bankieren.
De afgelopen 10 jaar zijn de meeste pogingen voor HERV expressie meting zijn RT-PCR-technieken gebruikt worden om op een specifiek locus 20-24 of gebaseerd op de relatieve behoud van de pol genen algemene trends evalueren binnen HERV genera 25,26 . Bovendien PCR amplificaties met behulp van zeer gedegenereerde primers bij een laag microarrays dichtheid bedoeld om de expressie van HERV families 27,28 detecteren en kwantificeren. Om binnen een familie de uitdrukking van individuele locus traceren, benaderingen op basis van de PCR-amplificatie van geconserveerde gebieden in combinatie met de daaropvolgende klonering en sequencing ingeschakeld transcriptioneel actieve verschillende elementen van de HML-2 29,30 of herv-E4.1 31 gezinnen worden geïdentificeerd. Ook eindigt door klonen en sequencing stappen, het genoom herhaling uitdrukking meettechniek gericht om initiatiefnemers te identificeren tussen herhalingen geïdentificeerd actief HML-2 specifieke menselijke eenzame LTR <sup> 32,33. We achtereenvolgens ontwikkelde twee generaties van high-density microarrays gewijd aan de analyse van de herv transcriptome, de invoering van methoden voor herhaald element sonde ontwerp om kruisreacties tussen paraloge elementen binnen een gezin 34,35 minimaliseren. De HERV-V2 chip, die 2690 verschillende provirussen en 2883 solo LTRs van de HERV-W, herv-H, herv-E 4.1, herv-FRD, herv-K HML-2 en herv-K HML-5 gezinnen richt, onthulde de expressie van 1.718 herv loci (figuren 7A en B) in een breed scala van weefsels 35, geïllustreerd in dit document door de identificatie van mogelijke prostaatkanker biomarkers. Bovendien, het gebruik van meerdere probesets op een bepaalde locus informatief over de transcriptionele regulatie. Eerst een U3 negatief signaal in combinatie met een U5 positieve classificeert de LTR als een promotor, en omgekeerd U3 positieve en negatieve signalen U5 kan polyadenylatie rol geven. We i dusdentified 326 promotor LTRs in een brede waaier van weefsels 35 en, op basis van deze U3-U5 dichotome informatie die door de array, we voorgesteld en experimenteel bevestigd voor een aantal geselecteerde gevallen dat een dergelijke autonome transcriptie werd bestuurd door een methylatie afhankelijke epigenetische proces 34 (Figuur 8). Ten tweede, de detectie van signalen van bijvoorbeeld LTR, gag en env onafhankelijke probesets of uitgegeven vanaf probes gericht op specifieke splitsings is informatief over de provirale splicing strategie, zoals wordt geïllustreerd door de ERVWE1/Syncytin1 expressie profiel in placenta of in tumorale testis 34. Dit geeft aan dat het proces van HERV specifieke selectie probe robuust genoeg is om de identificatie van weefsel-geassocieerde splicing strategie zo efficiënt als conventionele genen 36 (figuur 8).
Deze methode is de eerste poging om individueel herv locus expressie te identificerenmet behulp van een aangepaste hoge dichtheid microarray gebaseerd op Affymetrix technologie. Het duidelijk voordeel van de microarray formaat HERV transcriptoom bestaande uit (i) het ontcijferen van de gecoördineerde uitwerking van diverse HERV families en (ii) de gelijktijdige en onafhankelijke analyse van de verschillende regio's voor elke locus, bijvoorbeeld. U3 en U5 domeinen voor solo en proviraal LTR, prop of env regio's en mogelijk gesplitst kruispunten in verband met proviraal structuren, zonder a priori op de functionaliteit van de herv element. Vooruitzichten vertrouwen op een verbetering van annotaties in de microarray bijbehorende bio-gereedschappen. Dit moet het mogelijk maken een tot chip signalen in biologische hypothesen zoals de vraag of bewezen actieve HERVs rijden lncRNA transcriptie of moduleren min of meer proximale codering genexpressie. Inderdaad, is een dergelijke veronderstelling wordt ondersteund door recente studies dat prostate kanker-geassocieerde ncRNA transcripten die bestanddelen van v geïdentificeerdIral ORF van HERV-K endogene retrovirus familie of delen van een virale LTR promoter gebied 37, evenals twee genfusie gebeurtenissen namelijk HERV-K22q11-ETV1 en HERV-K17-ETV 38,39. Samen genomen, kan dit hele transcriptome aanpak gecombineerd met LTR-functie en splicing strategie identificaties helpen om de marker te ontcijferen ten opzichte van de trekker onderdelen van herv expressie bij chronische 40,41 en infectieziekten 42,43.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard en Bertrand Bonnaud voor hun bijdrage aan de initiële ontwikkeling en optimalisatie van de herv-V2-protocol. We willen ook Hader Haidous bedanken voor zijn begeleiding bij ethische overwegingen.
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
EQUIPMENT | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
|
HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |