Denne fem-dagers protokollen skisserer alle trinn, utstyr, og supplerende programvare som er nødvendig for å skape og drive en effektiv endogen Escherichia coli basert TX-TL celle-fri ytring system fra bunnen av. Med reagenser, tar protokollen 8 timer eller mindre å sette opp en reaksjon, samle inn og behandle data.
Ideelle cellefrie ekspresjonssystemer kan teoretisk emulere en in vivo cellulær miljø på en kontrollert in vitro plattform. Ett Dette er nyttig for ekspresjon av proteiner og genetiske kretser på en kontrollert måte, så vel som for å tilveiebringe et miljø for proto syntetisk biologi. 2,3 For å oppnå det siste målet, celle-frie uttrykk systemer som bevarer endogen Escherichia coli transkripsjon-oversettelse mekanismer er i stand til mer nøyaktig gjenspeiler i vivo cellulære dynamikk enn de som er basert på T7 RNA polymerase transkripsjon. Vi beskriver utarbeidelse og gjennomføring av en effektiv endogen E. coli basert transkripsjon-transla-(TX-TL) cellefritt ekspresjonssystem som kan produsere ekvivalente mengder av protein som T7-baserte systemer med en 98% kostnadsreduksjon til lignende kommersielle systemer. 4,5 Fremstillingen av buffere og rå celleekstrakt er beskrevet, så vel som utførelse av entre rør TX-TL reaksjon. Hele protokollen tar fem dager for å forberede og gir tilstrekkelig materiale for opp til 3000 enkle reaksjoner i en forberedelse. Når forberedt, tar hver reaksjon etter 8 timers fra oppsett til datainnsamling og analyse. Mekanismer for regulering og transkripsjon eksogene til E. coli, slik som lac / Tet repressorer og T7 RNA-polymerase, kan kompletteres. seks Endogene egenskaper, slik som mRNA og DNA-nedbrytningshastigheter, kan også justeres. syv TX-TL cellefritt ekspresjonssystem er vist for stor skala kretsstevne, utforske biologiske fenomener, og uttrykket av proteiner under begge T7-og endogene arrangører. 6,8 Medfølgende matematiske modeller er tilgjengelig. 9,10 Den resulterende system har unike applikasjoner i syntetisk biologi som en prototyping miljø, eller "TX- TL biomolekylære brødfjel. "
Cell-ytringsfrihet teknologi startet i 1950 som rent translasjonsforskning, marsj år senere til å omfatte kombinert transkripsjon-oversettelse mekanismer ved hjelp T7 bakteriofag DNA. 11,12 Siden da har mange anstrengelser er gjort for å optimalisere etableringen av råolje celle ekstrakt (eller E . coli S30 ekstrakt). 13,14 Disse optimaliseringer inkluderer forlenge cellefritt proteinsyntesen gjennom ATP regenerering eller belastningsskader modifikasjoner, og redusere protokoll tid og kostnad. 15-17 Alternative cellefrie ekspresjonssystemer eksisterer som bruker rekonstituert komponenter i stedet for råolje celleekstrakt for ekspresjon. fem Både rå celleekstrakt, og oppløsningsfremgangsmåter er blitt utviklet for kommersiell bruk.
Med bruk av syntetisk biologi, det er et økt behov for et godt karakterisert plattform for å teste og uttrykke konstruert biologiske moduler og kretser. 18,19 Denne plattformen må væreallsidig, godt karakterisert, enkle å manipulere, og fokusert på bruker innkjøpte deler. Til tross utvikles et halvt århundre tidligere, cellefrie systemer basert på E. coli egen dele disse krav, da de er en forenklet in vitro fremstilling av cellulære prosesser uten at kompleksiteten i vekst og metabolisme. I tillegg har alle de grunnleggende kunnskap fra in vivo arbeide på E. coli gjelder lett til E. coli-celle-frie systemer.
Selv om cellefrie ekspresjonssystemer kan ha programmer i syntetisk biologi, hittil målet for de fleste cellefritt uttrykk systemer har vært maksimering av protein og metabolitt yield. Dette oppnås ved hjelp av T7-bakteriofag transkripsjon av sekvenser drevet av T7 promotorer. 20. Selv om uttrykket er effektiv og robust, er disse systemer tjener et høyt spesialiserte formål. Cellereguleringsmetoder er begrenset, må mål-DNA-maler blireengineered å inkludere T7 arrangører, og enkelte sekvenser som ribosomal komplekser kan ikke bli transkribert og monteres. 21,22 Eksisterende cellefrie ekspresjonssystemer ikke klarer å opprettholde høy avkastning og samtidig bevare endogene reguleringsmekanismer, en nødvendig fleksibilitet for syntetisk biologi.
Vi har utviklet en endogen E. coli cellefritt ekspresjonssystem som bevarer effektiviteten av protein ekspresjon demonstrert ved tidligere systemer, men tilføyer ytterligere fleksibilitet ved å tillate ekspresjon og regulering basert på både endogene og eksogene (T7 eller andre mekanismer). Protokollen er beskrevet her er opprinnelig basert på Kigawa et al. (2004) og Liu et al. (2005), men har betydelige modifikasjoner. Det benytter Mg-og K-glutamat enn Mg-og K-acetat for økt effektivitet, fjerner 2-mercaptoethanol, og lyserer celler ved hjelp av et kule-visp. 17,23,24 Bead-juling velges fremfor homogeniseringtrykk-baserte metoder, eller sonikering på grunn av sin lavere pris og sammenlignbare utbytter i konkurrerende systemer. 23. 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) benyttes som energikilde som det ble funnet å gi overlegne protein utbytter sammenlignet med kreatinfosfat og fosfoenolpyruvat. 4,25 Vårt system kan produsere opp til 0,75 mg / ml reporter protein ved hjelp av enten en sigma70-baserte arrangøren med lambda-fage operatører eller en T7-drevet promoter, lik avkastningen fra andre kommersielle systemer. 4,6 Fem dager er nødvendig for å produsere alle de nødvendige reagenser (figur 1). Videre gir det en 98% kostnadsreduksjon i forhold til sammenlignbare kommersielle cellefrie systemer – materielle kostnader er $ 0,11 per 10 mL reaksjon, som stiger til $ 0,26 med arbeid inkludert (figur 2).
Den endogene Escherichia coli basert TX-TL celle-fri ytring system som beskrives her er en lett-å-løp tre tube reaksjon som kan ta mindre enn åtte timer fra satt opp til datainnsamling. Prosessen med å lage alle reagenser krever fem dagers tid totalt (med betydelige arbeidsforbruk på bare én dag), men produserer råolje ekstrakt for 3000 reaksjoner og buffer-making reagenser for 10 000 reaksjoner (figur 1). Videre rå ekstrakt og buffer-making reagenser er stabile i minst ett år ved -80 ° C, noe som åpner for flere bruksområder av en forberedelse. 4 På $ 0,11 per 10 mL reaksjon ($ 0,26 inkludert arbeid), kostnadene er 98% lavere enn sammenlignbare kommersielle systemer (figur 2).
Det er noen uløste begrensninger, men til systemet. Slutten effektiviteten av hver råolje celle ekstrakt forberedelse kan variere basert på brukerkompetanse og på miljøforhold, selv om typical utbytte variant er mellom 5-10% (figur 4b). Som et resultat av batch-til-batch-variabilitet i begge end-point uttrykk og i uttrykket dynamikk er å forvente. Disse variasjonene vil trolig forbli inntil ekstrakt er fullstendig karakterisert eller til ekstrakt skapelse er helautomatisk. Hvis den cellefrie ekspresjonssystem blir brukt til å drive sensitive kvantitative eksperimenter, er det tilrådelig å kjøre alle forsøk med den samme batch av rå celleekstrakt. Utbyttet fra en enkelt råolje celle ekstrakt batch, ca 3000 reaksjoner, bør være tilstrekkelig for typiske eksperimentelle kurs. Selv om vi har mistanke om variasjoner kan fjernes ved å skalere opp og å automatisere fremgangsmåten, ville slike forsøk innebære en betydelig ressurs investering.
I tillegg, selv om endepunktet uttrykk nivåer er rimelig lett å finne ut, trenger mer arbeid som må gjøres i forståelse dynamikk iboende til cellen fritt system. Det er kjent at både ressurs COMPETITIOn og ressursbegrensning kan påvirke uttrykket dynamikk. For eksempel kan det begrensede endogene sigma 70 resultere i en mette regime med økt DNA-templat som produserer et uttrykk profil analog med den i nukleotid-eller aminosyre-uttømming. 9,27 imidlertid dynamikk trenger ikke å være fullt forstått å utnytte systemet. For rene økning av utbytte, kan optimalisering gjøres maskinelt-læring tilnærminger. 28 spørsmål av ressurs konkurranse og begrensning kan løses ved matematiske modeller verifisert ved hjelp av eksperimentelle data.
Protokollen som presenteres her er optimalisert for en BL21-Rosetta2 belastning, men er generaliseres til andre E. coli-stammer. Modifikasjoner i BL21-Rosetta2, slik som fjerning av genet som koder lon proteasen og tilsetning av gener som koder for sjeldne tRNAs, tillate maksimal proteinproduksjon. Vi har forsøkt protokollen med to andre ekstrakt stammer – BL21 bare og en BL21 trxA knockout-end fant 50% mindre protein yield. Vi hypotese at rentene på samme måte redusere ved bruk av andre stammer. Andre endringer i parametere, slik som å bytte 2 x YT vekstmedium for LB og andre rike buljonger, har resultert i redusert proteinmengde.
Cell-free ekspresjonssystemer utnytte både endogene og eksogene transkripsjon-oversettelse maskiner og reguleringsmekanismer har brede programmer i både protein og metabolitt uttrykk og i syntetisk biologi. 3,29 i stedet for å være begrenset til T7-regulert kretser, kan man tenke seg å produsere komplekse biomolekyler i et brukerstyrt innstilling ved hjelp av en blanding av innfødte E. coli arrangører og eksogent levert transkripsjon og reguleringsmekanismer. Uten begrensninger av celledeling og metabolisme, kan variasjonen i syntetiske kretser som repressilator eller metabolske veier konstruert slik som de produserende artemisinin reduseres eller bedre forstått. 30,31 Vi have brukte disse fordelene for å gjennomføre genetiske brytere, samt å forstå sigma faktor sequestration 9,32 Slik teknologi kan også danne ryggraden i "minimal" eller "kunstige" celler -. lite, godt karakterisert og selvforsynt legemlig enheter av ekstrakt. 33,34
Til syvende og sist, forventer vi umiddelbare anvendelser av denne endogene celle-frie uttrykk system som en prototyping miljø for syntetisk biologi. Kallenavnet "TX-TL biomolekylære koblingsbrettet," the cell-free ekspresjonssystem gir et kontrollerbart miljø hvor syntetiske kretser til slutt bestemt for in vivo-ekspresjon kan gjennomgå runder med proto – sykluser av testing på basis plasmid, lineær, eller kjemisk syntetisert DNA, etterfulgt ved analyse og rask endring. Prototyping runder kan bli hjulpet av prediktive matematiske modeller for tiden under utvikling. Ved å fjerne kloning og in vivo manipulasjon for ikke-ferdige kretser, forventer vi engineering syklustider for å bli redusert til 1-3 dager i stedet for dagens ukers standard.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, og Enoch Yeung for assistanse effektivisering protokollen, og Clare Chen og Barclay Lee for å få hjelp i en tidlig fase av prosjektet. Dette materialet er basert på arbeid støttes delvis av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living støperi program, kontraktsnummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS er også støttet av en UCLA / Caltech Medical Scientist Training Program fellesskap og ved en DoD, Air Force Office of Scientific Research, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. Synspunktene og konklusjonene i dette dokumentet er de av forfatterne, og bør ikke tolkes som representerer offisielt politikk, enten uttrykkelig eller underforstått, for Defense Advanced Research Projects Agency eller den amerikanske regjeringen.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
Bacto-agar | BD Diagnostics | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | BioSpec | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | BioSpec | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
CTP | USB | 14121 | |
Cuvettes, 1.5ml | Fisher | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
GTP | USB | 16800 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo-Scientific | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo-Scientific | 232701 | |
PEG-8000 | Promega | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
Tris base | Fischer | BP1521 | |
tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
UTP | USB | 23160 | |
1L Centrifuge Bottle | Beckman-Coulter | A98813 | This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use. |
4L Erlenmeyer Flask | Kimble Chase | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP Centrifuge | Beckman-Coulter | 393127 | Or 1L-capable centrifuge equivalent. |
Forma 480 Orbital Shaker | Thermo Scientific | 480 | Or chest-size 6x4L shaker equivalent. |
JLA-8.1000 Rotor | Beckman-Coulter | 363688 | Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge. |
Mini-Beadbeater-1 | BioSpec | 3110BX | |
Supplemental Material 1. Recipes for Items. Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. 2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 °C and add 40 μl Cm. Aliquot 25 ml into a 100×15 mm petri dish, and let cool for an hour. 2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2×1.88 L and 0.24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 4 ml 1 M DTT before use. S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 2 ml 1 M DTT before use. HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 μl. CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 μl. NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 μl. (Add 27 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 μl. (Add 73 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. Spermidine: Prepare 23.55 μl of spermidine (MW 145.25) and water to 150 μl. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 °C. 3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 μl of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). Supplemental Material 2. Bradford Assay.
See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx. Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. See TXTL _JoVE.xlsx. |