Denne fem-dages-protokollen skitserer alle trin, udstyr og supplerende software er nødvendig for at skabe og drive en effektiv endogent Escherichia coli baserede TX-TL cellefrit udtryk system fra bunden. Med reagenser, protokollen tager 8 timer eller mindre til opsætning af en reaktions, indsamle og behandle data.
Ideelle cellefrie ekspressionssystemer kan teoretisk efterligne en in vivo cellulære miljø i et kontrolleret in vitro platform. 1. Dette er nyttigt til ekspression af proteiner og genetiske kredsløb på en kontrolleret måde, samt til at tilvejebringe en prototyping miljø for syntetisk biologi. 2,3 For at nå sidstnævnte mål, celle-fri ekspressionssystemer der bevarer endogene Escherichia coli transskription-oversættelse mekanismer er i stand til mere præcist afspejler in vivo cellulære dynamik end dem baseret på T7 RNA-polymerase transkription. Vi beskriver forberedelsen og gennemførelsen af en effektiv endogent E. coli baseret transkription-translation (TX-TL) celle-frie udtryk, der kan producere tilsvarende mængder af protein som T7-baserede systemer til en omkostningsreduktion 98% til tilsvarende kommercielle systemer. 4,5 Udarbejdelsen af buffere og rå celle-ekstrakt er beskrevet, samt udførelsen af entre rør TX-TL-reaktion. Hele protokol tager fem dage til at forberede og giver nok materiale til op til 3000 enkelt reaktioner i et præparat. Når forberedt, hver reaktion tager under 8 timer fra setup til indsamling og analyse af data. Reguleringsmekanismer og transskription eksogene til E. coli, såsom lac / tet repressorer og T7-RNA-polymerase, kan suppleres. 6 Endogene egenskaber, såsom mRNA og DNA nedbrydningshastigheder kan også justeres. 7 TX-TL cellefrit ekspressionssystem er blevet demonstreret i stor skala kredsløb samling, udforske biologiske fænomener, og ekspression af proteiner under både T7-og endogene promotorer. 6,8 Ledsageforanstaltninger matematiske modeller er til rådighed. 9,10 Den resulterende system har unikke applikationer i syntetisk biologi som en prototyping miljø eller "TX- TL biomolekylære breadboard. "
Celle-ytringsfriheden teknologi begyndte i 1950'erne som rent translationel, fremrykkende år senere til at omfatte koblet transkription-translationsmekanismer hjælp T7 bakteriofag DNA. 11,12 Siden da er der blevet gjort mange bestræbelser på at optimere skabelsen af rå celle ekstrakt (eller E coli. S30-ekstrakt). 13,14 Disse optimeringer omfatter forlænge celle-fri proteinsyntese ATP regenerering eller stamme ændringer igennem, og reducere protokol tid og omkostninger. findes 15-17 Alternative celle-frie udtryk, som bruger rekonstitueret komponenter i stedet for rå celle ekstrakt til udtryk. 5. Begge rå celle ekstrakt og rekonstituering metoder er blevet udviklet til kommerciel brug.
Med fremkomsten af syntetisk biologi, er der et øget behov for en velkarakteriseret platform til at teste og udtrykke manipuleret biologiske moduler og kredsløb. 18,19 Denne platform skal værealsidig, godt karakteriseret, enkel at manipulere, og fokuserede på bruger-leverede komponenter. Trods at blive udviklet et halvt århundrede tidligere, cellefrie systemer baseret på E. coli uløseligt deler disse krav, da de er en forenklet in vitro fremstilling af cellulære processer uden kompleksiteten af vækst og metabolisme. Derudover alle de grundlæggende viden fra in vivo arbejde på E. coli gælder umiddelbart til E. coli cellefrie systemer.
Selvom celle-fri ekspressionssystemer kan have applikationer i syntetisk biologi til dato målet for de fleste celle-fri ekspressionssystemer har været maksimering af protein og metabolit udbytte. Dette opnås ved anvendelse af T7-bakteriofag transskription af sekvenser drevet af T7 promotorer. 20. Selv om udtrykket er effektiv og robust disse systemer tjener et højt specialiseret formål. Cell reguleringsmetoder er begrænsede, skal mål-DNA skabeloner værereengineered at omfatte T7 initiativtagere, og visse sekvenser, såsom ribosomale komplekser kan ikke transkriberet og samles. 21,22 Eksisterende celle-fri ekspressionssystemer er i stand til at opretholde høje udbytter, mens endogene reguleringsmekanismer, en alsidighed er nødvendig for syntetisk biologi bevare.
Vi har udviklet en endogen E. coli celle-frie udtryk, der bevarer effektiviteten af protein udtryk demonstreret ved tidligere systemer, men tilføjer yderligere alsidighed ved at tillade ekspression og regulering baseret på både endogene og eksogene (T7 eller andre) mekanismer. Den her beskrevne protokol er oprindeligt baseret på Kigawa et al. (2004) og Liu et al. (2005), men har væsentlige ændringer. Det udnytter Mg-og K-glutamat i Mg-og K-acetat for øget effektivitet, fjerner 2-mercaptoethanol, og lyserer celler under anvendelse af en perle-piskeris. 17,23,24 Perle-bankende er valgt frem homogeniseringtrykbaserede metoder eller lydbehandling på grund af sin lavere omkostninger og sammenlignelige udbytter til konkurrerende systemer. 23. 3-phosphoglyceric-(3-PGA) anvendes som energikilde da det blev fundet at give overlegen proteinudbytter forhold til creatinphosphat og phosphoenolpyruvat. 4,25 Vores system kan producere op til 0,75 mg / ml reporter protein under anvendelse af enten en sigma70 baseret promotor med lambda-fag-operatører eller en T7-drevet promotor, svarende til udbyttet fra andre kommercielle systemer. 4,6 Fem dage er forpligtet til at producere alle nødvendige reagenser (Figur 1). Desuden giver en reduktion 98% af omkostningerne i forhold til sammenlignelige kommercielle celle-fri systemer – materialeomkostninger er $ 0,11 per 10 ul reaktion, der stiger til $ 0,26 med arbejdskraft inkluderet (figur 2).
Den endogene Escherichia coli baserede TX-TL cellefrit udtryk her beskrevne system er en nem-at-run tre rør reaktion, som kan tage mindre end otte timer fra sat op til dataindsamling. Processen med at skabe alle reagenser kræver fem dages tid i alt (med betydelige behov for arbejdskraft på kun én dag), men producerer rå ekstrakt 3.000 reaktioner og buffer-making reagenser til 10.000 reaktioner (Figur 1). Desuden rå ekstrakt og buffer-making reagenser er stabile i mindst 1 år ved -80 ° C, der giver mulighed for flere anvendelser af et præparat. 4. På $ 0,11 per 10 ul reaktion ($ 0,26 herunder arbejdskraft), omkostningerne er 98% lavere end sammenlignelige kommercielle systemer (figur 2).
Der er nogle uløste begrænsninger, men til systemet. Enden Effektiviteten af de enkelte rå celle ekstrakt forberedelse kan variere baseret på brugerens færdighed og miljøforhold, selvom typiske udbytte variation er mellem 5-10% (figur 4b). Som et resultat, batch-til-batch variation i både endepunkt udtryk og i udtryk dynamik der må forventes. Disse variationer vil sandsynligvis forblive, indtil ekstrakt fuldt karakteriseret, eller indtil ekstrakt skabelse er fuldt automatiseret. Hvis det cellefrie ekspressionssystem anvendes til at udføre følsomme kvantitative forsøg, er det tilrådeligt at køre alle forsøg med den samme batch af rå celleekstrakt. Udbyttet fra en enkelt rå celle ekstrakt parti, omkring 3000 reaktioner, bør være tilstrækkelig til typiske eksperimentelle kurser. Selvom vi har mistanke om variation kan fjernes ved at skalere op og automatisere proceduren ville sådanne forsøg indebære en betydelig investering ressource.
Derudover, selvom endepunkt ekspressionsniveauer rimeligt let at afgøre, der skal gøres i forståelse dynamik iboende til celle-fri system, mere arbejde. Det er kendt, at både ressource COMPETITIOn og ressource begrænsning kan påvirke udtryk dynamik. For eksempel kan begrænsede endogent sigma 70 resultere i en mættende regime med øget DNA-template producerer et udtryk nu analog med den i nukleotid-eller aminosyre udtynding. 9,27 imidlertid dynamik ikke behøver at være fuldt forstået at udnytte systemet. For rene stigninger i udbyttet, kan optimering ske ved maskine-learning tilgange. 28 spørgsmål om konkurrence og begrænsning ressource kan løses ved matematiske modeller kontrolleres ved hjælp af eksperimentelle data.
Protokollen præsenteres her er optimeret til en BL21-Rosetta2 stamme, men er generaliseres til andre E. coli-stammer. Ændringer i BL21-Rosetta2, såsom fjernelse af det gen, der koder for lon protease og tilsætning af gener, der koder sjældne tRNA'er, give mulighed for maksimal proteinproduktion. Vi har forsøgt protokollen med to andre ekstrakt stammer – kun BL21 og en BL21 trxA knockout-end fundet 50% mindre protein udbytte. Vi hypotesen, at udbyttet på samme måde falde, når du bruger andre stammer. Andre ændringer i parametre, såsom skift 2xYT vækstmediet for LB og andre rige bouillon, har resulteret i nedsat proteinudbytte.
Cellefrie ekspressionssystemer udnytte både endogene og eksogene transkription-translation maskiner og reguleringsmekanismer har brede anvendelser i både protein og metabolit udtryk og i syntetisk biologi. 3,29 i stedet for at være begrænset til T7-regulerede kredsløb, kan man forestille sig at producere komplekse biomolekyler i et brugervenligt kontrollerbar indstilling ved hjælp af en blanding af indfødt E. coli promotorer og exogent tilførte transskription og reguleringsmekanismer. Uden begrænsninger af celledeling og stofskifte, kan variation i syntetiske kredsløb såsom repressilator eller metaboliske manipuleret veje såsom dem, der producerer artemisinin reduceres eller bedre forstået. 30,31 Vi have brugt disse fordele at implementere genetiske switche, samt at forstå sigma faktor binding 9,32 Sådan teknologi kan også danne rygraden i "minimal" eller "kunstige" celler -. lille, godt karakteriseres og selvforsynende indkapslinger enheder ekstrakt. 33,34
I sidste ende, vi forventer umiddelbare anvendelser af denne endogene celle-fri ekspressionssystem som prototyping miljø for syntetisk biologi. Tilnavnet "TX-TL biomolekylære breadboard," celle-frie udtryk system giver en kontrollerbar miljø, hvor syntetiske kredsløb i sidste ende er bestemt til in vivo-ekspression kan undergå runder af prototyper – cykler test på grundlæggende plasmid, lineær eller kemisk syntetiseret DNA, efterfulgt ved analyse og hurtig modifikation. Prototyping runder kan blive hjulpet af prognosemodeller matematiske modeller ved at blive udviklet. Ved at fjerne kloning og in vivo manipulation for ikke-endelige kredsløb, forventer vi ingegeniørfirma cyklustider reduceres til 1-3 dage i stedet for de nuværende ugers standard.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere og Enoch Yeung for assistance strømline protokollen, og Clare Chen og Barclay Lee om bistand i de tidlige faser af projektet. Dette materiale er baseret på arbejde støttes delvist af Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living Støberier program, kontrakt nummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS understøttes også af en UCLA / Caltech Medical Scientist Training Program fællesskab og med en DoD, Air Force Kontoret for Videnskabelig Forskning, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. De synspunkter og konklusioner, der er indeholdt i dette dokument, er forfatternes og bør ikke fortolkes som repræsenterende officielt politikker, hverken udtrykkeligt eller stiltiende, af Defense Advanced Research Projects Agency eller den amerikanske regering.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
Bacto-agar | BD Diagnostics | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | BioSpec | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | BioSpec | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
CTP | USB | 14121 | |
Cuvettes, 1.5ml | Fisher | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
GTP | USB | 16800 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo-Scientific | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo-Scientific | 232701 | |
PEG-8000 | Promega | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
Tris base | Fischer | BP1521 | |
tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
UTP | USB | 23160 | |
1L Centrifuge Bottle | Beckman-Coulter | A98813 | This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use. |
4L Erlenmeyer Flask | Kimble Chase | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP Centrifuge | Beckman-Coulter | 393127 | Or 1L-capable centrifuge equivalent. |
Forma 480 Orbital Shaker | Thermo Scientific | 480 | Or chest-size 6x4L shaker equivalent. |
JLA-8.1000 Rotor | Beckman-Coulter | 363688 | Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge. |
Mini-Beadbeater-1 | BioSpec | 3110BX | |
Supplemental Material 1. Recipes for Items. Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. 2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 °C and add 40 μl Cm. Aliquot 25 ml into a 100×15 mm petri dish, and let cool for an hour. 2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2×1.88 L and 0.24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 4 ml 1 M DTT before use. S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 2 ml 1 M DTT before use. HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 μl. CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 μl. NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 μl. (Add 27 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 μl. (Add 73 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. Spermidine: Prepare 23.55 μl of spermidine (MW 145.25) and water to 150 μl. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 °C. 3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 μl of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). Supplemental Material 2. Bradford Assay.
See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx. Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. See TXTL _JoVE.xlsx. |