Summary
Vi presenterer en forberedelse til å visualisere og manipulere kalsium signalisering i native, intakt microvascular endotelet. Endothelial rør fersk isolert fra mus motstand arteriene som forsyner muskulatur beholde in vivo morfologi og dynamisk signal innenfor og mellom nabocellene. Endoteliale rør kan fremstilles fra microvessels av andre vev og organer.
Abstract
Kontrollen av blodstrømmen ved motstanden vaskulaturen regulerer tilførsel av oksygen og næringsstoffer samtidig med fjerning av metabolske biprodukter, som eksemplifisert ved å utøve skjelettmuskel. Endoteliale celler (ECS) linje intima av alle motstands fartøy og tjener en sentral rolle i å kontrollere diameter (f.eks endotelium-avhengig vasodilatasjon) og derved, størrelse og fordeling av vev blodstrøm. Reguleringen av vaskulær motstand av ECS bevirkes ved intracellulær Ca 2 +-signalering, noe som fører til produksjon av diffunderbare autacoids (f.eks nitrogenoksid og arakidonsyre-metabolitter) 1-3 og hyperpolarisering 4,5 som fremkaller glattmuskelcellet avslapning. Dermed forstå dynamikken i endothelial Ca 2 + signalering er et viktig skritt mot å forstå mekanismene som styrer blodstrømmen kontroll. Isolere endothelial rør eliminerer konfunderende variabler knyttet til blood i fartøyet lumen og med omkringliggende glatte muskelceller og perivaskulær nerver, noe som ellers påvirker EC struktur og funksjon. Her presenterer vi isolering av endothelial rør fra den overlegne magesekkens arterien (SEA) ved hjelp av en protokoll optimalisert for dette fartøyet.
For å isolere endoteliale rør fra en bedøvet mus, er SEA ligert in situ for å opprettholde blod innenfor fartøyet lumen (for å lette visualisere det under disseksjonen), og hele ark av abdominal muskel er utskåret. Havet er dissekert fri fra omkringliggende skjelettmuskelfibre og bindevev, blod skylles ut av lumen, og mild enzymatisk fordøyelse er utført for å muliggjøre fjerning av adventitia, nerver og glatte muskelceller som bruker milde trituration. Disse nylig isolerte preparater av intakt endotel beholde sin opprinnelige morfologi, med individuelle EKB gjenværende funksjonsmessig koblet til hverandre, i stand til å overføre kjemisk og elektrisk SIsignalene intercellularly gjennom gap veikryss 6,7. I tillegg til å gi ny innsikt i kalsium signalering og membran biofysikk, disse preparatene aktivere molekylære studier av genekspresjon og proteiner lokalisering innenfor innfødte mikrovaskulær endotelet.
Introduction
I denne protokollen beskriver vi isolering av endotelcelle rør fra muse SEA. SEA oppstår fra den interne thorax arterie og leverer oksygenrikt blod til fremre abdominal muskulaturen. Vårt arbeidsmiljø med havet som en modell kan tilskrives det gir relativt lange, unbranched microvessel segmenter som er godt egnet for å studere intercellulær signal hendelser underliggende rolle endotelet i styrende og koordinerende glattmuskelcellet avslapping. For de som er interessert i andre enn skjelettmuskulatur vev, har vi funnet denne teknikken til å være lett tilpasses for å skaffe endothelial rør fra microvessels av hjernen, tarmen og lymfesystemet.
De viktigste funksjonene i denne metoden er at intakte lengder (1-3 mm) av mikrovaskulær endotelet er isolert, sikret mot et glass dekkglass i en flyt kammer der de er superfuseres med PSS, og avbildes for Ca 2 + signaliserer 7-9 ellerspiddet for elektriske signal 6,8. Innenfor strømningskammeret, er den øvre halvdel av et rør som utsettes for superfusjons-løsning og reagerer på eksperimentelle inngrep, mens den nedre halvdel (i kontakt med dekkglass) er beskyttet og forblir stillestående. I tillegg til å studere både intra-og inter Ca 2 + signal hendelser, kan endothelial rør brukes for kvantitativ real-time PCR for å vurdere genuttrykk 6,10, immunhistokjemi å undersøke protein uttrykk 6,10, og elektrofysiologiske studier for å definere biofysiske egenskaper av elektrisk ledning 6,11.
Det er flere fordeler med den endoteliale røret forberedelse for å studere endotelial funksjon. Det første er at isoleringsprosessen er en enkel skille mellom to cellepopulasjoner: endoteliale celler (som forblir i røret dannelse) og glatte muskelceller (individuelt dissosiert, vanligvis "C"-formet nåravslappet). Dette gir mulighet for selektiv prøvetaking og undersøkelse av unike egenskaper underliggende respektive celler 'bidrag til fartøy funksjon. For det andre kan denne modellen oppløsningen på signaleringshendelser iboende til endotelet, uavhengig påvirkning av blodstrømmen, omgir glatte muskler, nerver, og parenchyma. For det tredje er den endotel undersøkt mens ferskt isolert, for derved å unngå forandringer i gen eller protein ekspresjon i forbindelse med cellekultur.
Protocol
En. Utarbeidelse av utstyr: Flow Chamber, pipetter og løsninger
- Flow kammer: Bruk en flyt kammer med en 24 mm x 50 mm glass dekkglass på bunnen for å superfuse de isolerte endothelial rør (se figur 1A). Før du monterer kammer, vaske glassDekk med både 3% HCl og 70% etanol, skyll med ultrarent vann, og tørk med nitrogengass.
- Pipettes: Tre forskjellige typer pipetter brukes under protokollen: cannulation, trituration, og låsing. Både kanylering og låsing pipetter kan gjøres før dagen for eksperimentet, men utgnidning pipette bør gjøres i dag da den krever kjennskap til diameteren av fartøyet til størrelsen på hulrommet på riktig måte.
- Cannulation pipetter: For å skylle røde blodceller fra lumen, trekke borsilikatglass kapillarrør ved hjelp av en mikropipette avtrekker for å ha lange, koniske ender. Bryt endene med pinsetter til en ytre diameter på ~ 30% less enn arteriene (~ 50 til 80 mikrometer), og brann polish spissen for å være glatt (se figur 1B). Det er nyttig å også vinkelen tips av pipetter til ca 45 °.
- Triturerings pipetter: Til mekanisk distansere de glatte muskelceller og adventitia fra endotel-rør, gjør triturering av pipetter fra borsilikatglass kapillarrør. Forbered kapillærrør som ovenfor, og bryte slutten med pinsett. Tips: Bruk et glass scoring enheten for å gjøre det lettere å bryte den tykkere veggen av trituration pipette glass rent. Bryt pipette til den innvendige diameter bestemmes på dagen for eksperimentet, omtrent 10-20 mikrometer større enn den ytre diameter av karet hvorfra endoteliale rør blir isolert. Brann polsk de ødelagte endene til glatt (se figur 1C).
- Feste pipetter: For å stabilisere endotelial røret inne i strømningskammeret, gjør låsing pipetter for å feste endotelial tUbe mot dekk bunnen av kammeret. Trekk glasskapillære rør på samme måte som kanylering pipetter. Deretter bryte endene med pinsetter til en diameter på ~ 100 mikrometer, og brann polish til spissene er forseglet, avrundet og glatt (se figur 1D). Merk: Hvis spissen av pipetten låsing ikke er helt lukket, vil fluid komme inn i hulrommet, og kan forvirre eksperimentelle resultater.
- Solutions: Forbered alle løsninger i ultrarent (18.2 MΩ) H 2 O og sterilisere dem gjennom et 0,2 mikrometer filter. Kontroller at osmolalitet av løsningene er mellom 285-300 mOsm. Solutions er fortsatt gode for omtrent to uker når oppbevart ved 4 ° C.
- Disseksjon oppløsning: Den saltløsning som brukes under dissekering av den overlegne epigastriske arterie er sammensatt av (i mmol / L): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl 2, 10 N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre ( HEPES), 10 glukose, 0,01 natriumnitroprussid (SNP), end 0,1% bovint serum-albumin (BSA) med en pH-verdi på 7,4. NO donor SNP er inkludert for å hjelpe slappe glatte muskelceller, og dermed gjør dem lettere å cannulate arterien og for å lette glatt muskelcelle fjerning under utgnidning.
- Dissosiasjon oppløsning: Den saltløsning som brukes under dissosiasjon av endotelial røret er sammensatt av (i mmol / L): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 glukose, 2 CaCl 2, og 0,1% BSA, med en pH på 7,4. Til en 1 ml alikvot av denne buffer, tilsett: 0,62 mg / ml papain, 1,5 mg / ml kollagenase og 1,0 mg / ml dithioerythritol. Siden enzymer fra ulike leverandører kan ha varierende grad av enzymatisk aktivitet, er produktnumrene til de som brukes til dette arbeidet er inkludert som referanse i tabellen av materialer. Merk: Under protokollen både dissosiasjon buffer og dissosiasjon buffer med enzymer benyttes på ulike trinn.
- Super oppløsning: Den fysiologisk saltløsning (PSS) som brukes for superfusing den isolerte endotelial røret er sammensatt av (i mmol / L): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 glukose og 2 CaCl 2, med en pH-verdi på 7,4.
- Forbered buffere og løsninger før du begynner kirurgiske prosedyrer. Fjern løsningene fra 4 ° C og delmengde 50 ml av Dissection buffer inn i en 200 ml Erlenmeyerkolbe og plassere den på is. I tillegg, alikvoter 50 ml Dissosiasjon buffer uten enzymer og plasser den på benken topp til romtemperatur. Fjern det superfusjonsløsning fra 4 ° C, og tillate det å nå romtemperatur på benken toppen.
2. Animal Forberedelse
Sørg for at alle prosedyrer og protokoller som involverer dyr er i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Prosedyrene som beskrives her ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved Universitetet iMissouri.
- Bruk mannlig eller kvinnelig mus minst ni uker gammel og studerer hver individuelt. Anesthetize en mus med pentobarbital natrium (60 mg / kg) via intraperitoneal (ip) injeksjon. Tips: Fortynning av pentobarbital til 10 mg / ml i sterilt saltvann før injeksjon reduserer muligheten for overdosering.
- Anestesi kompromisser temperaturregulering, så hold muse varme umiddelbart etter første injeksjon av pentobarbital. Ved hjelp av en metall-bærer (ventilert aluminium kurven) på toppen av en varme-plate (kalibrert til ~ 37 ° C) fungerer godt for å holde temperaturen på mus stabil. Alternativt kan du bruke en varmelampe, ta vare å plassere den på en passende avstand fra musen. Overvåk mus hver 5-10 min til det riktige nivået av anestesi oppnås (mangel på uttak til tå eller hale klype). En supplerende dose kan være nødvendig etter 15-20 min. Det er best å gå sakte og forsiktig for å unngå overdosering, spesielt med overvektige, alderen, eller dyrs ellers stresset.
- Fjern hår fra ventral side ved forsiktig barbere det med små kjæledyr hårklippemaskiner. Spesiell oppmerksomhet bør tas for å unngå traumer til dyret. Det er nyttig å fjerne alt hår fra et område som strekker seg over armhulene til kjønnshår området. Fjern eventuelle løst klamrer håret med en frisk spritserviett.
- Plasser musen på ryggen, liggende med både for-og baklemmene spredt ut til å avsløre så mye av bukveggen som mulig. Om nødvendig, bruk laboratorium tape for å feste bena i en spread-eagle måte.
Tre. Isolasjon av Superior Epigastrisk Artery
- Lag et lite innsnitt gjennom huden like over det området av skam-regionen. Sørg for at bare huden blir kuttet og samtidig unngå skader på underliggende magemuskelen, forlenge snittet lateralt i hver retning ut til respektive bakbena. Fortsett snittet rostrally langs den ventrale midtlinje til toppen av brystkassen ogn strekker snittet sideveis i hver retning med respektive forelimbs.
- Løft forsiktig huden og bruke saks for å klippe av bindevev som holder huden til den underliggende muskel og derved eksponere hele overflaten av den abdominale muskulatur (se figur 3A). Skyll den eksponerte muskelen med romtemperatur 0,9% saltløsning.
- På grunn av den lille størrelsen på SEA, plasserer dyret under et stereomikroskop for videre handlinger. Løft fettpute på undersiden av brystbenet med tang, og lage et snitt gjennom det. Fortsett snittet langs bunnen rib, og pass på å ikke kutte for dypt inn i det underliggende vevet. SEA bør være synlig, ta vare å unngå å skade den. Når snittet er ferdig, dreneres eksponert vev med romtemperatur 0,9% saltløsning.
- Etter det øverste laget av muskel-skjelettlidelser har blitt trukket tilbake, er SEA og underliggende muskel lett identifiseres. Tips: Vær oppmerksom på lengden påSEA in vivo før isolere å utvide endothelial rør (som forkorte sammen sin egen akse på isolasjon) til tilnærmet sin opprinnelige lengde. Bruk pinsett og saks, avgiftsdirektoratet nøye tynn muskel laget under SEA.
- Bruke vinklet pinsett, passere en lengde på 6-0 silke sutur under SEA og ligate arterien og dens tilstøtende vene å holde det under trykk og blod beholdes innenfor årehulrommet å lette visualisering under påfølgende isolasjon og rengjøring.
- Gjenta SEA ligation prosedyre på motsatt side.
- Når begge konsekvensutredninger har blitt ligatisert, gjør et snitt langs midtlinjen av magemusklene for å skille respektive sider.
- Utvid snittet sidelengs i hver retning som på huden, og deretter fortsette snittet vertikalt langs ytterkanten å fullstendig skille abdominal muskel fra kroppen. Unngå skader på blodkar matet av SEA å opprettholde trykk lumen.
- CUT SEA ovenfor ligering for å opprettholde tetningen, og plassere den isolerte muskler og arterien i et 50 ml begerglass inneholdende 10 ml av 4 ° C disseksjon buffer.
- Gjenta fremgangsmåten for den andre siden av buk-og inkuberes vevene i disseksjon buffer i 10 min.
- Plasser abdominal muskel inneholder SEA i et avkjølt (4 ° C) disseksjon kammeret inneholder disseksjon buffer (se Figur 3B). Den disseksjon kammer består av en petriskål med et lag av Sylgard (polydimetylsiloksan [PDMS]) nederst.
- Ved hjelp av insekt pinner (0,15 mm), strekke den isolerte SEA og abdominal muskel ut til tilnærmet in vivo lengder (nevnt ovenfor) og fest den til Sylgard. Tips: Orientering av muskel slik at det tynne laget vendt bukhinnen er på toppen gjør SEA lett synlig ved hjelp transilluminasjon.
- Utnytte fin microdissection instrumenter og jobbe fra oppstrøms side av ligation motnedstrøms ende, tømme havet fra sin paret blodåre og det omkringliggende vevet før den første store grenen hotellet (1-2 cm). Deretter avgiftsdirektoratet SEA ved å kutte den like over den grenen området og like nedenfor ligation.
- For å fjerne blod beholdes innenfor årehulrommet, cannulate SEA og skylle den med iskald disseksjon buffer. Ved hjelp av et stykke silastinrør, sett på slutten av en cannulation pipette til en 5 ml sprøyte med iskald disseksjon buffer og sikre mikropipette i en micromanipulator å posisjonere sin spissen i disseksjon kammeret å cannulate SEA.
- Når alle de erytrocytter skylles ut, fjern SEA fra cannulation pipette, og løft pipette ut av disseksjon parabolen.
- Skjær SEA i mindre segmenter hver 1-3 mm i lengde. Disse kortere segmenter lette isolering av endotelceller rør.
4. Isolasjon av endotel Tube
- Fyll en 12 mm x 75 mm glass kulture tube halvveis med iskald disseksjon buffer. Bruke vinklet pinsett, overføre arterielle stykker i kulturen røret og legg på is. På dette tidspunkt, kombiner fordøyelse med enzymene Dissosiasjon buffer til et sluttvolum på 1 ml i en separat 12 mm x 75 mm kultur-rør (se 1.3.2 Solutions) og forvarme oppløsningen til 37 ° C med en varmeblokk.
- Mens dissosiasjon buffer og enzymer blir varmet opp, omhyggelig suge disseksjon buffer fra dyrkningsrøret later et lite volum som inneholder kar-segmenter.
- Forsiktig legge romtemperatur dissosiasjon buffer uten enzymer for å vaske bort gjenværende disseksjon buffer. Tip: Tilsett dissosiasjon buffer sakte slik at den arterielle stykker forblir på bunnen av kulturen røret for å spare tid venter for dem å omplassere. Hev buffer temperaturer over flere trinn fra is (4 ° C), til romtemperatur (~ 24 ° C) til 37 ° C for å minimalisere sjokk.
- Aspirer forsiktig dissociation buffer fra kultur tube, igjen å være sikker på å forlate et lite volum som inneholder skipssegmenter.
- Fjern forvarming dissosiasjon buffer med enzymer fra oppvarmingsblokken, overføre 1 ml av enzymløsningen til kulturrøret som inneholder kar-segmenter, og plasserer kulturen røret tilbake i varmeblokken. Inkuber ved 37 ° C i 30 min.
- I løpet av inkubasjonen med enzymene, forberede triturering pipette, fylle den med mineral-olje og fester den på en mikrosprøyte som er montert i en mikromanipulator. Deretter trekke en mikro stempelet for å fylle pipetten med to nl av dissosiasjon buffer og plassere pipettespissen over flyten kammeret.
- Ved slutten av den 30 min inkubering, fjernes kulturrøret fra varmeblokken og nøye suge buffer som ovenfor.
- Vask de arterielle segmenter med 4 ml romtemperatur dissosiasjon buffer. Merk: Det er ikke lenger nødvendig å holde fartøyet segmentene på bunnen av kulturen rør; forstyrre arterielle stykker faktisk bidrar til å sikre at gjenværende enzymer blir effektivt fjernet.
- Overføring ett fartøy segment til strømningskammeret ved forsiktig å aspirere den med en 1 ml mikropipette, og plassere den i strømningskammeret med 1 ml av dissosiasjon buffer.
- Utnytte mikromanipluatoren inneholder en mikro, plassere tuppen av trituration pipetten nær den ene enden av segmentet fartøy.
- Aspirer segment beholderen (500 nl trukket tilbake) i triturating pipette langsomt (225 nl / sek), for ikke å forårsake mekanisk påkjenning til ECS, og deretter mate den tilbake inn i kammeret. Hvis fordøyelsen var vellykket, vil den glatte muskelceller og adventitia være skilt fra endothelial tube.
- Gjenta triturering inntil alle glatte muskelceller blir dissosiert. Vær klar over at overdreven trituration (4x eller mer) kan skade egenkapitalbevis og gjengi dem svarer til agonister. Tips:ved hjelp av utgnidning pipette, beveger adventitia bort fra endotelial røret så snart som mulig for å holde den fra sammenfiltrings-røret. Merk: Ved hjelp av utgnidning pipette, kan den isolerte endotelial røret bli aspirert og overført til et separat kammer.
- Plasser endotelial røret i sentrum av strømnings-kammer, innrettet langs strømningsretningen, og fjern triturating pipette.
- Sikker låsing pipetter i micromanipulators montert i hver ende av flyten kammeret, og posisjonere sine tips på respektive ender av endothelial tube.
- Senk en låsing pipette over en ende av røret for å trykke den mot bunnen av kammeret. Plasser den andre pinning pipette på samme måte ved den motsatte enden av røret. Merk: Plassering av låsing pipetter er det en avveining mellom å feste røret (plassere dem lenger fra enden av røret), og slik at mer avbildning / eksperimentelle område (plassere dem nærmere den enden av røret). Finne them ~ 50 mikron fra hver ende av røret fungerer godt. På samme måte som låsing pipette ligger an mot røret, langsomt trekke den tilbake langs aksen av røret, for derved å utvide det til tilnærmet in vivo lengde og trykk på pipetten mot kammerets bunn for å feste røret.
- Begynn strømmen av superfusjons-løsning, og la endotelial røret for å hvile i minst 20 min for å ekvilibrere og holder seg (se figur 3C). Bruk en peristaltisk pumpe for å opprettholde konstant væskestrøm (superfusjons) på tvers av endotelial-røret. Merk: låsing pipetter kan fjernes når det endoteliale røret har levd opp til bunnen av strømningskammeret (~ 25 min), eller igjen på plass for å sikre at endothelial røret ikke komme ut av stilling.
5. Dye Lasting og Kalsium Imaging
- For å visualisere den intracellulære kalsium svar, laste endothelial tube med fluo-4 AM fargestoff ved romtemperatur (~ 24 ° C). Stopp væskestrømmen i badekaret, og legge fluo-4AM til kammeret ved en sluttkonsentrasjon på 10 uM. Vent i 10 min for å tillate at fargestoffet går inn i cellene, og deretter superfuse endothelial røret med ferskt PSS i 20 min for å sikre ekstracellulære fargestoff blir fjernet og at intracellulær fargestoffet er fullstendig de-esterifisering.
- Utfør kalsium bildebehandling. For dette arbeidet, en opprettstående mikroskop (se figur 2) er utstyrt med en roterende plate konfokal avbildningssystem ble brukt ved værelsestemperatur. Opphisse fluorescerende kalsium fargestoff med en 491 nm laser og hente bilder (ved 500-550 nm utslipp) ved hjelp av en intensivert digitalkamera.
Representative Results
Kalsium responser kan bli igangsatt i nylig isolerte endothelial rør ved hjelp av acetylkolin (ACH). I denne filmen, er en endothelial tube lastet med 10 mikrometer fluo-4 AM stimulert med super av en mikrometer ACH (Movie 1). Klikk her for å se filmen . Fargestoffet er spent på 491 nm og utslipp er registrert 500-550 nm ved hjelp av en intensivert charge-coupled device kamera. Bildestakker er kjøpt til 120 bilder / sek for en 25 sek periode, og kan da bli i gjennomsnitt (for eksempel til 40 bilder / sek). Representative fluorescens bilder over tid er vist i figur 4..
Figur 1. Flow kammer og pipetter brukt under isolering av endothelial rør. A) Strømnings kammer sammen med en 24 mm x 50 mm glass dekkglass som base. B) Eksempler på en trakk (til venstre) og et trukket, knust, polert og vinklet (høyre) kanylering pipette. Denne pipette brukes til å spyle erytrocytter fra hulrommet i arterien etter disseksjon. Scale bar = 200 mikrometer. C) Eksempler på en trakk (til venstre) og en trakk, ødelagt og polert (høyre) trituration pipette. Den innvendige diameter av denne pipette er bestemt av den utvendige diameter av arterien. Scale bar = 200 mikrometer. D) Eksempler på en trakk (til venstre) og en trakk, ødelagt og polert (høyre) låsing pipette. Spissen av denne pipette blir avrundet og helt lukket, for å sikre endotelial røret i strømningskammeret. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Spinning plate konfokal mikroskop for avbildning av Ca 2 +-signaler. A) stammen mikroskop benyttet for kalsium-avbildning. B) (a) Confocal roterende skiveenhet med et (b) forsterket charge coupled device kamera. C) Immersion mål (a) 63x ( NA = 1) og (b) 20X (NA = 0,5) brukes til bildebehandling. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Isolering av den abdominale muskulatur og overlegen epigastriske arterie. A (dvs. hvor fartøyene skal ligatisert). Scale bar = 1 cm. B) Isolert magemuskelen (ensidig) og SEA festet ut i en disseksjon kammer for microdissection. Rød pil viser den første store bifurkasjon området av SEA (dvs. det punkt hvor rensing av karet er stanset). Scale bar = 1 cm. C) Isolert endotelceller rør fra en SEA. Differensial forstyrrelser kontrastbilde av en endotelial røret etter 1 time inkubering ved romtemperatur. Den endotel-røret ble superfuseres med superfusjons-buffer ved 3 ml / min. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Kalsium fluorescens i en endotelceller tube. Representative fluorescerende bilder av en endotelial røret i respons til stimulering med 1 mM acetylkolin. A) Fluorescens før stimulering. B) endotelial røret fluorescens ved acetylcholin administrering, t = 0 sek. C) endotelial røret fluorescens ved t = 5 sek. D) endotelial røret fluorescens ved t = 10 sek. E) endotelial røret fluorescens ved t = 15 sek. F) endotelial røret fluorescens ved t = 20 sek. Scale barer = 40 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Discussion
Her beskriver vi isolering av endothelial rør fra havet og bruk av dette preparatet å visualisere Ca 2 + signal hendelser innenfor sitt konstituerende egenkapitalbevis. Denne fremgangsmåten ble tilpasset fra en opprinnelig utviklet for å isolere endoteliale rør fra arterioler i hamster cremaster muskel 8.. Utnytte mindre variasjoner av de teknikkene som presenteres her, har vi isolert endothelial rør fra en rekke vaskulære senger, inkludert: fôr arteriene i hamster retractor muskel og kinnet posen arterioles 10, mus overlegen magesekkens arterien 6,7,9, mus mesenteric og cerebral arterier og lymfatiske microvessels (upubliserte observasjoner; referanser er inkludert for å isolere mesenteric fartøy 12 og cerebral fartøy 13). Isolere endothelial rør fra nye vaskulære senger kan kreve endringer i den opprinnelige protokollen. Hvis isolasjon er mislykket, er det best å begynne med å forandre fordøyelsen ganger:Øk fordøyelsen tid hvis endoteliale rør er vanskelig å isolere fra glatte muskelceller og adventitia og redusere fordøyelsen tid hvis endotelial røret ikke forblir intakt. Hvis forandre fordøyelsen ganger er mislykket, bør justere konsentrasjonen av fordøyelsesenzymer eller fordøyelsen temperaturen være prøvd. Et annet alternativ er å redusere den indre diameter av triturering pipette, noe som øker skjærkraften ved fjerning av glatte muskelceller. Økning av hastigheten av fluid utstøting kan også prøves på den samme effekten, men er mer sannsynlig å skade preparatet. Det bør erkjennes at det ikke kan være mulig å isolere intakt endotel-rør fra fartøy hvor endotelceller ikke er godt forbundet med hverandre ved junksjonale proteiner.
Dissosiasjon av glatte muskelceller etter enzymatisk fordøyelse ble opprinnelig utført ved hjelp av en hånd-stil pipettor åtte. Vi har videreutviklet trituration prosedyren ved hjelp av en microsyringe-system, som har gjort det mulig jevn isolasjon over lengre endoteliale rør (opp til 3 mm), 6. Ved bruk av dette system, er triturering pipetten fylt igjen med mineralolje for å gi en kontinuerlig fluidkolonne mellom stempelet styring av fluidbevegelse og PSS inneholdende segmentet fartøyet. Den incompressibility av væske sammen med den konstante drivkraft av en mikrostempel resulterer i konstant skjærkraft som fartøyet er tvunget inn i pipettespissen. I motsetning til dette håndteknikker som ofte brukes for å dissosiere celler (f.eks klemme gummipære ved enden av en Pasteur-pipette) omfatter komprimering av luft, som innfører variasjoner i den drivende trykk og derved skjærkraft som utøves på pipettespissen.
Det er flere fordeler med å røret forberedelse for å studere endotelfunksjon i microvessels. Den første er at isolasjon prosessen gir distinkte homogene innfødte cellulære bestander av egenkapitalbevis og glatt muscle celler. Siden egenkapitalbevis være fysisk tilkoblet som rør, de er forskjellig fra individuelle glatte muskelceller, som beholder en "C"-konfigurasjon hvis de forblir avslappet under utgnidning. Dermed respektive celletyper er lett skilles, for eksempel ved å skaffe prøver for molekylære teknikker som real-time PCR og immunhistokjemi 10. Siden flere rør er isolert fra en enkelt fartøy (eller fra bilaterale fartøy som på SEA), kan molekylære data og funksjonelle data hentes fra samme fartøy av en gitt dyret. Således molekyl uttrykket kan være korrelert med den funksjonelle virkemåten til mikrovaskulær endothelium. Videre kan både intra-og intersignal hendelser iboende til mikrovaskulær endotelet løses uavhengig av påvirkning av hemodynamiske krefter (trykk, flyt), vasoaktive midler gjennomført i blodet (f.eks hormoner), eller fra omkringliggende glatte muskelceller (f.eks60; via myoendothelial kopling 14-16), nerver 17, eller vev parenchyma 18.
Viktigere, ettersom endotelet er ferskt isolert fra angitte microvessels, er det ingen forandring av fenotype som ellers er forbundet med dyrkning EKB 19-21. For eksempel dyrkede EKB mister muskarine reseptor ekspresjon og derved endre deres kalsium signalprofiler. Videre kan elektrofysiologiske egenskapene til egenkapitalbevis skifte i kultur 22. Fordi enkelte egenkapitalbevis forbli koblet gjennom funksjonelle gap junction kanaler, presenterer endothelial tube en ideell modell for å studere conduction av elektriske og Ca 2 +-signaler mellom cellene 6,7. Det bør også anerkjennes at de dissosierte glatte muskelceller kan lett undersøkt med patch-clamp-teknikker for komplementære data underliggende mikrovaskulær funksjon 23..
En viktig begrensning for endotelial røret mOdel er ustabilitet i forberedelse med økende temperatur. Mens våre forberedelser fra SEA har vist seg stabil og sunn ved værelsestemperatur (~ 24 ° C), og i flere timer ved 32 ° C, oppstår morfologisk og funksjonell nedbrytning i mindre enn en time ved 37 ° C 9. En andre viktig begrensning av endotelial røret er tapet av myoendothelial knutepunkter og deres iboende signal domener som er integrert i EC-funksjonen i intakt åreveggen 14-16. Det bør også anerkjennes at selv om lengre rør aktivere intracellulære signalisering som skal studert over relativt store avstander 6, fremstilling av rør er komplisert ettersom de blir lengre, fordi det blir mer vanskelig å fullt ut dissosiere omgir glatte muskelceller og adventitia. Det er funnet at rør som er lengre enn 1-2 mm er også vanskeligere å plassere og feste i strømningskammeret. I kontrast, mens kortere rør (for eksempel <1 mm) enaBLE Ca 2 + og elektriske signaler som skal studeres 8, er de vanskelig å opprettholde i løpet av superfusjons i strømningskammeret. Til slutt, selv med en optimal isolasjon av rør bilateralt, det er for lite materiale for tradisjonelle kvantifisering av protein ekspresjon ved hjelp av Western-blots, skjønt immunolabeling gir en indeks av proteinekspresjon og lokalisering. Til tross for slike begrensninger, endothelial røret representerer en ny forberedelse til å gi ny innsikt i mekanismene for mikrovaskulær endotelceller funksjon in vivo.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Pooneh Bagher og Dr. Erika Westcott for redaksjonelle kommentarer i utarbeidelsen av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health i henhold til tildelings tall R37-HL041026 og R01-HL086483 til SSS og F32-HL107050 til MJS. Dette innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al.
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
