A detecção óptica de<em> E. coli</em> Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores
Summary
Um biossensor ótico sem rótulo para detecção de bactérias rápidas é introduzido. O biossensor é baseado num nanoestruturada de Si poroso, que se destina a captar directamente as células de bactérias alvo na sua superfície. Usamos os anticorpos monoclonais imobilizados, para o transdutor poroso, como as sondas de captura. Os nossos estudos demonstram a aplicabilidade destes biosensores para a detecção de concentrações baixas de bactérias dentro de minutos, sem processamento prévio da amostra (tal como a lise das células).
Abstract
Um biossensor óptico livre de rótulo com base em uma nanoestruturada Si poroso foi concebido para a captura rápida e detecção de bactérias de Escherichia coli K12, tal como um modelo de microorganismo. O biossensor se baseia em ligação directa das células das bactérias alvo na sua superfície, enquanto que nenhum pré-tratamento (por exemplo, através de lise celular), da amostra em estudo é necessário. Uma película fina mesoporoso Si é utilizada como o elemento de transdutor óptico do biossensor. Sob iluminação com luz branca, a camada porosa mostra bem resolvidas padrões de franjas de Fabry-Perot em seu espectro de reflectividade. Aplicando uma transformação rápida de Fourier (FFT) para reflectividade resultados dados em um único pico. As alterações na intensidade do pico da FFT são monitorados. Assim, as bactérias alvo capturar sobre a superfície do biossensor, através de interacções anticorpo-antigénio, induz alterações mensuráveis na intensidade dos picos de FFT, que permitem uma observação "tempo real" de fixação das bactérias.
nt "> O filme mesoporoso Si, fabricado por um processo de anodização electroquímica, é conjugado com anticorpos monoclonais, específicos para as bactérias alvo. A imobilização, imunoactividade e especificidade dos anticorpos são confirmadas por experiências de marcação fluorescentes. Assim que o biossensor é exposta ao bactérias alvo, as células são directamente capturado na superfície de Si poroso com a modificação de anticorpos. Estes eventos de captura específicas resultar em alterações de intensidade na película fina do espectro de interferência óptica do biossensor. Nós demonstramos que estes biossensores podem detectar concentrações relativamente baixas de bactérias (detecção limite de 10 4 células / mL) em menos de uma hora.Introduction
Precoce e preciso de identificação de bactérias patogênicas é extremamente importante para a segurança alimentar e água, monitoramento ambiental, e de ponto-de-cuidados diagnósticos 1. Como técnicas de microbiologia tradicionais são demorados, trabalhoso, e não têm a capacidade de detectar microorganismos em "tempo real" ou fora do ambiente de laboratório, biossensores estão evoluindo para enfrentar esses desafios 2-5.
Nos últimos anos, o Si poroso (psi) tem emergido como uma plataforma promissora para o desenho de sensores e biossensores 6-20. Na última década, vários estudos sobre sensores e biossensores ópticos baseados em psi foram publicados 21,22. A camada nanoestruturado PSi normalmente é fabricado por ataque anódico eletroquímica de um único cristal de Si wafer. Os nanomateriais PSI resultantes exibem muitas características vantajosas, como grande superfície e volume livre, pore tamanhos que podem ser controlados e sintonizável optipropriedades cal 10,16. As propriedades ópticas da camada PSi, como fotoluminescência 8,11 e luz branca à base de reflectância interferometria 7,19, são fortemente influenciados pelas condições ambientais. Captura de hóspedes analitos moléculas / alvo dentro da camada porosa em resultados de uma mudança no índice de refracção médio do filme, observada como uma modulação em espectro de fotoluminescência, ou como um desvio de comprimento de onda no espectro de reflectividade 10.
Embora a grande inovação em tecnologia de biosensor óptico PSi, só há poucos relatos sobre plataformas baseadas em PSI para bactérias detecção 6,8,20,23-29. Além disso, a maioria desses estudos de prova de conceito demonstraram "indireta" de detecção de bactérias. Assim, em geral, antes de lise das células é necessário para extrair os fragmentos de proteína / ADN-alvo, característicos para as bactérias estudadas 29. Nossa abordagem é captar diretamente a bactéria alvocélulas para o biossensor psi. Portanto, os anticorpos monoclonais, que são específicos para alvejar as bactérias, são imobilizadas sobre a superfície porosa. A ligação de células de bactérias, através de interacções anticorpo-antigénio, para a superfície do biossensor induzir alterações na amplitude (intensidade) do espectro de reflectividade 24-26.
Neste trabalho, relatamos a construção de um biossensor à base de PSi óptica e demonstrar a sua aplicação como uma plataforma biosensing livre-label para a detecção de Escherichia coli (E. coli) bactérias K12 (usado como um modelo de microorganismos). The monitorados sinal óptica é a luz reflectida a partir da nanoestrutura PSi devido Fabry-Perot de interferência de película fina (Figura 1A). As alterações na amplitude de luz / intensidade são correlacionados para imobilização específica das células de bactérias alvo para a superfície do biossensor, permitindo a rápida detecção e quantificação das bactérias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um imunossensor óptica livre de etiqueta, com base em um Psio 2 nanoestrutura (um filme fino de Fabry-Perot) é fabricada, e a sua aplicabilidade potencial como um biosensor para a detecção de bactérias é confirmada.
Modificações e solução de problemas
Uma das principais preocupações na concepção de um imunossensor é a susceptibilidade de anticorpos a sofrer alterações de conformação indesejáveis durante a deposição e modelaçã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Israel Ciência (concessão n º 1118-1108 e concessão n º 1146/12) e do Fundo de Investigação Kroll Memorial Minna. ES agradece o apoio financeiro do Instituto de Nanotecnologia Russell Berrie.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
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