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Bioengineering

के ऑप्टिकल पहचान doi: 10.3791/50805 Published: November 20, 2013
* These authors contributed equally

Summary

तेजी से बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक लेबल से मुक्त ऑप्टिकल biosensor शुरू की है. biosensor सीधे उसकी सतह पर लक्ष्य बैक्टीरिया की कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो एक nanostructured झरझरा सी, पर आधारित है. हम पर कब्जा जांच के रूप में, झरझरा ट्रांसड्यूसर पर immobilized मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, का उपयोग करें. हमारे अध्ययन (जैसे सेल के रूप में) कोई पूर्व नमूना प्रसंस्करण के साथ मिनट के भीतर कम बैक्टीरियल सांद्रता का पता लगाने के लिए इन biosensors की प्रयोज्यता प्रदर्शित करता है.

Abstract

एक nanostructured झरझरा सी के आधार पर एक लेबल से मुक्त ऑप्टिकल biosensor एक मॉडल सूक्ष्मजीव के रूप में, Escherichia कोलाई K12 बैक्टीरिया के तेजी पकड़ने और पता लगाने के लिए बनाया गया है. अध्ययन नमूना के (सेल द्वारा जैसे) कोई pretreatment की आवश्यकता है, जबकि biosensor, इसकी सतह पर लक्ष्य बैक्टीरिया कोशिकाओं के प्रत्यक्ष बंधन पर निर्भर करता है. एक mesoporous पतली सी फिल्म biosensor का ऑप्टिकल ट्रांसड्यूसर तत्व के रूप में प्रयोग किया जाता है. सफेद रोशनी रोशनी के तहत, झरझरा परत अपनी परावर्तन स्पेक्ट्रम में अच्छी तरह से हल फेब्री Perot फ्रिंज पैटर्न प्रदर्शित करता है. एक तेजी से फूरियर एक भी शिखर में परावर्तन डेटा परिणाम के लिए (FFT) को बदलने लागू. FFT शिखर की तीव्रता में परिवर्तन निगरानी कर रहे हैं. इस प्रकार, लक्ष्य बैक्टीरिया, एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत के माध्यम से, biosensor सतह पर कब्जा बैक्टीरिया लगाव की एक 'वास्तविक समय' अवलोकन के लिए अनुमति FFT चोटियों की तीव्रता में औसत दर्जे का परिवर्तन, लाती है.

NT "> एक विद्युत anodization प्रक्रिया द्वारा गढ़े mesoporous सी फिल्म, लक्ष्य बैक्टीरिया को विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, साथ संयुग्मित है. स्थिरीकरण, immunoactivity और एंटीबॉडी की विशिष्टता फ्लोरोसेंट लेबलिंग प्रयोगों द्वारा पुष्टि कर रहे हैं. biosensor के संपर्क में है एक बार लक्ष्य बैक्टीरिया, कोशिकाओं सीधे एंटीबॉडी संशोधित झरझरा सी सतह पर कब्जा कर रहे हैं. इन विशिष्ट कैप्चरिंग की घटनाओं biosensor की पतली फिल्म ऑप्टिकल हस्तक्षेप स्पेक्ट्रम में तीव्रता परिवर्तन में परिणाम. हम इन biosensors (पता लगाने अपेक्षाकृत कम बैक्टीरिया सांद्रता का पता लगा सकता प्रदर्शित एक घंटे से भी कम समय में 10 4 कोशिकाओं / एमएल) की सीमा.

Introduction

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रोगजनक बैक्टीरिया की प्रारंभिक और सटीक पहचान भोजन और पानी की सुरक्षा, पर्यावरण निगरानी, ​​और बिंदु का ध्यान निदान 1 के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. पारंपरिक सूक्ष्म जीव विज्ञान तकनीक समय श्रमसाध्य, उपभोग कर रहे हैं, और "वास्तविक समय" में या प्रयोगशाला वातावरण के बाहर सूक्ष्मजीवों का पता लगाने की क्षमता की कमी के रूप में, biosensors इन चुनौतियों 2-5 से मिलने के लिए विकसित हो रहे हैं.

हाल के वर्षों में, झरझरा सी (साई) और सेंसरों biosensors 6-20 के डिजाइन के लिए एक आशाजनक मंच के रूप में उभरा है. पिछले दशक के दौरान साई आधारित ऑप्टिकल सेंसर और biosensors के संबंध में कई अध्ययनों 21,22 प्रकाशित किए गए थे. nanostructured साई परत आम तौर पर एक एकल क्रिस्टल सी वफ़र से विद्युत anodic नक़्क़ाशी द्वारा निर्मित है. परिणामस्वरूप साई nanomaterials के ऐसे बड़े सतह और फ्री मात्रा के रूप में कई लाभप्रद विशेषताओं, प्रदर्शन, नियंत्रित किया जा सकता है कि आकार और tunable OPTI ताकनासीएएल गुण 10,16. ऐसे photoluminescence 8,11 और सफेद प्रकाश reflectance आधारित इंटरफेरोमेट्री 7,19 के रूप में साई परत, ऑप्टिकल संपत्तियों, दृढ़ता से पर्यावरण की स्थिति से प्रभावित हैं. Photoluminescence स्पेक्ट्रम में एक मॉडुलन के रूप में या परावर्तन स्पेक्ट्रम 10 में एक तरंग दैर्ध्य बदलाव के रूप में मनाया फिल्म के औसत अपवर्तनांक में एक परिवर्तन में झरझरा परत परिणामों के भीतर अणुओं अतिथि / लक्ष्य analytes की कैद.

साई ऑप्टिकल biosensor प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में विशाल नवाचार हालांकि, बैक्टीरिया का पता लगाने 6,8,20,23-29 के लिए साई आधारित प्लेटफॉर्म पर ही कुछ खबरें हैं. इसके अलावा, इन सबूत की अवधारणा अध्ययन के सबसे "अप्रत्यक्ष" बैक्टीरिया का पता लगाने का प्रदर्शन किया है. इस प्रकार, कोशिकाओं की आम तौर पर पूर्व सेल अध्ययन बैक्टीरिया 29 के लिए विशिष्ट लक्षित प्रोटीन / डीएनए टुकड़े, निकालने के लिए आवश्यक है. हमारा दृष्टिकोण सीधे लक्ष्य बैक्टीरिया पर कब्जा करने के लिए हैसाई biosensor पर कोशिकाओं. इसलिए, बैक्टीरिया लक्ष्य के लिए विशिष्ट हैं जो मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, झरझरा सतह पर स्थिर रहे हैं. एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत के माध्यम से, बैक्टीरिया की कोशिकाओं की बाइंडिंग, biosensor की सतह पर परावर्तन स्पेक्ट्रम 24-26 के आयाम (तीव्रता) में परिवर्तन प्रेरित.

इस काम में, हम एक ऑप्टिकल साई आधारित biosensor के निर्माण पर रिपोर्ट और Escherichia कोलाई का पता लगाने (ई. कोलाई) (एक मॉडल सूक्ष्मजीव के रूप में इस्तेमाल) K12 बैक्टीरिया. नजर रखी के लिए एक लेबल से मुक्त biosensing मंच के रूप में अपने आवेदन प्रदर्शन ऑप्टिकल संकेत के कारण फेब्री Perot पतली फिल्म हस्तक्षेप (चित्रा 1 ए) के लिए साई nanostructure से परिलक्षित प्रकाश है. प्रकाश आयाम / तीव्रता में परिवर्तन तेजी से पता लगाने और बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, biosensor सतह पर लक्ष्य बैक्टीरिया की कोशिकाओं के विशिष्ट स्थिरीकरण के लिए सहसंबद्ध होते हैं.

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Protocol

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1. ऑक्सीकरण खुली Sio 2 की तैयारी

  1. एक निरंतर वर्तमान में 30 सेकंड के लिए जलीय HF और निरपेक्ष इथेनॉल की एक 3:1 (v / v) समाधान में खोदना सी वेफर्स (एक पक्ष <100> चेहरे पर पॉलिश और भारी डाल दिया गया, P-प्रकार, 0.0008 Ω · सेमी) 385 मा / 2 सेमी की घनत्व. HF एक उच्च संक्षारक तरल है, और यह चरम देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए कृपया ध्यान दें.
  2. निरपेक्ष इथेनॉल के साथ जिसके परिणामस्वरूप झरझरा सी (साई) फिल्म की सतह कई बार कुल्ला, एक सूखी नाइट्रोजन गैस के तहत फिल्मों सूखी.
  3. परिवेशी वायु में 1 घंटे के लिए 800 डिग्री सेल्सियस (बंद कर देते हैं, 1 घंटे के लिए भट्ठी में छोड़ देते हैं, 800 डिग्री सेल्सियस के लिए भट्ठी गर्मी, कमरे के तापमान पर भट्ठी में नमूना प्लेस में एक ट्यूब भट्ठी में हौसले से etched साई नमूने oxidize भट्ठी और) केवल कमरे के तापमान पर भट्ठी से नमूने निकालें.

2. PSiO 2 scaffolds के Biofunctionalization

  1. एक ऑक्सीकरण साई (साई सेतेओ 2) mercaptopropyl में 1 घंटा (टोल्यूनि में trimethoxysilane -3) 95% (MPTS) समाधान (108 मिमी) के लिए नमूना.
  2. टोल्यूनि, मेथनॉल, और एसीटोन के साथ silane इलाज PSiO 2 नमूना कुल्ला, सूखी एक सूखी नाइट्रोजन गैस के तहत.
  3. 100 मिमी पीईओ-iodoacetyl बायोटिन समाधान के 1 मिलीलीटर में 30 मिनट के लिए silane संशोधित PSiO 2 नमूना सेते हैं.
  4. 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान के लिए कई बार साथ बायोटिन इलाज PSiO 2 नमूना कुल्ला.
  5. 100 माइक्रोग्राम / एमएल streptavidin (एसए) समाधान के 1 मिलीलीटर में 30 मिनट के लिए बायोटिन संशोधित PSiO 2 नमूना सेते हैं.
  6. 0.1 एम पीबीएस समाधान के लिए कई बार साथ सा इलाज PSiO 2 नमूना कुल्ला.
  7. 100 माइक्रोग्राम / एमएल biotinylated ई. के 1 मिलीलीटर में 30 मिनट के लिए जिसके परिणामस्वरूप एसए संशोधित PSiO 2 नमूना सेते कोली मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (इम्यूनोग्लोबिन जी, आईजीजी) समाधान या 100 ग्राम / एमएल biotinylated खरगोश आईजीजी के साथ (एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए एक मॉडल के रूप में).

3. फ्लोरोसेंट लेबलिंग और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. 15 माइक्रोग्राम / एमएल fluorescein (FITC) के साथ आईजीजी संशोधित सतहों सेते 40 मिनट के लिए विरोधी खरगोश आईजीजी टैग और 15 माइक्रोग्राम / एमएल fluorescein (FITC) के साथ एक नियंत्रण के रूप में विरोधी माउस आईजीजी टैग किया.
  2. 0.1 एम पीबीएस समाधान के लिए कई बार साथ संशोधित नमूने कुल्ला.
  3. एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे के नमूनों की जांच.

4. बैक्टीरिया संस्कृति

  1. ई. खेती कोलाई K12 Luria Bertani (पौंड) मध्यम (: NaCl, खमीर निकालने के 5 ग्राम के 5 ग्राम, और tryptone के 10 ग्राम विआयनीकृत पानी का 1 एल में मध्यम रचना) के 5 एमएल के साथ एक 10 मिलीलीटर ट्यूब में बैक्टीरिया. बैक्टीरिया रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते सेते
  2. 600 एनएम के तरंग दैर्ध्य में ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को पढ़ने के द्वारा बैक्टीरिया एकाग्रता मॉनिटर. लेग मध्यम में रातोंरात वृद्धि के बाद, जीवाणु एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग 600 आयुध डिपो पढ़ा. कोशिकाओं की संख्या सख्त हैआयुध डिपो के 600 माप (1 आयुध डिपो 600 = 10 8 कोशिकाओं / एमएल) के लिए ctly आनुपातिक.

5. बैक्टीरिया सेंसिंग

  1. आईजीजी संशोधित PSiO 2 और स्वच्छ PSiO 2 (नियंत्रण) एक कस्टम बनाया Plexiglas प्रवाह सेल में नमूने रखें. नमूना परावर्तन सभी मापन के दौरान एक ही स्थान पर मापा जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह सेल को ठीक करें.
  2. ई. के साथ नमूने सेते कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोलाई K12 निलंबन (10 4 सेल / एमएल). फिर 30 मिनट के लिए वी खारा समाधान w / 0.85% के साथ सेल निस्तब्धता द्वारा जीवाणु निलंबन हटा दें.
  3. प्रयोग के दौरान परावर्तन डेटा में परिवर्तन की निगरानी. सभी ऑप्टिकल माप आसपास के एक जलीय में बाहर ले जाने की जरूरत है. स्पेक्ट्रा एक सीसीडी स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर एकत्र की है और पहले से 25,26 वर्णित के रूप में तेजी से फूरियर, (FFT) को बदलने लगाने से विश्लेषण किया जाना चाहिए.
  4. पर बैक्टीरिया की उपस्थिति की पुष्टिbiosensor सतह, तुरंत biosensing प्रयोग के बाद एक ईमानदार प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत नमूने के अवलोकन से.

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Representative Results

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प्रोटोकॉल पाठ खंड में वर्णित के रूप में ऑक्सीकरण साई (PSiO 2) फिल्मों तैयार कर रहे हैं. चित्रा 1 बी थर्मल ऑक्सीकरण के बाद परिणामस्वरूप साई फिल्म के एक उच्च संकल्प स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ दिखाता है. PSiO 2 परत 30-80 एनएम के रेंज में एक व्यास के साथ अच्छी तरह से परिभाषित बेलनाकार pores की विशेषता है.

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (आईजीजी) अणुओं एक बायोटिन एसए प्रणाली के साथ मिलकर एक सुस्थापित silanization प्रौद्योगिकी का उपयोग करके PSiO 2 सतहों पर ग्राफ्ट कर रहे हैं. विस्तृत संश्लेषण योजना चित्रा 2 में उल्लिखित है. सबसे पहले, thermally ऑक्सीकरण सतह एक thiol-silanized सतह (चित्रा 2C), जिसके परिणामस्वरूप MPTS द्वारा silanized है. निम्न चरण में, सक्रिय सतह बायोटिन एसए पुलों के माध्यम से बायोटिन संशोधित सतह के लिए एसए प्रोटीन की कुर्की के बाद एसएच प्रतिक्रियाशील बायोटिन linker अणुओं (चित्रा 2 डी), के साथ incubated है (चित्रा 2 ई). biosensor सतह की functionalization में अंतिम चरण के एसए (चित्रा 2 एफ) को biotinylated मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की bioconjugation शामिल है.

PSiO 2 सतह के लिए एंटीबॉडी की कुर्की एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे की सतह का अवलोकन द्वारा पीछा फ्लोरोसेंट लेबलिंग से इसकी पुष्टि की है. इसके अलावा, प्रतिदीप्ति पढ़ाई हम में से fluorescently एक नियंत्रण के रूप में विरोधी खरगोश आईजीजी और विरोधी माउस आईजीजी में चिह्नित बंधन से सतह immobilized एंटीबॉडी (खरगोश आईजीजी) की गतिविधि और प्रतिजनी विशिष्टता को चिह्नित करने के लिए अनुमति देते हैं. 3 इन प्रयोगों के परिणामों का सारांश चित्रा .

बैक्टीरिया biosensing प्रदर्शित करने के लिए हम एक विशिष्ट ई. का इस्तेमाल किया है कोली आईजीजी के बजाय मॉडल आईजीजी (खरगोश आईजीजी). फिर, दृष्टिकोण PSiO 2 nanostr से परिलक्षित प्रकाश का आयाम (तीव्रता) में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए हैucture. संवेदन प्रयोगों के दौरान, biosensors नमूना परावर्तन सभी मापन के दौरान एक ही स्थान पर मापा जाता है विश्वास दिलाता हूं कि आदेश में एक प्रवाह सेल में तय कर रहे हैं. पूरे प्रयोग गीला वातावरण में किया जाता है और नमूना परावर्तन स्पेक्ट्रम लगातार निगरानी कर रहा है. biosensors ई. को उजागर कर रहे हैं एक बफर समाधान (स्वाधीन बैक्टीरिया को दूर करने के लिए) biosensor सतह धोने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसके बाद 30 मिनट के लिए कोलाई K12 निलंबन (10 4 कोशिकाओं / एमएल). ई. की शुरूआत से पहले और बाद biosensor का एक FFT स्पेक्ट्रम कोलाई बैक्टीरिया (10 4 कोशिकाओं / एमएल) चित्रा -4 ए (ऊपर) में दिखाया गया है. ई. के लिए इस प्रकार, निम्न जोखिम तुच्छ परिवर्तन (FFT तीव्रता में कम से कम 0.5% की कमी) असंशोधित PSiO 2 सतह (चित्रा 4 बी, ऊपर) के लिए मनाया जाता है, जबकि कोलाई बैक्टीरिया (और बाद rinsing कदम) 7 ± 1% की तीव्रता कम दर्ज की गई है. इसके अलावा, में ओPSiO 2 सतह पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए rder कोई कोशिकाओं मनाया जाता है, जबकि biosensors, तुरंत biosensing प्रयोग के पूरा. चित्रा -4 ए (नीचे) को प्रदर्शित करता है biosensor सतह पर बैक्टीरिया की कोशिकाओं immobilized के बाद एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है असंशोधित सतहों (नियंत्रण) पर, चित्रा 4 बी (नीचे) देखें.

चित्रा 1
एक तेजी से फूरियर (दाएं) को बदलने के बाद एक ठेठ फेब्री Perot PSiO 2 nanostructure (बाएं) और इसी स्पेक्ट्रम की चित्रा 1. (ए) विशिष्ट परावर्तन स्पेक्ट्रम. जिसके परिणामस्वरूप एक चोटी की स्थिति और परिमाण निगरानी कर रहे हैं. (बी) एक पार के अनुभागीय उच्च संकल्प स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (एसईसी385 मा / 2 सेमी से कम 30 सेकंड के लिए etched एक PSiO 2 परत () की ondary इलेक्ट्रॉनों).

चित्रा 2
संश्लेषण कदम के चित्रा 2. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एंटीबॉडी के साथ PSiO 2 सतह biofunctionalize के लिए पीछा किया. (एक) एक anodic विद्युत खोदना एक एकल क्रिस्टल सी वफ़र से एक साई परत तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (ख) हौसले etched नमूना तो thermally 800 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीकरण हो जाता है (ग) PSiO 2 सतह शुरू में मुक्त thiol समूह सतह (सक्रिय PSiO 2 फिल्म) बनाने के लिए MPTS के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है. (घ) biotinylated सतह उत्पन्न करने के पीईओ-iodoacetyl बायोटिन के साथ सक्रिय फिल्म के ऊष्मायन. Biotinylated है (ई) ऊष्मायनSA के साथ urface. (च) biotinylated एंटीबॉडी के साथ संशोधित सतह के ऊष्मायन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. Immobilized आईजीजी की गतिविधि और प्रतिजनी विशिष्टता पुष्टि करने के लिए प्रतिदीप्ति लेबलिंग प्रयोगों के परिणामों. नमूने एक निरंतर जोखिम समय में एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है. (ए) पूरा bioconjugation, PSiO 2 + बायोटिन + MPTS + एसए + biotinylated खरगोश आईजीजी और FITC विरोधी खरगोश आईजीजी, (बी) FITC विरोधी माउस आईजीजी साथ नियंत्रण प्रयोग, (ग) नियंत्रण प्रयोग, कोई आईजीजी, PSiO 2 + MPTS + बायोटिन + एसए और FITC विरोधी खरगोश आईजीजी.

नोट: ये schematics illustrat के लिए कर रहे हैंकेवल आईजीजी के विकार के रूप में आयन प्रयोजनों भी pores के अंदर होता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. ई. कोली biosensing प्रयोगों और तुरंत प्रयोगों के बाद biosensors की इसी ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियों. biosensors 10 4 कोशिकाओं / एमएल ई. के साथ incubated हैं कोली निलंबन. कुंजी: (क) PSiO 2, (ख) साफ (असंशोधित) PSiO 2 आईजीजी संशोधित.

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Discussion

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एक PSiO 2 nanostructure (एक फेब्री Perot पतली फिल्म) पर आधारित एक लेबल से मुक्त ऑप्टिकल immunosensor, गढ़े है, और बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक biosensor के रूप में अपनी क्षमता प्रयोज्यता की पुष्टि की है.

संशोधन और निवारण

एक immunosensor जब डिजाइनिंग प्रमुख चिंताओं में से एक biosensor संवेदनशीलता 31,32 में कमी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो ठोस सब्सट्रेट, पर बयान और patterning दौरान अवांछित रचना परिवर्तन से गुजरना करने के लिए एंटीबॉडी की संवेदनशीलता है. इस समस्या को कम करने के लिए, PSiO 2 सतह के लिए एंटीबॉडी के विकार बायोटिन एसए पुलों के माध्यम से पूरा किया है. एसए और बायोटिन सामान्यतः के कारण उनके उच्च बंधन आत्मीयता (कश्मीर डी ~ 10 -13 एम) के लिए कई जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में उपयोग किया जाता है. बायोटिन एसए लिंक biosensor विकास 10,32,33,34 में अभ्यास रिसेप्टर स्थिरीकरण के लिए सबसे आम chemistries में से एक है. immobilized एंटीबॉडी की पहुंच ठोस सतह और IgGs 31,35 के बीच एक लचीला लिंकेज प्रदान करता है कि बायोटिन एसए प्रतिक्रिया द्वारा विनियमित किया जा सकता है. इस प्रकार, PSiO 2 पहले nanostructure पर biotinylated एंटीबॉडी के विकार अनुमति देने के लिए बायोटिन / एसए के साथ biofunctionalized है.

तकनीक की सीमाएं

इस biosensing योजना का मुख्य सीमाओं बैक्टीरिया कब्जा तत्व के रूप में उपयोग एंटीबॉडी के लिए जिम्मेदार हैं. अन्य immunosensors के साथ है, हम उपलब्ध एंटीबॉडी, इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की विशिष्टता और उनके स्थिरता 36 है कि लक्ष्यों का पता लगाने के लिए सीमित हैं. प्रयोग की जाने वाली एंटीबॉडी के प्रकार के विशिष्ट आवेदन और जब भी संभव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पसंद कर रहे हैं पर निर्भर करता है. फिर भी, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्रदान कि विशिष्टता के उच्च स्तर के बावजूद, 1000 कोशिकाओं / एमएल नीचे पूरे बैक्टीरिया की कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अभी भी एक चुनौती है35. इसके अतिरिक्त, इन एंटीबॉडी के उत्पादन में शामिल उच्च लागत को ध्यान में रखा जाना चाहिए.

एक और सीमा संक्षारक / जलीय वातावरण में ऑक्सीकरण साई ट्रांसड्यूसर की रासायनिक स्थिरता के साथ जुड़ा हुआ है. लंबे समय (कई घंटे) का आयोजन जब PSiO 2 स्थिरता अभी भी, साई पतली फिल्मों की तुलना में बेहतर है, हालांकि प्रवाह प्रयोगों आधारभूत drifts 14,15,21,24 देखा जा सकता है. इसके अलावा, यह nanostructure के यांत्रिक अस्थिरता को रोकने के क्रम में (6-8 की रेंज में) तटस्थ पीएच के आसपास काम करने के पक्ष में है.

बैक्टीरिया से दूषित कर रहे हैं जो वास्तविक भोजन या पानी के नमूनों के साथ काम बेशक, जब एक उपयुक्त pretreatment प्रक्रिया से पहले संवेदन चरण पर विचार किया जाना है कि. pretreatment अध्ययन नमूना की विशिष्ट विशेषताओं के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, इस तरह के फैलाव, निस्पंदन, पीएच बीए के रूप में तैयार करने की प्रक्रियाओंलांस, आदि, माना जा सकता है. हालांकि, इन pretreatment तकनीक इस काम के दायरे से बाहर हैं.

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

तिथि करने के लिए, पता लगाने और बैक्टीरियल संदूषण की पहचान मुख्य रूप से शास्त्रीय माइक्रोबायोलॉजी संवर्धन तकनीक पर या इस तरह के जैव रासायनिक किट, एलिसा (एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख) के रूप में सूक्ष्म जीव विज्ञान में तेजी से तकनीक पर भरोसा करते हैं, और पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) 2,3 assays. इन विधियों समय लेने वाली और unfeasible 2,4,5 रहना'' इस प्रकार, परिणाम प्राप्त करने के लिए पानी और खाद्य सुरक्षा की वास्तविक समय'' मूल्यांकन कई दिनों की आवश्यकता होती है, श्रमसाध्य हैं. काम में मौजूद है, हम इन तकनीकों की खामियों को दूर करने के लिए साई आधारित biosensors की क्षमता प्रदर्शित करता है. वर्तमान biosensor अपने सेशन में परिवर्तन की निगरानी के द्वारा, एक'' प्रत्यक्ष सेल पर कब्जा'' दृष्टिकोण के माध्यम से बैक्टीरिया का एक सरल और अपेक्षाकृत संवेदनशील पता लगाने के लिए अनुमति देता हैराजनैतिक हस्तक्षेप के स्पेक्ट्रम. हमारी प्रारंभिक परिणाम 10 4 सेल / एमएल ई. के एक कम सीमा का पता लगाने प्रदर्शित कोली और कई मिनट की एक तेजी से प्रतिक्रिया समय. तुलना के लिए, वर्तमान राज्य के अत्याधुनिक सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) biosensors का पता लगाने सीमा 10 2 -10 6 सेल / एमएल 37-40 की रेंज में है. प्रतिक्रिया समय के संदर्भ में, बैक्टीरिया प्रदर्शन करने के लिए हमारे biosensors प्रतिक्रिया एसपीआर तकनीक के बराबर है. इस प्रकार, इस biosensing योजना की प्रमुख शक्तियों लक्ष्य बैक्टीरिया का "वास्तविक समय" की पहचान के लिए अनुमति देता है परख और तेजी से पता लगाने की सादगी हैं.

भविष्य अनुप्रयोगों

कई तरीकों वर्तमान के बजाय पूरे एंटीबॉडी के एंटीबॉडी टुकड़े का उपयोग, एंटीबॉडी एकाग्रता और अभिविन्यास का अनुकूलन सहित biosensor की सीमा का पता लगाने और संवेदनशीलता, सुधार करने के लिए लगाया जा रहा है. इसके अतिरिक्त, हम उपयुक्त की क्षमता का अध्ययन कर रहे हैंवैकल्पिक कब्जा जांच के रूप में amers. अंत में, यहाँ प्रस्तुत काम सूक्ष्म जीवाणुओं की एक किस्म के कई biosensing आवेदन करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है कि एक सामान्य biosensing मंच प्रदान करता है.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

Biosensor का अनुकूलतम प्रदर्शन को प्राप्त करने के लिए, यह PSiO 2 scaffolds (प्रोटोकॉल पाठ में धारा 3, फ्लोरोसेंट लेबलिंग और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी देखें) की biofunctionalization पुष्टि करने के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है. प्रतिदीप्ति पढ़ाई हमें ट्रांसड्यूसर (PSiO 2) सतह के लिए एंटीबॉडी की कुर्की की पुष्टि के लिए और एक नियंत्रण के रूप में के बंधन से, गतिविधि और संलग्न एंटीबॉडी के प्रतिजनी विशिष्टता fluorescently विरोधी खरगोश आईजीजी और विरोधी माउस आईजीजी टैग की गईं चिह्नित करने के लिए अनुमति देते हैं .

इसके अलावा, ऑप्टिकल readout में झूठी परिणामों को खत्म करने के क्रम में, यह ठीक से biosensor निम्नलिखित exposu की सतह कुल्ला करने के लिए आवश्यक हैलक्ष्य बैक्टीरिया को फिर से और साफ PSiO 2 के साथ नियंत्रण प्रयोगों का संचालन करने के लिए (nonspecifically बाध्य या सतह पर रहते हैं जो बैक्टीरिया की कोशिकाओं को हटाने के लिए). नियंत्रण प्रयोग के महत्व (जीवाणु सेंसिंग, प्रोटोकॉल पाठ में धारा 5 देखें) biosensor सतह पर unspecific बैक्टीरिया सोखना के उन्मूलन के लिए है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

यह काम इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान सं 1118-1108 और अनुदान सं 1146-1112) और मिन्ना Kroll मेमोरियल रिसर्च फंड ने सहारा दिया. ते कृतज्ञता रसेल Berrie नैनो संस्थान की वित्तीय सहायता मानता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%) Merck 101513
Ethanol absolute Merck 818760
PBS buffer solution (pH 7.4) prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) Sigma Aldrich Chemicals 175617
PEO-iodoacetyl biotin Sigma Aldrich Chemicals B2059
Streptavidin (SA) Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 115-095-003
Biotinylated E. coli antibody Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 1007
E. coli (K-12) was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

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References

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Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).More

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).

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