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Bioengineering

의 광학 검출 doi: 10.3791/50805 Published: November 20, 2013
* These authors contributed equally

Summary

급속한 균 검출 용 라벨없는 광 바이오 센서가 도입된다. 바이오 센서의 표면에 직접 표적 균 세포를 포착하기 위해 디자인 된 나노 다공성 실리콘에 기반하고있다. 우리는 포획 프로브로서, 다공질 변환기에 고정화 된 모노클로 날 항체를 사용한다. 우리의 연구는 (같은 세포 용해와 같은) 더 이전의 샘플 처리와 분 이내에 낮은 세균 농도의 검출에 대해 이러한 바이오 센서의 적용 가능성을 보여줍니다.

Abstract

나노 다공성 실리콘을 기반으로하는 레이블의 광학 바이오 센서 모델 미생물로, 대장균 K12 박테리아의 빠른 캡처 및 탐지를 위해 설계되었습니다. 연구 시료 (세포 용해에 의해 예)에는 전처리가 필요하지 않습니다 동안 바이오 센서는 표면에 대상 박테리아 세포의 직접 결합에 의존하고있다. 포러스 Si 박막은 바이오 센서의 광 변환 소자로서 사용된다. 백색광 조명 아래에서, 다공성 층은 반사율 스펙트럼에서 잘 해결 페 브리 - 페로 프린지 패턴을 표시합니다. 고속 푸리에 단일 피크의 반사율 데이터 결과로 변환 (FFT)을 적용. FFT 피크의 강도의 변화는 모니터링됩니다. 따라서, 목표 세균은 항체 - 항원 상호 작용을 통해, 바이오 센서의 표면에 포착 박테리아 부속의 '실시간'관측을 허용 FFT 피크의 강도에 측정 가능한 변화를 유발한다.

NT "> 전기 화학적 양극 산화 공정에 의해 제조 된 메조 포러스 Si 막는, 목표 세균 특정 단일 클론 항체와 접합된다. 고정화 immunoactivity 및 항체의 특이성은 형광 라벨링 실험에 의해 확인된다. 바이오 센서에 노출되면 타겟 박테리아, 세포를 직접 항체 개질 다공질 실리콘 표면에 포착된다. 이들 특정 캡쳐 이벤트가 바이오 센서의 박막 광학 간섭 스펙트럼의 강도 변화의 원인. 우리는 이러한 바이오 센서 (검출 비교적 낮은 균 농도를 검출 할 수 있음을 입증 시간 미만 10 4 세포 / ml)의 제한입니다.

Introduction

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병원성 세균의 초기 정확한 식별은 음식과 물 안전, 환경 모니터링, 점의 배려 진단 1를 위해 매우 중요하다. 전통적인 미생물학 기술은 시간이 힘들고, 소모적이며, "실시간"또는 실험실 환경 외부 미생물을 감지하는 능력을 결여 같이, 바이오 센서는 이러한 과제 2-5을 충족하도록 진화하고있다.

최근 몇 년 동안, 다공성 실리콘 (PSI)은 센서와 바이오 센서 6-20의 디자인을위한 유망한 플랫폼으로 떠오르고있다. 지난 십 년간 PSI 기반의 광 센서 및 바이오 센서에 관한 많은 연구가 (21, 22)를 발표했다. 나노 PSI 층은 전형적으로, 단결정 실리콘 웨이퍼로부터 전기 화학적 양극 에칭에 의해 제조된다. 그 결과 PSI의 나노는 큰 표면 및 무료 볼륨으로 많은 유리한 특징을 전시, 제어 할 수있는 크기와 조정 가능한 OPTI 기공칼 속성 10,16. 이러한 광 발광 8,11과 흰색 빛의 반사율 기반의 간섭 7,19로 PSI 층의 광학적 특성은, 강력하게 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 광 발광 스펙트럼 변조 또는 반사율 스펙트럼 (10)의 파장 변화로 관찰 필름의 평균 굴절률 변화에 다공질 층 결과 사이 숙박객 분자 / 분석 대상 물질의 캡처.

PSI 광 바이오 센서 기술의 광대 한 혁신 있지만, 박테리아 검출 6,8,20,23-29에 대한 PSI 기반 플랫폼에서만 몇 가지보고가있다. 또, 이러한 개념 증명 연구의 대부분은 "간접"균 검출을 증명하고있다. 따라서, 세포의 용해는 일반적으로 선행 연구 균 29 특성상 표적 단백질 / DNA 단편을 추출하는 것이 요구된다. 우리의 접근 방법은 직접적으로 표적 균을 포착하는 것이다PSI 바이오 센서 상에 세포. 따라서 박테리아를 대상으로 특정 단일 클론 항체는, 다공성 표면에 고정되어있다. 항체 - 항원 상호 작용을 통해, 박테리아 세포의 결합은, 바이오 센서의 표면에 반사율 스펙트럼 24-26의 진폭 (강도)의 변화를 유도한다.

이 작품에서 우리는 광학 PSI 기반의 바이오 센서의 구조에보고하고 대장균의 검출 (대장균) (모델 미생물로 사용) K12 박테리아. 모니터의 레이블이없는 바이오 센서 플랫폼으로의 응용을 보여 광 신호로 인해 페 브리 - 페로 박막 간섭 (그림 1A)에 PSI 나노 구조에서 반사 된 빛이다. 빛의 진폭 / 강도의 변화는 빠른 탐지 및 박테리아의 정량화를 허용, 바이오 센서 표면에 대상 박테리아 세포의 특정 고정 상관 관계가있다.

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Protocol

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1. 산화 된 다공성 SiO2로 제조

  1. 일정한 전류에서 30 초 동안 수성 HF과 무수 에탄올의 3:1 (V / V) 용액에 에칭 실리콘 웨이퍼 (단 하나 측이 <100>의 얼굴에 광택과 도핑 된 p 형, 0.0008 Ω · cm) 385mA / cm 2의 밀도. HF는 부식성 액체이며, 그것은 극단적 인주의하여 취급해야한다는 것을주의하시기 바랍니다.
  2. 절대 에탄올을 생성 된 다공성 실리콘 (PSI) 필름의 표면을 여러 번 헹구고, 건조 질소 가스하에 필름을 건조.
  3. 주변 공기에서 1 시간 동안 800 ° C (해제, 1 시간 동안 노에두고, 800 ° C로 가열로 가열, 실내 온도에서 가열로에서 샘플을 장소에서 튜브로에서 갓 에칭 PSI 샘플을 산화 용광로) 만 실온에서로에서 샘플을 제거합니다.

2. PSiO 2 발판의 Biofunctionalization

  1. 산화 된 PSI (PSI를 품어O 2) 메르 캅토에서 1 시간 (톨루엔 트리 메 톡시-3) 95 % (MPTS) 솔루션 (108 MM)에 대한 샘플.
  2. 톨루엔, 메탄올 및 아세톤으로 실란 처리 PSiO이 샘플을 씻어, 건조 건조 질소 가스하에.
  3. 100 ㎜ PEO-요오 비오틴 용액 1 ㎖에 30 분간 실란 변성 PSiO이 시료를 배양한다.
  4. 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS) 용액을 여러 번 비오틴 처리 PSiO 2 샘플을 씻어.
  5. 100 ㎍ / ㎖의 스트렙 타비 딘 (SA) 용액 1 ㎖에 30 분간 비오틴 - 수정 PSiO 2 샘플을 품어.
  6. 0.1 M PBS 용액을 여러 번 SA 처리 PSiO 2 샘플을 씻어.
  7. 100 ㎍ / ㎖의 바이오틴 E. 1 ㎖에 30 분 동안 생성 된 SA-수정 PSiO 2 샘플을 품어 대장균 단일 클론 항체 (면역 글로불린 G, IgG의) 용액 또는 100 ㎍ / ㎖의 바이오틴 - 토끼 IgG를 가진 (단일 클론 항체 모델로).

3. 형광 라벨 및 형광 현미경

  1. 15 ㎍ / ㎖의 형광 (FITC)와 IgG의 수정 표면을 품어 40 분 동안 항 토끼 IgG의 태그 및 15 ㎍ / ㎖의 형광 (FITC)와 컨트롤로 안티 마우스 IgG의 태그.
  2. 0.1 M PBS 용액을 여러 번와 수정 된 샘플을 씻어.
  3. 형광 현미경으로 샘플을 검사합니다.

4. 박테리아의 문화

  1. E.에게 경작 대장균 K12의 루리아 베르 타니 (LB) 배지 (: 염화나트륨, 효모 추출물 5 g의 5 g을, 그리고 트립 톤 10 g의 탈 이온수 1 L 중간 구성) 5 ㎖와 10 ㎖ 튜브에 박테리아. 박테리아가 하룻밤 37 ℃에서 진탕 배양한다
  2. 600 ㎚의 파장에서의 광학 밀도 (OD)를 판독함으로써 박테리아 농도를 모니터링한다. LB 배지에서 밤새 성장 후, 박테리아의 농도를 결정하는 분광 광도계를 사용하여 OD (600)를 읽는다. 세포의 수는이다 디레OD 600 측정 (1 OD 600 = 10 8 세포 / ml)에 ctly 비례.

5. 박테리아 검출

  1. IgG의 수정 PSiO 2 깔끔한 PSiO 2 (제어)을 맞춤 제작 플렉시 유리 흐름 세포의 샘플을 놓습니다. 샘플 반사율이 모든 측정시 같은 장소에서 측정 될 수 있도록 흐름 ​​셀을 수정합니다.
  2. E.와 샘플을 품어 실온에서 30 분 동안 대장균 K12 현탁액 (104 세포 / ㎖). 그런 다음 30 분 동안 V 식염수 / W 0.85 %로 셀을 세척하여 세균 현탁액을 제거합니다.
  3. 실험을하는 동안 반사율 데이터의 변경 사항을 모니터링합니다. 모든 광학 측정은 주변 수계에서 수행 될 필요가있다. 스펙트라는 CCD 분광계를 사용하여 데이터를 수집하고 (25), (26)을 앞서 설명한 바와 같이 고속 푸리에 변환 (FFT)에 변환을 적용함으로써 분석되어야한다.
  4. 에 박테리아의 존재를 확인할바이오 센서의 표면 바로 바이오 센싱 실험 후 수직 광학 현미경으로 시료의 관찰.

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Representative Results

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프로토콜 문자 섹션에서 설명한 산화 PSI (PSiO 2) 필름을 제조한다.도 1b는 열 산화 처리 후의 결과 PSI 필름의 고해상도 주사 전자 현미경 사진을 나타낸다. PSiO 2 층은 30 ~ 80 ㎚의 범위의 직경을 갖는 잘 정의 된 원통형 세공에 의해 특징된다.

단일 클론 항체 (IgG의) 분자는 비오틴-SA 시스템과 함께 잘 설립 실란 화 기술을 사용하여 PSiO 2 표면에 이식된다. 자세한 합성 방식은 그림 2에 설명되어 있습니다. 우선, 열 산화막 표면을 티올 - 실란 화 된 표면 (도 2C)의 결과 MPTS하여 실란 화된다. 다음 단계에서, 활성화 된 표면은 비오틴-SA 교량을 통해 비오틴 변성 표면 SA 단백질의 부착 하였다 SH-반응성 비오틴 링커 분자 (도 2D)와 인큐베이션 (그림 2E). 바이오 센서 표면의 작용의 마지막 단계는 SA (그림 2 층)에 바이오틴 단일 클론 항체의 바이오 콘쥬 게이션을 포함한다.

PSiO이 표면에 항체의 부착은 형광 현미경으로 표면을 관찰 하였다 형광 라벨링에 의해 확인된다. 또한, 형광 연구는 우리의 찬란 컨트롤로 안티 - 토끼 IgG의 안티 - 마우스 IgG 태그를 결합하여 표면 고정화 항체 (토끼의 IgG)의 활동과 항원 특이성을 특성화 할 수 있습니다. 3이 실험의 결과를 요약 한 그림 .

박테리아 바이오 센서를 설명하기 위해 우리는 특정 E.을 사용했습니다 콜라이의 IgG 대신 모델의 IgG (토끼의 IgG). 다시, 접근 PSiO이 nanostr로부터 반사되는 빛의 진폭 (강도)의 변화를 모니터하는 것이다ucture. 검출 실험을하는 동안, 바이오 센서는 샘플 반사율이 모든 측정시 같은 장소에서 측정되는 것을 보장하기 위해, 플로우 셀에 고정되어 있습니다. 전체 실험은 습식 환경에서 수행되며 샘플 반사율 스펙트럼은 연속적으로 모니터링된다. 바이오 센서는 E.에 노출 완충 용액 (비 부착 된 박테리아의 제거를 위해) 바이오 센서 표면을 세척하는 데 사용 된 후 30 분에 대한 대장균 K12 현탁액 (104 세포 / ㎖). E. 도입 전후 바이오 센서의 FFT 스펙트럼 대장균 박테리아 (10 4 세포 / ml)를도 4a (상단)에 표시됩니다. E.에 따라서, 다음과 같은 노출 사소한 변경 (FFT 강도보다 0.5 % 감소)가 수정되지 않은 PSiO 2면 (그림 4B, 상단)에 대해 관찰하는 동안 대장균 박테리아 (이후 헹굼 단계) 7 ± 1 %의 강도 감소가 기록되어있다. 또한,에 오PSiO이 표면에 캡쳐 된 세포의 존재를 확인할 rder를 어떠한 세포가 관찰되는 반면, 바이오 센서는 즉시 바이오 센싱 실험 완료.도 4a (바닥) 디스플레이는 바이오 센서 표면에 세균 세포를 고정화 한 후 광학 현미경으로 관찰 수정되지 않은 표면 (제어)에,도 4b (아래)를 참조하십시오.

그림 1
고속 푸리에 변환 (오른쪽) 다음과 같은 변형 전형적인 페 브리 - 페로 PSiO 2 나노 구조 (왼쪽)와 대응하는 스펙트럼의 그림 1. (A) 전형적인 반사율 스펙트럼. 결과 단일 피크의 위치와 크기가 모니터링됩니다. (B) 단면 고해상도 주사 전자 현미경 (SEC385mA / ㎠에서 30 초 동안 에칭 PSiO 2 층 ()의 ondary 전자).

그림 2
합성 단계의도 2. 개략적 인 대표 항체 PSiO이 표면 biofunctionalize하도록 하였다. (a) 양극 전기 화학적 에칭은 단결정 실리콘 웨이퍼로부터 PSI 층을 제조하는데 사용된다. (b)는 갓 에칭 시료를 열 800 ℃에서 산화 (C) PSiO 2면은 처음에 무료 티올 기 표면 (활성화 PSiO 2 막)을 만들 MPTS와 반응. (d) 바이오틴 표면을 생성하는 PEO-요오 비오틴으로 활성화 막의 인큐베이션. 바이오틴의의 (E) 창업 보육SA와 urface. (F) 비오틴 항체 표면 개질의 인큐베이션. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
도 3. 고정화의 IgG의 활성 및 항원 특이성을 확인하기 위하여 형광 표지 실험 결과. 시료는 일정한 노광시 형광 현미경으로 관찰된다. (A)을 완료 바이오 콘쥬 게이션, PSiO 2 + 비오틴 + MPTS + SA + 비오틴 - 토끼의 IgG와 FITC-항 토끼 IgG의, (B) FITC 안티 마우스 IgG의와 제어 실험, (C) 제어 실험, 아무의 IgG, PSiO 2 + MPTS + 비오틴 + SA와 FITC-항 토끼 IgG의.

참고 :이 회로도 illustrat 용만의 IgG의 결합으로 이온의 목적은 모공 내부에 발생합니다.

그림 4
그림 4. E. 대장균 바이오 센싱 실험 즉시 실험 후 바이오 센서의 해당 광학 현미경 이미지. 바이오 센서는 104 세포 / ㎖ E.으로 배양 대장균 현탁액. 키 : () PSiO 2, (B) 스트레이트 (수정되지 않은) PSiO 2 IgG의 수정.

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Discussion

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PSiO 2 나노 구조체 (페롯 박막)에 근거 라벨없는 광 immunosensor가 제작되고, 균 검출을위한 바이오 센서로서의 적용 가능성이 확인된다.

수정 및 문제 해결

immunosensor을 설계의 주요 관심사 중 하나는 바이오 센서 감도 31,32의 감소로 이어질 수 고체 기판 상에 증착 및 패터닝 중에 바람직하지 않은 형태의 변화를 겪는 항체의 감수성이다. 이 문제를 최소화하기 위해, PSiO 2 표면에 항체의 결합은 비오틴-SA 다리를 통해 수행됩니다. SA와 비오틴은 일반적으로 인해 높은 결합 친 화성 (K의 D ~ 10 -13 M)에 많은 생명 공학 응용 프로그램에 사용됩니다. 비오틴-SA 링크는 바이오 센서 개발 10,32,33,34에서 실시 수용체 고정화를위한 가장 흔한 화학 물질 중 하나이다. 고정 된 항체의 접근성은 고체 표면과 IgG를 31,35 사이의 유연한 연결을 제공하는 비오틴-SA 반응에 의해 조절 될 수있다. 따라서, PSiO이 먼저 나노 구조물 상에 비 오티 닐화 된 항체의 접합을 허용하도록 비오틴 / SA로 biofunctionalized된다.

기술의 한계

이 바이오 센싱 방식의 주요 제한은 박테리아 포획 소자로서 사용 된 항체에 기인한다. 다른 immunosensors와 같이, 우리는 가능한 항체, 사용 된 항체의 특이성과 그 안정성 (36)가 대상의 검출로 제한됩니다. 사용되는 항체의 종류는 특정 응용 프로그램과 가능한 한 단일 클론 항체가 바람직하다에 따라 달라집니다. 그러나, 단일 클론 항체가 제공하는 특이성의 고차 불구 1,000 세포 / ml 이하 전체 박테리아 세포의 검출은 여전히​​ 도전35. 또한 이러한 항체의 생산에 관련된 높은 비용을 고려하여야한다.

또 다른 한계는 부식성 / 수성 환경에서 산화 PSI 변환기의 화학적 안정성과 관련이 있습니다. 오래 (몇 시간)을 수행 할 때 PSiO 2 안정성이 여전히 PSI 박막에 비해 우수하다,하지만 흐름 실험 기준이 감도는 14,15,21,24를 관찰 할 수있다. 또한,이 나노 구조물의 기계적 불안정을 방지하기 위해 (6-8의 범위에서) 중성 pH를 해결하기 위해 선호된다.

세균에 오염되는 실제 식품이나 물 샘플을 다룰 때 물론, 적합한 전처리 공정 전에 감지 단계로 간주되어야한다는. 전처리 공부 샘플의 특정한 특성에 따라 설계되어야한다. 예를 들어, 분산, 여과, pH가 바륨 등 준비 절차랜스 등이 고려 될 수있다. 그러나 이러한 전처리 기술은이 작품의 범위를 벗어납니다.

기존의 방법에 대한 중요성

지금까지, 검색 및 박테리아 오염 물질의 식별은 주로 고전 미생물 배양 기법 또는 생화학 장비, ELISA (효소 결합 면역 분석법) 등 미생물의 급격한 기술에 의존하고, PCR (중합 효소 연쇄 반응) 2,3 분석법. 이러한 방법은 시간이 오래 걸리고이 실현성 2,4,5 남아 '' 따라서, 결과를 얻기 위해 물, 식품 안전 실시간 '' 평가를 몇 일을 필요 힘드는이다. 본 연구에서, 우리는이 기술의 단점을 극복하기 위해 PSI 기반의 바이오 센서의 기능을 보여줍니다. 현재 바이오 센서는 영업 이익의 변화를 모니터링하여, '직접 세포 캡처'방식을 통해 박테리아의 간단하고 상대적으로 민감한 검출을 허용tical 간섭 스펙트럼. 우리의 예비 결과는 10 4 세포 / ㎖ E.의 낮은 검출 한계를 표시 대장균과 몇 분의 빠른 응답 시간. 비교를 위해, 현재 최첨단의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오 센서의 검출 한계는 10 2 -10 6 세포 / ㎖ 37-40의 범위이다. 응답 시간의 관점에서, 박테리아에 노출 트립 바이오 센서 응답은 SPR 기술의 비교이다. 따라서,이 바이오 센서 방식의 주요 장점은 대상 박테리아의 "실시간"확인을 허용 분석과 신속한 검출 단순하다.

미래의 응용 프로그램

몇몇 접근법은 현재 대신 전체 항체의 항체 단편을 사용하여 항체 농도와 방향의 최적화를 포함한 바이오 센서의 검출 한계 및 민감도를 향상시키기 위해 탐구되고있다. 또한, 우리는 적절한의 가능성을 연구하고있다다른 캡처 프로브로 amers. 결론적으로, 여기에 제시된 작품은 다양한 미생물의 많은 바이오 센서의 응용 프로그램으로 변환 할 수있는 일반적인 바이오 센서 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜 내에서 중요한 단계

바이오 센서의 최적의 성능을 달성하기 위해서는, PSiO이 지지체 (프로토콜 텍스트 부 (3), 형광 라벨 및 형광 현미경을 참조) biofunctionalization을 확인하기 위하여 매우 중요하다. 형광 연구는 우리가 트랜스 듀서 (PSiO 2) 표면에 항체의 첨부 파일을 확인하고 컨트롤로의 바인딩, 활동 및 첨부 된 항체의 항원 특이성을 찬란 항 토끼 IgG의 안티 - 마우스 IgG 태그가 달린 특성화 할 수 있도록 .

더욱이, 광학 판독에 거짓 결과를 해소하기 위해, 그것은 적절하게 바이오 센서 다음 exposu의 표면을 세척 할 필수적인타겟 박테리아 리 깔끔한 PSiO 2 제어 실험을 수행하도록 (비특이적 결합 또는 표면에 상주 박테리아 세포의 제거를 위해). 제어 실험의 중요성은 (박테리아 감지, 프로토콜 텍스트 섹션 5 참조) 바이오 센서 표면에 불특정 박테리아 흡착 제거입니다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 1118년에서 1108년까지 및 승인 번호 12분의 1,146)와 미나 크롤 기념 연구 기금에 의해 지원되었다. ES는 기꺼이 러셀 Berrie 나노 기술 연구소의 재정 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%) Merck 101513
Ethanol absolute Merck 818760
PBS buffer solution (pH 7.4) prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) Sigma Aldrich Chemicals 175617
PEO-iodoacetyl biotin Sigma Aldrich Chemicals B2059
Streptavidin (SA) Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 115-095-003
Biotinylated E. coli antibody Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 1007
E. coli (K-12) was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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의 광학 검출<em&gt; E. 대장균</em메조 포러스 실리콘 바이오 센서에 의해&gt; 박테리아
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Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).More

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).

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