Optische Detektion von<em> E. coli</em> Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren
Summary
Ein Label-freien optischen Biosensor zur schnellen Nachweis von Bakterien wird eingeführt. Der Biosensor auf einem nanostrukturierten porösen Si, das dazu bestimmt ist, direkt zu erfassen, die Zielbakterien-Zellen auf ihrer Oberfläche basiert. Wir verwenden monoklonale Antikörper, auf die poröse Wandler immobilisiert, wie die Capture-Sonden. Unsere Studien zeigen die Anwendbarkeit dieser Biosensoren zum Nachweis von geringen Bakterienkonzentrationen innerhalb von Minuten, ohne vorherige Probenaufbereitung (beispielsweise Zell-Lyse).
Abstract
Ein Label-freien optischen Biosensor auf der Basis eines nanostrukturierten porösen Si ist für die schnelle Erfassung und Erkennung von Escherichia coli K12 Bakterien als Modell Mikroorganismus entwickelt. Biosensor beruht auf direkten Bindung der Zielbakterienzellen auf ihrer Oberfläche, während keine Vorbehandlung (z. B. durch Lyse der Zellen) der untersuchten Probe ist erforderlich. Mesoporöse Si-Dünnfilm als die optische Wandlerelement des Biosensors verwendet wird. Unter Beleuchtung mit weißem Licht, zeigt die poröse Schicht gut aufgelöste Fabry-Perot-Streifenmuster in seiner Reflexionsspektrum. Anwenden einer schnellen Fourier-Transformation (FFT), um die Reflexionsdaten ergibt einen einzigen Peak. Änderungen in der Intensität der Peak FFT überwacht. Somit Zielbakterien zu erfassen auf die Biosensor-Oberfläche, durch Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, induziert messbare Veränderungen in der Intensität der FFT-Spitzen, so dass für eine "Echtzeit" Beobachtung von Bakterien Befestigung.
nt "> Die mesoporösen Si-Film, durch einen elektrochemischen Anodisierung hergestellt wird, wird mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für die Zielbakterien konjugiert. Die Immobilisierung Immunaktivität und Spezifität der Antikörper durch Fluoreszenz-Markierungsexperimente bestätigt. Sobald der Biosensor wird den exponierten Zielbakterien, werden die Zellen direkt auf die Antikörper-modifizierten porösen Si-Oberfläche eingefangen. Diese spezifischen Einfangen Ereignisse führen Intensitätsänderungen in der optischen Dünnfilm-Interferenzspektrum des Biosensors. Wir zeigen, dass diese Biosensoren können relativ niedrige Bakterienkonzentrationen zu erkennen (Erkennungs Grenze von 10 4 Zellen / ml) in weniger als einer Stunde.Introduction
Frühe und genaue Identifizierung von pathogenen Bakterien ist für Lebensmittel-und Wassersicherheit, Umweltüberwachung und Point-of-Care-Diagnostik ein extrem wichtig. Da die traditionellen Mikrobiologie Techniken sind zeitaufwendig, mühsam und nicht die Fähigkeit, Mikroorganismen in "Echtzeit" oder außerhalb der Laborumgebung zu erfassen, werden Biosensoren entwickelt, um diese Herausforderungen 5.2 erfüllen.
In den letzten Jahren hat porösen Si (PSi) als vielversprechende Plattform für die Gestaltung von Sensoren und Biosensoren 6-20 entstanden. Im vergangenen Jahrzehnt zahlreiche Studien über PSi-basierte optische Sensoren und Biosensoren veröffentlicht wurden 21,22. Die nanostrukturierte Schicht PSi wird typischerweise durch elektrochemische anodische Ätzen aus einem einkristallinen Si-Wafer hergestellt. Die daraus resultierenden PSi Nanomaterialien weisen viele vorteilhafte Eigenschaften, wie große Oberfläche und Freivolumen, Porengrößen, die gesteuert werden kann und abstimmbaren optischaften 10,16. Die optischen Eigenschaften der Schicht PSi wie Photolumineszenz 8,11 und Weißlicht-Interferometrie Reflexionsbasis 7,19, werden stark durch Umweltbedingungen beeinflusst. Erfassung von Gastmolekülen / Zielanalyten in der porösen Schicht zu einer Änderung des mittleren Brechungsindex des Films, als eine Modulation in der Photolumineszenz oder eine Wellenlängenverschiebung des Reflexionsspektrum 10 beobachtet.
Obwohl die überwiegende Innovation in PSi optischen Biosensor-Technologie, gibt es nur wenige Berichte über PSi-basierte Plattformen für Bakterien Erkennung 6,8,20,23-29. Zudem sind die meisten dieser Proof-of-Concept-Studien "indirekte" Nachweis von Bakterien nachgewiesen. Somit wird im allgemeinen vor der Lyse der Zellen erforderlich ist, um die angestrebten Protein / DNA-Fragmente, die charakteristisch für die untersuchten Bakterien 29 zu extrahieren. Unser Ansatz ist, um direkt erfassen die ZielbakterienZellen auf der PSi Biosensor. Daher werden monoklonale Antikörper, die spezifisch für Zielbakterien sind, auf die poröse Oberfläche immobilisiert ist. Bindung der Bakterienzellen durch Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, auf die Oberfläche des Biosensors induzieren Änderungen in der Amplitude (Intensität) des Reflexionsspektrums 24-26.
In dieser Arbeit berichten wir über die Konstruktion eines optischen PSi-basierten Biosensor und zeigen ihre Anwendung als markierungsfreien Biosensoren Plattform für den Nachweis von Escherichia coli (E. coli) K12 Bakterien (als Modell verwendeten Mikroorganismus). Die überwachte optische Signal ist das Licht von der PSi Nanostruktur durch Fabry-Perot-Dünnschicht-Interferenz (Abbildung 1A) wider. Änderungen in der Lichtamplitude / Intensität auf spezifische Immobilisierung der Zielbakterienzellen korreliert auf die Biosensor-Oberfläche, was eine schnelle Detektion und Quantifizierung der Bakterien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Label-freien optischen Immun, basierend auf einem PSIO 2 Nanostruktur (ein Fabry-Perot-Dünnfilm) hergestellt wird, und seine potentielle Anwendbarkeit als Biosensor für Nachweis von Bakterien wird bestätigt.
Änderungen und Fehlersuche
Eines der Hauptprobleme bei der Entwicklung eines Immun ist die Anfälligkeit von Antikörpern gegen unerwünschte Konformationsänderungen während der Abscheidung und Musterbildung auf dem festen Substrat, das zu e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (Grant No 1118-1108 und Zuschuss Nr. 1146/12) und der Minna Kroll Memorial Research Fund unterstützt. ES dankt der finanziellen Unterstützung des Russell Berrie Nanotechnology Institute.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
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