Summary
Nós apresentamos uma preparação para a visualização e manipulação de sinalização do cálcio em nativa, endotélio microvascular intacta. Tubos endoteliais recém isolado das artérias de resistência do mouse fornecendo músculo esquelético manter vivo na morfologia e sinalização dinâmica dentro e entre as células vizinhas. Tubos endoteliais pode ser preparado a partir de microvasos de outros tecidos e órgãos.
Abstract
O controle do fluxo sanguíneo pela vascularização resistência regula o fornecimento de oxigênio e nutrientes concomitante com a remoção de subprodutos metabólicos, como exemplificado pelo exercício do músculo esquelético. Células endoteliais (ECs) alinhar a íntima de todos os vasos de resistência e têm um papel importante no controle de diâmetro (por exemplo, a vasodilatação dependente do endotélio) e, desse modo, a magnitude e distribuição do fluxo de sangue no tecido. A regulação da resistência vascular por ECs é efectuada por Ca 2 + intracelular de sinalização, o que leva à produção de autacóides difusíveis (por exemplo, óxido nítrico e os metabolitos do ácido araquidónico) 1-3 e hiperpolarização 4,5 que provocam relaxamento das células do músculo liso. Assim, a compreensão da dinâmica de endotelial Ca 2 + sinalização é um passo fundamental para a compreensão dos mecanismos que regem o controle de fluxo de sangue. Isolar os tubos endoteliais elimina variáveis de confusão associados com blood no lúmen do vaso e com áreas células musculares lisas e nervos perivasculares, que de outra forma influenciam a estrutura e função da CE. Aqui apresentamos o isolamento de tubos endoteliais da artéria epigástrica superior (SEA), utilizando um protocolo otimizado para este vaso.
Para isolar os tubos endoteliais de um rato anestesiado, o mar é ligado in situ para manter o sangue dentro do lúmen do vaso (para facilitar a visualização durante a dissecção), e toda a folha de músculo abdominal é extirpado. O mar é dissecado livre de que envolve as fibras musculares esqueléticas e do tecido conjuntivo, o sangue é liberado do lúmen, e digestão enzimática suave é realizada para permitir a remoção da adventícia, nervos e células musculares lisas utilizando trituração suave. Estas preparações recém-isoladas de endotélio intacto mantêm a sua morfologia nativa, com CEs indivíduo permanecendo funcionalmente acoplados um ao outro, capaz de transferir química e Si eléctricosgnals intercellularly através de junções 6,7. Além de oferecer uma nova visão sobre sinalização de cálcio e de membrana biofísica, estas preparações permitir estudos moleculares da expressão gênica e localização de proteínas dentro endotélio microvascular nativa.
Introduction
Neste protocolo, descrevemos o isolamento de tubos de células endoteliais do mar mouse. A AAE surge da artéria torácica e suprimentos sangue oxigenado interno para a musculatura abdominal anterior. Nosso trabalho com o mar como um modelo pode ser atribuído a ele, proporcionando segmentos microvasos não ramificados relativamente longos que estão bem adaptados para o estudo de eventos de sinalização intracelulares subjacentes ao papel do endotélio em governar e coordenar o relaxamento das células musculares lisas. Para os interessados em diferentes tecidos do músculo esquelético, descobrimos esta técnica para ser facilmente adaptado para a obtenção de tubos endoteliais de microvasos de cérebro, intestino e do sistema linfático.
As principais características deste método são que extensões intactas (1-3 mm) de endotélio microvascular são isolados, garantidos contra uma lamela de vidro em uma câmara de fluxo em que são superfundidos com PSS, e fotografada por Ca 2 + sinalização 7-9 ouempalado por 6,8 sinalização elétrica. Dentro da câmara de escoamento, a metade superior de um tubo é exposto à solução de superfusão e responde à intervenção experimental, enquanto que a metade inferior (em contacto com a lamela) é protegida e permaneça em repouso. Além de estudar tanto de Ca 2 + os eventos de sinalização intra e intercelular, tubos endoteliais pode ser usado para quantitativa PCR em tempo real para avaliar a expressão do gene 6,10, imuno-histoquímica para investigar a expressão da proteína 6,10, e os estudos electrofisiológicos para definir as propriedades biofísicas de 6,11 a condução elétrica.
Existem várias vantagens para a preparação tubo endotelial para o estudo da função endotelial. Em primeiro lugar é que o processo de isolamento proporciona uma distinção simples entre duas populações de células: células endoteliais (que permanecem na formação do tubo) e de células do músculo liso (dissociada individualmente; tipicamente "C" em forma quandorelaxado). Isto permite a amostragem seletiva e estudo das propriedades únicas subjacentes contribuição respectivas células para a função dos vasos. Em segundo lugar, este modelo permite a resolução de eventos de sinalização intrínseca para o endotélio, independentemente da influência do fluxo de sangue, no músculo liso, os nervos, e parênquima. Em terceiro lugar, o endotélio é estudada enquanto recentemente isolada, evitando assim alterações na expressão do gene ou a proteína associada à cultura de células.
Protocol
1. Preparação do Equipamento: Fluxo de Câmara, pipetas e Soluções
- Fluxo de câmara: Usar uma câmara de fluxo, com um de 24 x 50 mm lamela de vidro na parte inferior para os tubos superfuse endoteliais isoladas (ver Figura 1A). Antes de montar a câmara, lavar as lamelas de vidro com ambos 3% HCl e 70% de etanol, lave com água ultrapura, e seque com gás nitrogênio.
- Pipettes: Três tipos diferentes de pipetas são utilizadas durante o protocolo: punção, trituração e pinagem. Tanto a canulação e pipetas de imobilização pode ser feito antes do dia da experiência, mas a pipeta trituração devem ser feitas no dia de, uma vez que requer o conhecimento do diâmetro do recipiente com o tamanho do lúmen apropriadamente.
- Pipetas de punção: Para liberar as células vermelhas do sangue a partir do lúmen, puxe tubos capilares de vidro de borosilicato usando um extrator micropipeta ter extremidades afiladas, longas. Quebre as pontas com uma pinça para um diâmetro externo ~ 30% less do que a das artérias (~ 50-80 um), e fogo polonês ponta para ser lisa (ver Figura 1B). É útil também ângulo das pontas das pipetas de aproximadamente 45 °.
- Pipetas trituração: dissociar mecanicamente as células do músculo liso e adventícia dos tubos endoteliais, fazem pipetas trituração de tubos capilares de vidro de borosilicato. Preparar tubos capilares, como acima, e quebrar a extremidade com uma pinça. Dica: Usar um dispositivo de dobragem de vidro para torná-lo mais fácil de quebrar a parede mais espessa do vidro trituração pipeta limpa. Quebrar a pipeta para o diâmetro interno determinado no dia da experiência, cerca de 10-20 mM maior do que o diâmetro exterior do recipiente a partir do qual os tubos endoteliais será isolado. Polonês Fogo as pontas quebradas até ficar homogêneo (Figura 1C).
- Fixando pipetas: Para estabilizar o tubo endotelial dentro da câmara de fluxo, faça fixando pipetas para garantir a endotelial tUBE contra o fundo lamela da câmara. Retire os tubos capilares de vidro da mesma maneira como as pipetas de canulação. Em seguida, quebrar as pontas com uma pinça para um diâmetro de ~ 100 mm, e polonês fogo até que as pontas são selados, arredondada e lisa (Figura 1D). Nota: Se a ponta da pipeta fixar não é completamente fechada, o fluido entra no lúmen e pode confundir os resultados experimentais.
- Soluções: Preparar todas as soluções em ultrapura (18,2 mohms) H 2 O e esterilizá-los através de um filtro de 0,2 um. Certifique-se que a pressão osmótica das soluções é entre 285-300 mOsm. Soluções permanecem boas durante cerca de duas semanas, quando armazenado a 4 ° C.
- Solução de dissecção: A solução de sal utilizada durante a dissecção da artéria epigástrica superior é composta por (em mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfónico ( HEPES), 10 de glucose, 0,01 o nitroprussiato de sódio (SNP), umd 0,1% albumina de soro bovino (BSA) com um pH de 7,4. O doador SNP NO é incluído para ajudar a relaxar células musculares lisas, tornando-os mais fáceis de canular a artéria e para facilitar a remoção de células de músculo liso durante a trituração.
- Solução de dissociação: A solução de sal utilizada durante a dissociação do tubo endotelial é composta por (em mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose, 2 de CaCl2, e 0,1% de BSA, com um pH de 7,4. A uma alíquota de 1 ml deste tampão, adicionar: papaína 0,62 mg / ml, 1,5 mg / ml de colagenase e de 1,0 mg / ml ditioeritritol. Desde que as enzimas de diferentes fornecedores podem ter diferentes níveis de atividade enzimática, os números dos produtos daqueles utilizados para este trabalho estão incluídas para referência na tabela de materiais. Nota: Durante o protocolo tanto tampão de dissociação e tampão de dissociação com enzimas são utilizadas em diferentes etapas.
- Superfusão solução: A solução salina fisiológica (PSS) usado para superfusing o tubo endotelial isolado é composto por (em mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose e 2 CaCl 2, com um pH de 7,4.
- Prepare tampões e soluções antes de iniciar os procedimentos cirúrgicos. Retirar as soluções a partir de 4 ° C, e alíquota de 50 ml de tampão de dissecção para um balão de Erlenmeyer de 200 ml e colocá-lo em gelo. Além disso, a alíquota de 50 ml de dissociação tampão sem enzimas e coloque-o na bancada para atingir a temperatura ambiente. Remover a solução de superfusão de 4 ° C e deixar equilibrar à temperatura ambiente na bancada.
2. Preparação animal
Certifique-se de que todos os procedimentos e protocolos envolvendo animais estão de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê da Universidade do Animal Care e UseMissouri.
- Use masculino ou camundongos fêmeas pelo menos 9 semanas de idade e estudar cada um individualmente. Anestesiar um rato com pentobarbital sódico (60 mg / kg) por via intraperitoneal (ip) de injecção. Dica: Diluir o pentobarbital a 10 mg / ml em soro fisiológico estéril antes da injecção reduz a possibilidade de sobredosagem.
- Anestesia compromete a regulação da temperatura, de modo a manter o mouse aquecer imediatamente após a primeira injeção de pentobarbital. Usando um suporte metálico (cesta de alumínio ventilado) no topo de uma placa de aquecimento (calibrado para ~ 37 ° C) funciona bem para manter a temperatura do rato estável. Como alternativa, use uma lâmpada de calor, tendo o cuidado de posicioná-lo a uma distância apropriada do mouse. Monitorar o mouse cada 5-10 min até que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de retirada aos pés ou cauda pitada). Uma dose suplementar pode ser requerido depois de 15-20 minutos. É melhor ir devagar e com cuidado para evitar overdose, especialmente com obesos, idosos, ou animals de outro modo estressado.
- Remova o cabelo do lado ventral com cuidado raspar ele com pequenos cortar cabelo pet. Deve ser prestada especial atenção para evitar trauma ao animal. É útil para remover todos os pêlos de uma área que abrange as axilas para a área pubiana. Remova qualquer cabelo solto apego com um cotonete fresco álcool.
- Posicione o mouse sobre as suas costas, deitando-se com os dois frente-e membros posteriores espalhados expor tanto da parede abdominal possível. Se necessário, use fita de laboratório para garantir as pernas de uma forma spread-águia.
3. Isolamento da Artéria epigástrica Superior
- Fazer uma pequena incisão através da pele logo acima da área da região púbica. Certifique-se que apenas a pele está sendo cortado, evitando danos ao músculo abdominal subjacente; estender a incisão lateral em cada direção para fora aos respectivos membros posteriores. Continuar a incisão rostralmente ao longo da linha média ventral para o topo da caixa torácica e don estender a incisão lateral em cada direção aos respectivos membros anteriores.
- Suavemente levantar a pele e utilize uma tesoura para cortar o tecido conjuntivo que prende a pele ao músculo subjacente, expondo assim toda a superfície da musculatura abdominal (ver Figura 3A). Irrigam o músculo exposta com uma solução de soro fisiológico a 0,9% temperatura ambiente.
- Devido ao pequeno tamanho da SEA, posicione o animal debaixo de um microscópio estereoscópico para outros procedimentos. Levantar a almofada de gordura localizada na parte inferior do esterno com uma pinça, e fazer uma incisão através dele. Continuar a incisão ao longo da costela inferior, tomando cuidado para não cortar profundamente o tecido subjacente. A AAE deve ser visível; tomar cuidado para não danificá-lo. Uma vez que a incisão é completa, irrigar o tecido exposto com uma solução salina a 0,9% temperatura ambiente.
- Após a camada superior do músculo esquelético foi retraída, a SEA eo músculo subjacente são facilmente identificados. Dica: Observe o comprimento doo SEA in vivo antes de isolar a estender tubos endoteliais (que encurtam ao longo de seu eixo no isolamento) para aproximar seu comprimento original. Utilizando uma pinça e tesouras, extirpar cuidadosamente a camada muscular fina debaixo do mar.
- Utilizando uma pinça em ângulo, passe um pedaço de seda 6-0 sutura debaixo do mar e ligar a artéria e sua veia adjacente para mantê-lo sob pressão e sangue retido no interior do lúmen do vaso para facilitar a visualização durante o isolamento e limpeza posterior.
- Repita o procedimento de ligadura SEA no lado contralateral.
- Uma vez que ambos os oceanos têm sido ligados, fazer uma incisão ao longo da linha média dos músculos abdominais para separar respectivos lados.
- Estender a incisão lateralmente em cada direcção tal como para a pele, em seguida, continuar a incisão na vertical ao longo da aresta exterior para separar completamente o músculo abdominal do corpo. Evite danos à vasculatura alimentado pela SEA para manter o lúmen pressurizados.
- Cut a SEA acima da ligadura para manter o selo, e coloque o músculo isolado e artéria em um copo de 50 ml contendo 10 ml de 4 ° C tampão dissecção.
- Repetir o procedimento para o outro lado do abdómen e incubar os tecidos no buffer de dissecção durante 10 min.
- Coloque o músculo abdominal contendo o mar em um (4 ° C) câmara de dissecção contendo tampão dissecção refrigerados (Figura 3B). A câmara de esvaziamento é constituído por uma placa de Petri com uma camada de Sylgard (polidimetilsiloxano [PDMS]) na parte inferior.
- Usando os pinos de insetos (0,15 mm), esticar a SEA isolado e músculo abdominal para aproximar in vivo comprimentos (citadas acima) e fixá-lo ao Sylgard. Dica: Orientando o músculo de tal forma que a fina camada de frente para o peritônio está no topo faz com que a SEA facilmente visível através de transiluminação.
- Utilizando instrumentos microdissection finas e trabalhando a partir do local a montante da ligação para oextremidade a jusante, limpar o mar de sua veia emparelhados eo tecido circundante até o primeiro site da filial de grande porte (1-2 cm). Então extirpar o SEA, cortando-um pouco acima do site da filial e, logo abaixo da ligadura.
- Para remover o sangue retido dentro do lúmen do vaso, canular a SEA e lave-o com um tampão de gelo dissecção fria. Usando um pedaço de tubo de silastic, prenda a extremidade traseira de uma pipeta de punção de uma seringa de 5 ml contendo tampão dissecção gelada e garantir a micropipeta em um micromanipulador para posicionar a ponta dentro da câmara de dissecção para canulação da SEA.
- Depois de todos os eritrócitos são lavadas para fora, retire o mar da pipeta de punção, e levante a pipeta para fora do prato dissecção.
- Corte a SEA em segmentos menores cada 1-3 mm de comprimento. Estes segmentos mais curtos facilitar o isolamento de tubos endoteliais.
4. Isolamento do tubo endotelial
- Encha um cult 12 milímetros x 75 milímetros de vidrona metade do tubo ure com tampão dissecção gelada. Utilizando uma pinça em ângulo, transfira os pedaços arteriais dentro do tubo de cultura e colocar no gelo. Neste momento, combinar as enzimas de digestão com tampão de dissociação para um volume final de 1 ml de uma de 12 mm x 75 milímetros tubo de cultura em separado (ver 1.3.2 Soluções) e pré-aquecer a solução a 37 ° C com um bloco de aquecimento.
- Enquanto o buffer de dissociação e enzimas estão se aquecendo, aspirar cuidadosamente o buffer de dissecção do tubo de cultura deixando um pequeno volume que contém os segmentos de navios.
- Delicadamente adicionar tampão de dissociação temperatura ambiente sem enzimas para lavar tampão dissecção restante. Dica: Adicionar o tampão de dissociação lenta de modo a que as peças arteriais permanecer na parte inferior do tubo de cultura para conservar o tempo de espera para que a reinstalação. Elevar a temperatura tampão ao longo de vários passos a partir de gelo (4 ° C), a temperatura ambiente (~ 24 ° C), a 37 ° C para minimizar o choque.
- Aspirar cuidadosamente o dissociation tampão do tubo de cultura, mais uma vez tendo a certeza de deixar um pequeno volume que contém os segmentos de navios.
- Remover o tampão de dissociação com enzimas pré-aquecimento do bloco de aquecimento, transferir os 1 ml de solução de enzima com o tubo de cultura contendo os segmentos do vaso, e colocar o tubo de cultura de volta ao bloco de aquecimento. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
- Durante a incubação com enzimas, preparar a pipeta de trituração, aterramento com óleo mineral e fixá-lo em uma micro que é montado em um micromanipulador. Em seguida, retirar o êmbolo microseringa para encher a pipeta com 2 nl de tampão de dissociação e posicionar a ponta da pipeta sobre a câmara de fluxo.
- No final da incubação de 30 minutos, retirar o tubo de cultura a partir do bloco de aquecimento e aspirar cuidadosamente o tampão como acima.
- Lave os segmentos arteriais com 4 ml de tampão de dissociação à temperatura ambiente. Nota: Não é mais necessário manter o segm navioentos no fundo do tubo de cultura; perturbar as peças arteriais efectivamente ajuda a assegurar que as enzimas residuais são eficazmente removidos.
- Transferência de um segmento de vaso para a câmara de fluxo por suavemente a aspiração com uma micropipeta 1 ml, e colocá-lo na câmara de fluxo de 1 ml do tampão de dissociação.
- Utilizando o micromanipulador que contém o micro-seringa, posicionar a ponta da pipeta de trituração perto de uma extremidade do segmento do vaso.
- Aspirar o segmento do vaso (500 nl retirado) para a pipeta de trituração lentamente (225 nl / seg), de modo a não causar tensão mecânica ao ECs, e, em seguida, o ejectar volta para dentro da câmara. Se a digestão foi bem sucedida, as células musculares lisas e adventícia será dissociado do tubo endotelial.
- Repetir a trituração até todas as células de músculo liso são dissociados. Esteja ciente de que a trituração excessiva (4x ou mais) podem danificar o ECs e torná-los sem resposta aos agonistas. Dica:utilizando a pipeta de trituração, mover a adventícia de distância a partir do tubo endotelial tão rapidamente quanto possível para evitar que o tubo de enredamento. Nota: Utilizando a pipeta de trituração, o tubo endotelial isolado pode ser aspirado e transferido para um recipiente em separado.
- Posicionar o tubo endotelial no centro da câmara de fluxo, alinhados ao longo da direcção de fluxo, e remover a pipeta trituração.
- Pipetas aprisionamento seguros em micromanipuladores montado em ambas as extremidades da câmara de escoamento, e posicionar as suas pontas, nas respectivas extremidades do tubo endotelial.
- Diminuir uma pipeta fixar sobre uma extremidade do tubo para pressioná-lo contra a parte inferior da câmara. Posicionar a segunda pipeta de pinagem, da mesma forma, na extremidade oposta do tubo. Observação: Colocação das pipetas aprisionamento é um trade-off entre fixar o tubo (colocando-os mais longe da extremidade do tubo) e permitindo uma maior imagem / área experimental (colocando-as mais perto da extremidade do tubo). Localizando tbainha ~ 50 mm a partir de cada extremidade do tubo funciona bem. Assim como a pipeta fixar toca o tubo, retirá-la lentamente, ao longo do eixo do tubo, alargando-o, assim, para aproximar in vivo comprimento e pressione a pipeta contra o fundo da câmara para fixar o tubo.
- Começar o fluxo de solução de superfusão, e permitir que o tubo endotelial em repouso durante pelo menos 20 minutos para equilibrar e aderir (ver Figura 3C). Utilizar uma bomba peristáltica para manter constante o fluxo de fluido (superfusão) através do tubo endotelial. Nota: pipetas Pinning pode ser removido uma vez que o tubo endotelial tenha aderido ao fundo da câmara de fluxo (~ 25 min) ou deixado no local para garantir que o tubo endotelial não ser desalojada.
5. Dye Carregando e Imagem de cálcio
- Para visualizar as respostas intracelulares de cálcio, carregar o tubo endotelial com fluo-4 AM corante à temperatura ambiente (~ 24 ° C). Parar o fluxo de fluido no banho, e adicionar 4-fluoAM para a câmara a uma concentração final de 10 uM. Esperar 10 min para permitir que o corante de entrar nas células, então superfuse o tubo endotelial com PSS fresco durante 20 minutos para assegurar corante extracelular é removido e que o corante intracelular foi totalmente des-esterificada.
- Realizar imagem de cálcio. Para este trabalho, um microscópio vertical (ver Figura 2) equipado com um sistema de imagem confocal de disco rotativo foi utilizado à temperatura ambiente. Excite o corante fluorescente de cálcio com um laser de 491 nm e aquisição de imagens (em 500-550 nm de emissão) usando uma câmera digital se intensificou.
Representative Results
As respostas de cálcio pode ser iniciada em tubos endoteliais isoladas de fresco utilizando a acetilcolina (ACh). Neste filme, um tubo endotelial carregado com 10 mM fluo-4 AM é estimulado com superfusão de 1 mM ACh (Filme 1). Clique aqui para ver filme . O corante é excitada a 491 nm e emissão é registada 500-550 nm utilizando uma câmara de dispositivo de carga acoplada intensificada. Pilhas de imagens são adquiridas em 120 frames / seg, por um período de 25 seg e pode, então, ser calculada a média (por exemplo, a 40 frames / seg.) Imagens de fluorescência representativos ao longo do tempo são mostrados na Figura 4.
Figura 1. Fluxo de câmara e pipetas utilizados durante o isolamento de tubos endoteliais. A) da câmara de fluxo montado com um 24 milímetros x 50 mm lamela de vidro como base. B) Exemplos de um puxado (esquerda) e um puxado, quebrado, polida e angular (à direita) pipeta de punção. Esta pipeta é usado para lavar os eritrócitos a partir do lúmen da artéria a seguir a dissecção. Escala bar = 200 m. C) Exemplos de um puxado (esquerda) e um puxado, quebrado e polido (direita) pipeta trituração. O diâmetro interno da pipeta é determinada pelo diâmetro exterior da artéria. D) Exemplos Barra de escala = 200 m. De um puxado (esquerda) e uma pipeta de direita) fixando puxado, quebrado e polido (. A ponta de pipeta esta é arredondada e completamente selada para prender o tubo endotelial na câmara de fluxo. Escala bar = 200 m. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Spinning disco microscópio confocal para imagens de Ca 2 + sinais. A) microscópio vertical usado para imagens de cálcio. B) (a) unidade de disco giratório confocal com um (b) intensificou carga câmera do dispositivo acoplado. C) objetivos Imersão (a) 63X ( NA = 1) e (b) 20X (NA = 0,5) utilizado para a geração de imagens. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. O isolamento do músculo abdominal e artéria epigástrica superior. Um (ou seja, onde os vasos devem ser ligados). Escala bar = 1 cm. B) músculo abdominal isolada (unilateral) e SEA preso em câmara dissecção para microdissecção. A seta vermelha indica o primeiro local principal bifurcação da ASE (isto é, o ponto em que a limpeza do recipiente está parado). Escala bar = 1 cm. C) tubo de células endoteliais isolada de uma AAE. Imagem de contraste de interferência diferencial de um tubo endotelial após 1 hora de incubação à temperatura ambiente. O tubo endotelial foi superfundidas com tampão de superfusão de 3 ml / min. Escala bar = 50 mm. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Fluorescência de cálcio em um tubo de células endoteliais. Imagens fluorescentes representativos de um tubo endotelial em resposta a estimulação com 1 uM de acetilcolina. D) fluorescência antes da estimulação. B) fluorescência tubo endotelial no momento da administração de acetilcolina, t = 0 seg. C) da fluorescência do tubo endotelial em t = 5 segundos. D) do tubo endotelial de fluorescência a t = 10 seg. E) Fluorescência tubo endotelial em t = 15 seg. F) fluorescência tubo endotelial em t = 20 seg. Barras de escala = 40 m. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Discussion
Aqui nós descrevemos o isolamento de tubos endoteliais do mar e da utilização desta preparação para visualizar Ca 2 + eventos de sinalização dentro de sua constitutiva ECs. Este processo foi adaptado a partir de um originalmente desenvolvido para isolar tubos endoteliais de arteríolas do músculo cremaster hamster 8. Utilizando pequenas variações das técnicas apresentadas aqui, nós isolamos tubos endoteliais de uma variedade de leitos vasculares, incluindo: artérias de alimentação do músculo retrator hamster e bochecha arteríolas bolsa 10, rato superiores artéria epigástrica 6,7,9, rato mesentérica e cerebral artérias e microvasos linfáticos (observações não publicadas; referências são incluídas para isolar os vasos mesentéricos 12 e vasos cerebrais 13). Isolar os tubos endoteliais dos novos leitos vasculares podem exigir modificações no protocolo original. Se o isolamento não for bem sucedida, é melhor começar por alterar tempos de digestão:Aumentar o tempo de digestão se tubos endoteliais são difíceis de isolar a partir de células musculares lisas e adventícia e reduzir o tempo de digestão, se o tubo endotelial não permanece intacta. Se alterar tempos de digestão não for bem sucedida, ajustando a concentração de enzimas de digestão ou a temperatura de digestão devem ser julgados. Uma outra opção é o de reduzir o diâmetro interno da pipeta trituração, o que aumenta a força de cisalhamento na remoção das células musculares lisas. Aumentando a velocidade de ejecção de fluido também pode ser tentado para o mesmo efeito, mas é mais provável para danificar a preparação. Deve reconhecer-se que pode não ser possível isolar tubos endoteliais intactas a partir de recipientes em que as células endoteliais não são assim ligados um ao outro por proteínas de junção.
A dissociação das células musculares lisas após digestão enzimática foi realizada inicialmente usando uma pipeta de estilo mão 8. Nós refinamos o processo de trituração utilizando um microsyrsistema inge, o que permitiu o isolamento consistente de tubos endoteliais mais longos (até 3 mm) 6. Ao utilizar este sistema, a pipeta de trituração é preenchido com óleo mineral para proporcionar uma coluna de fluido contínuo entre o êmbolo de controlar o movimento de fluido e PSS contendo o segmento do vaso. A incompressibilidade do fluido, juntamente com a força motriz constante do pistão resulta em micro-seringa de cisalhamento constante, como o navio é forçado através da ponta da pipeta. Em contraste, técnicas manuais frequentemente utilizadas para as células de dissociação (por exemplo, apertando bolbo de borracha na extremidade de uma pipeta de Pasteur) envolve a compressão de ar, que introduz variabilidade na pressão de condução e, por conseguinte, de cisalhamento exercida na ponta da pipeta.
Existem várias vantagens para a preparação de tubo para estudar a função endotelial em microvasos. A primeira é que o processo de isolamento fornece populações distintas homogêneos nativas celulares de ECs e mu suavecélulas LECSA. Desde o ECs permanecer conectado fisicamente como tubos, eles são distintos de células musculares lisas individuais, que retêm uma configuração "C" se eles permanecem relaxados durante a trituração. Assim respectivos tipos de células são facilmente distinguidos, por exemplo, quando a obtenção de amostras para técnicas moleculares, como a PCR em tempo real e imuno-histoquímica 10. Desde múltiplos tubos são isolados a partir de um único recipiente (ou a partir de navios bilaterais como feito para o SEA), dados moleculares e dados funcionais podem ser obtidos a partir dos mesmos vasos de um determinado animal. Assim, a expressão molecular pode estar correlacionado com o comportamento funcional do endotélio microvascular. Além disso, eventos, tanto intra e intercelulares sinalização intrínsecas ao endotélio microvascular pode ser resolvido independente da influência de forças hemodinâmicos (pressão, fluxo), agentes vasoativos transportados na corrente sanguínea (por exemplo, hormônios), ou de que cercam as células musculares lisas (eg60; via acoplamento mioendoteliais 14-16), os nervos 17, ou parênquima do tecido 18.
Importante, uma vez que o endotélio é isolada de fresco a partir de microvasos designados, não há alteração de fenótipo que é de outro modo associado com a cultura CEs 19-21. Por exemplo, ECs cultivadas perder a expressão do receptor e, assim, alterar muscarinic seus perfis de sinalização de cálcio. Além disso, propriedades eletrofisiológicas de ECs pode mudar na cultura 22. Porque CEs individuais permanecem acoplados através dos canais de junções de hiato funcionais, o tubo endotelial apresenta um modelo ideal para estudar a condução de sinais eléctricos 2 + e Ca entre células 6,7. Também deve-se reconhecer que as células musculares lisas dissociados são facilmente estudado com técnicas de patch-clamp para dados complementares subjacentes função microvascular 23.
Uma limitação fundamental para o tubo endotelial modelo é a instabilidade da preparação, com o aumento da temperatura. Enquanto as preparações do MAR provaram estável e saudável, à temperatura ambiente (~ 24 ° C) e durante várias horas a 32 ° C, a degradação morfológica e funcional ocorrer em menos de uma hora a 37 ° C 9. Uma segunda limitação importante do tubo endotelial é a perda de junções mioendoteliais e os seus domínios de sinalização inerentes que são essenciais para a função CE na parede do vaso intacto 14-16. Também deve-se reconhecer que, enquanto os tubos mais longos permitem sinalização intercelular a ser estudado ao longo relativamente grandes distâncias 6, a preparação de tubos é complicado, pois eles ficam mais longos, pois torna-se mais difícil dissociar completamente envolve as células musculares lisas e adventícia. Verificou-se que os tubos mais longos do que 1-2 mm são também mais difíceis de posicionar e fixar na câmara de fluxo. Em contraste, enquanto que os tubos mais curtos (por exemplo, <1 mm) enaCa 2 + e sinais eléctricos ble a ser estudados 8, eles são difíceis de manter durante a superfusão na câmara de fluxo. Finalmente, mesmo com o isolamento de tubos bilateralmente óptima, não há material suficiente para a quantificação da expressão da proteína tradicional utilizando Western blot, embora imunomarcação fornece um índice da expressão da proteína e da localização. Apesar dessas limitações, o tubo endotelial representa uma nova preparação para proporcionar uma nova visão sobre os mecanismos da função endotelial microvascular in vivo.
Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Pooneh Bagher e Dr. Erika Westcott para comentários editoriais na preparação do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Heart, Lung and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde, com os números de atribuição R37-R01-HL041026 e HL086483 de SSS e F32-HL107050 para MJS. Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
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