Vi presenterer en forberedelse til å visualisere og manipulere kalsium signalisering i native, intakt microvascular endotelet. Endothelial rør fersk isolert fra mus motstand arteriene som forsyner muskulatur beholde in vivo morfologi og dynamisk signal innenfor og mellom nabocellene. Endoteliale rør kan fremstilles fra microvessels av andre vev og organer.
Kontrollen av blodstrømmen ved motstanden vaskulaturen regulerer tilførsel av oksygen og næringsstoffer samtidig med fjerning av metabolske biprodukter, som eksemplifisert ved å utøve skjelettmuskel. Endoteliale celler (ECS) linje intima av alle motstands fartøy og tjener en sentral rolle i å kontrollere diameter (f.eks endotelium-avhengig vasodilatasjon) og derved, størrelse og fordeling av vev blodstrøm. Reguleringen av vaskulær motstand av ECS bevirkes ved intracellulær Ca 2 +-signalering, noe som fører til produksjon av diffunderbare autacoids (f.eks nitrogenoksid og arakidonsyre-metabolitter) 1-3 og hyperpolarisering 4,5 som fremkaller glattmuskelcellet avslapning. Dermed forstå dynamikken i endothelial Ca 2 + signalering er et viktig skritt mot å forstå mekanismene som styrer blodstrømmen kontroll. Isolere endothelial rør eliminerer konfunderende variabler knyttet til blood i fartøyet lumen og med omkringliggende glatte muskelceller og perivaskulær nerver, noe som ellers påvirker EC struktur og funksjon. Her presenterer vi isolering av endothelial rør fra den overlegne magesekkens arterien (SEA) ved hjelp av en protokoll optimalisert for dette fartøyet.
For å isolere endoteliale rør fra en bedøvet mus, er SEA ligert in situ for å opprettholde blod innenfor fartøyet lumen (for å lette visualisere det under disseksjonen), og hele ark av abdominal muskel er utskåret. Havet er dissekert fri fra omkringliggende skjelettmuskelfibre og bindevev, blod skylles ut av lumen, og mild enzymatisk fordøyelse er utført for å muliggjøre fjerning av adventitia, nerver og glatte muskelceller som bruker milde trituration. Disse nylig isolerte preparater av intakt endotel beholde sin opprinnelige morfologi, med individuelle EKB gjenværende funksjonsmessig koblet til hverandre, i stand til å overføre kjemisk og elektrisk SIsignalene intercellularly gjennom gap veikryss 6,7. I tillegg til å gi ny innsikt i kalsium signalering og membran biofysikk, disse preparatene aktivere molekylære studier av genekspresjon og proteiner lokalisering innenfor innfødte mikrovaskulær endotelet.
I denne protokollen beskriver vi isolering av endotelcelle rør fra muse SEA. SEA oppstår fra den interne thorax arterie og leverer oksygenrikt blod til fremre abdominal muskulaturen. Vårt arbeidsmiljø med havet som en modell kan tilskrives det gir relativt lange, unbranched microvessel segmenter som er godt egnet for å studere intercellulær signal hendelser underliggende rolle endotelet i styrende og koordinerende glattmuskelcellet avslapping. For de som er interessert i andre enn skjelettmuskulatur vev, har vi funnet denne teknikken til å være lett tilpasses for å skaffe endothelial rør fra microvessels av hjernen, tarmen og lymfesystemet.
De viktigste funksjonene i denne metoden er at intakte lengder (1-3 mm) av mikrovaskulær endotelet er isolert, sikret mot et glass dekkglass i en flyt kammer der de er superfuseres med PSS, og avbildes for Ca 2 + signaliserer 7-9 ellerspiddet for elektriske signal 6,8. Innenfor strømningskammeret, er den øvre halvdel av et rør som utsettes for superfusjons-løsning og reagerer på eksperimentelle inngrep, mens den nedre halvdel (i kontakt med dekkglass) er beskyttet og forblir stillestående. I tillegg til å studere både intra-og inter Ca 2 + signal hendelser, kan endothelial rør brukes for kvantitativ real-time PCR for å vurdere genuttrykk 6,10, immunhistokjemi å undersøke protein uttrykk 6,10, og elektrofysiologiske studier for å definere biofysiske egenskaper av elektrisk ledning 6,11.
Det er flere fordeler med den endoteliale røret forberedelse for å studere endotelial funksjon. Det første er at isoleringsprosessen er en enkel skille mellom to cellepopulasjoner: endoteliale celler (som forblir i røret dannelse) og glatte muskelceller (individuelt dissosiert, vanligvis "C"-formet nåravslappet). Dette gir mulighet for selektiv prøvetaking og undersøkelse av unike egenskaper underliggende respektive celler 'bidrag til fartøy funksjon. For det andre kan denne modellen oppløsningen på signaleringshendelser iboende til endotelet, uavhengig påvirkning av blodstrømmen, omgir glatte muskler, nerver, og parenchyma. For det tredje er den endotel undersøkt mens ferskt isolert, for derved å unngå forandringer i gen eller protein ekspresjon i forbindelse med cellekultur.
Her beskriver vi isolering av endothelial rør fra havet og bruk av dette preparatet å visualisere Ca 2 + signal hendelser innenfor sitt konstituerende egenkapitalbevis. Denne fremgangsmåten ble tilpasset fra en opprinnelig utviklet for å isolere endoteliale rør fra arterioler i hamster cremaster muskel 8.. Utnytte mindre variasjoner av de teknikkene som presenteres her, har vi isolert endothelial rør fra en rekke vaskulære senger, inkludert: fôr arteriene i hamster retractor muskel og kinnet posen arterioles 10, mus overlegen magesekkens arterien 6,7,9, mus mesenteric og cerebral arterier og lymfatiske microvessels (upubliserte observasjoner; referanser er inkludert for å isolere mesenteric fartøy 12 og cerebral fartøy 13). Isolere endothelial rør fra nye vaskulære senger kan kreve endringer i den opprinnelige protokollen. Hvis isolasjon er mislykket, er det best å begynne med å forandre fordøyelsen ganger:Øk fordøyelsen tid hvis endoteliale rør er vanskelig å isolere fra glatte muskelceller og adventitia og redusere fordøyelsen tid hvis endotelial røret ikke forblir intakt. Hvis forandre fordøyelsen ganger er mislykket, bør justere konsentrasjonen av fordøyelsesenzymer eller fordøyelsen temperaturen være prøvd. Et annet alternativ er å redusere den indre diameter av triturering pipette, noe som øker skjærkraften ved fjerning av glatte muskelceller. Økning av hastigheten av fluid utstøting kan også prøves på den samme effekten, men er mer sannsynlig å skade preparatet. Det bør erkjennes at det ikke kan være mulig å isolere intakt endotel-rør fra fartøy hvor endotelceller ikke er godt forbundet med hverandre ved junksjonale proteiner.
Dissosiasjon av glatte muskelceller etter enzymatisk fordøyelse ble opprinnelig utført ved hjelp av en hånd-stil pipettor åtte. Vi har videreutviklet trituration prosedyren ved hjelp av en microsyringe-system, som har gjort det mulig jevn isolasjon over lengre endoteliale rør (opp til 3 mm), 6. Ved bruk av dette system, er triturering pipetten fylt igjen med mineralolje for å gi en kontinuerlig fluidkolonne mellom stempelet styring av fluidbevegelse og PSS inneholdende segmentet fartøyet. Den incompressibility av væske sammen med den konstante drivkraft av en mikrostempel resulterer i konstant skjærkraft som fartøyet er tvunget inn i pipettespissen. I motsetning til dette håndteknikker som ofte brukes for å dissosiere celler (f.eks klemme gummipære ved enden av en Pasteur-pipette) omfatter komprimering av luft, som innfører variasjoner i den drivende trykk og derved skjærkraft som utøves på pipettespissen.
Det er flere fordeler med å røret forberedelse for å studere endotelfunksjon i microvessels. Den første er at isolasjon prosessen gir distinkte homogene innfødte cellulære bestander av egenkapitalbevis og glatt muscle celler. Siden egenkapitalbevis være fysisk tilkoblet som rør, de er forskjellig fra individuelle glatte muskelceller, som beholder en "C"-konfigurasjon hvis de forblir avslappet under utgnidning. Dermed respektive celletyper er lett skilles, for eksempel ved å skaffe prøver for molekylære teknikker som real-time PCR og immunhistokjemi 10. Siden flere rør er isolert fra en enkelt fartøy (eller fra bilaterale fartøy som på SEA), kan molekylære data og funksjonelle data hentes fra samme fartøy av en gitt dyret. Således molekyl uttrykket kan være korrelert med den funksjonelle virkemåten til mikrovaskulær endothelium. Videre kan både intra-og intersignal hendelser iboende til mikrovaskulær endotelet løses uavhengig av påvirkning av hemodynamiske krefter (trykk, flyt), vasoaktive midler gjennomført i blodet (f.eks hormoner), eller fra omkringliggende glatte muskelceller (f.eks60; via myoendothelial kopling 14-16), nerver 17, eller vev parenchyma 18.
Viktigere, ettersom endotelet er ferskt isolert fra angitte microvessels, er det ingen forandring av fenotype som ellers er forbundet med dyrkning EKB 19-21. For eksempel dyrkede EKB mister muskarine reseptor ekspresjon og derved endre deres kalsium signalprofiler. Videre kan elektrofysiologiske egenskapene til egenkapitalbevis skifte i kultur 22. Fordi enkelte egenkapitalbevis forbli koblet gjennom funksjonelle gap junction kanaler, presenterer endothelial tube en ideell modell for å studere conduction av elektriske og Ca 2 +-signaler mellom cellene 6,7. Det bør også anerkjennes at de dissosierte glatte muskelceller kan lett undersøkt med patch-clamp-teknikker for komplementære data underliggende mikrovaskulær funksjon 23..
En viktig begrensning for endotelial røret mOdel er ustabilitet i forberedelse med økende temperatur. Mens våre forberedelser fra SEA har vist seg stabil og sunn ved værelsestemperatur (~ 24 ° C), og i flere timer ved 32 ° C, oppstår morfologisk og funksjonell nedbrytning i mindre enn en time ved 37 ° C 9. En andre viktig begrensning av endotelial røret er tapet av myoendothelial knutepunkter og deres iboende signal domener som er integrert i EC-funksjonen i intakt åreveggen 14-16. Det bør også anerkjennes at selv om lengre rør aktivere intracellulære signalisering som skal studert over relativt store avstander 6, fremstilling av rør er komplisert ettersom de blir lengre, fordi det blir mer vanskelig å fullt ut dissosiere omgir glatte muskelceller og adventitia. Det er funnet at rør som er lengre enn 1-2 mm er også vanskeligere å plassere og feste i strømningskammeret. I kontrast, mens kortere rør (for eksempel <1 mm) enaBLE Ca 2 + og elektriske signaler som skal studeres 8, er de vanskelig å opprettholde i løpet av superfusjons i strømningskammeret. Til slutt, selv med en optimal isolasjon av rør bilateralt, det er for lite materiale for tradisjonelle kvantifisering av protein ekspresjon ved hjelp av Western-blots, skjønt immunolabeling gir en indeks av proteinekspresjon og lokalisering. Til tross for slike begrensninger, endothelial røret representerer en ny forberedelse til å gi ny innsikt i mekanismene for mikrovaskulær endotelceller funksjon in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Pooneh Bagher og Dr. Erika Westcott for redaksjonelle kommentarer i utarbeidelsen av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health i henhold til tildelings tall R37-HL041026 og R01-HL086483 til SSS og F32-HL107050 til MJS. Dette innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.
Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
Papain | Sigma | P-4762 | |
Collagenase | Sigma | C-8051 | |
Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
Sylgard | Dow Corning | 184 | |
Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |