Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Optik Algılama doi: 10.3791/50805 Published: November 20, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Bakterilerin hızlı tespiti için bir etiket içermeyen optik biyosensör sokulur. Biosensor direkt olarak yüzey üzerine, hedef bakteri hücreleri yakalamak için tasarlanmış bir nano yapılı gözenekli Si, dayanmaktadır. Bu yakalama problar olarak, gözenekli transdüktörün üzerine immobilize monoklonal antikorları kullanır. Çalışmalarımız (örneğin, hücre liziz gibi) önceden bir numune işleme ile birkaç dakika içinde, düşük bakteriyel konsantrasyonlarının saptanması için, bu biyosensör uygulanabilirliğini göstermektedir.

Abstract

Nano yapılı bir gözenekli Si göre bir etiket içermeyen optik biyosensör model bir mikroorganizma olarak, Escherichia coli K12 bakterilerin hızlı yakalanması ve teşhisi için tasarlanmıştır. Incelenen numunenin (hücre lizizi ile) herhangi bir ön-muamele gerekli iken biosensor, kendi yüzeyi üzerine hedef bakteri hücrelerinin doğrudan bağlanma dayanır. Bir gözenekli Si ince film biyosensör optik dönüştürücü eleman olarak kullanılır. Beyaz ışık aydınlatma altında, gözenekli katman kendi yansıtma spektrumu iyi bir çözüme Fabry-Perot saçak desenleri görüntüler. Hızlı Fourier tek bir zirve yansıtma veri sonuçlarına (FFT) dönüşümü uygulamak. FFT tepe yoğunluğuna değişiklikler izlenir. Bu nedenle, hedef bakteri, bir antikor-antijen etkileşimleri yoluyla bir biyo-algılayıcı yüzeyi üzerine yakalama bakteri ek bir "gerçek zamanlı" gözlem için izin FFT piklerin yoğunluğu ölçülebilir bir değişiklik, neden olur.

nt "> elektrokimyasal anotlama işlemi ile imal edilmiş gözenekli Si film, hedef bakterilere özel monoklonal antikorlar ile konjuge edilir. Hareketsizleştirme, immunoactivity ve antikor özgüllüğü floresan etiketleme deneyleri ile teyit edilir. biyosensör için ortaya çıktığında Hedef bakteri, hücreler direkt olarak antikor ile modifiye edilmiş gözenekli Si yüzeyi üzerine yakalanır. Bunlar, belli olaylar yakalama biyosensör ince film optik girişim spektrumu yoğunluk değişikliklere neden olmaktadır. Bunların biyosensörler (saptama, nispeten düşük bakteri konsantrasyonu algılayabilir olduğunu göstermektedir Bir saatten az 10 4 hücre / ml) sınırı.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Patojenik bakterilerin erken ve doğru tespit gıda ve su güvenliği, çevresel izleme ve nokta-bakım teşhis 1 için son derece önemlidir. Geleneksel mikrobiyoloji teknikleri zaman zahmetli, alıcı, ve "gerçek-zamanlı" veya laboratuvar ortamı dışında mikroorganizmaları tespit yeteneğinden yoksun olarak, biyosensörler bu zorlukların 2-5 karşılamak için gelişmektedir.

Son yıllarda, gözenekli Si (PSI) sensörler ve biyosensör 6-20 tasarımı için umut verici bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Geçtiğimiz on yıl içinde PSi-tabanlı optik sensörler ve biyohissedicilerin ilgili çok sayıda çalışmalar 21,22 yayınlandı. Nano yapılı PSi tabaka tipik olarak, tek-kristal Si gofret anodik elektro-kimyasal bir dağlama aracılığı ile imal edilmektedir. Elde edilen nano PSi gibi büyük yüzeyi ve serbest hacmi olarak çok avantajlı özellikler sergiler, kontrol edilebilir ve ayarlanabilir boyutları Opti gözenekcal özellikleri 10,16. Böyle fotolüminesans 8,11 ve beyaz ışık yansıtma tabanlı interferometri 7,19 olarak PSi tabakasının optik özellikleri, çevresel şartlardan etkilenmektedir. Fotolüminesans spektrumda bir modülasyon veya yansıtma spektrumu dalga boyu 10 bir kayma olarak gözlenen film, ortalama kırılma endeksi bir değişiklik ile, gözenekli tabaka sonuçları içinde konuk moleküllerin / hedef analitlerin Capture.

PSi optik biyosensör teknolojisinde büyük yenilik olsa da, bakteri tespiti 6,8,20,23-29 için PSi-tabanlı platformlarda sadece birkaç raporlar vardır. Buna ek olarak, bu proof-of-concept çalışmaların çoğu "dolaylı" bakteriler tespit göstermiştir. Bu durumda, hücre, genellikle önce lizis üzerinde çalışılan bakteriler 29 karakteristik hedeflenen protein / DNA fragmanları elde etmek için gereklidir. Bizim yaklaşım doğrudan hedef bakteri yakalamak içinPSi biyosensöründeki üzerine hücreler. Bu nedenle, hedef bakteri için özel olan monoklonal antikorlar, gözenekli yüzey üzerine immobilize edilir. , Antikor-antijen etkileşimleri yoluyla, bakteri hücrelerinin bağları, biyosensör yüzeyine yansıtma spektrumu 24-26 genliği (yoğunluk) içinde değişikliklere sebep olur.

Bu çalışmada, bir optik PSi bazlı biyosensör yapımı hakkında rapor ve Escherichia coli tespiti (E. coli) (model mikroorganizma olarak kullanılan) K12 bakteri. Izlenmesi için bir etiket içermeyen biyo-algılayıcı platformu olarak uygulanmasını göstermek optik sinyal nedeniyle Fabry-Perot ince film girişim (Şekil 1A) için PSi nano yansıyan ışıktır. Işık genlik / yoğunluğundaki değişiklikler hızlı algılama ve bakterilerin miktarının sağlayan, biyosensör yüzeyi üzerine hedef bakteri hücrelerinin spesifik hareketsizliğe bağlı olarak ilişkilidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Oksidize Gözenekli SiO 2 hazırlanması

  1. Sabit akımda 30 saniye boyunca, sulu HF ve mutlak etanol 3:1 (v / v) çözelti içinde Etch Si gofret (tek taraflı <100> yüzünde parlatılmış ve ağır katkılı, p-tipi, 0.0008 Ω · cm) 385 mA / cm 2 yoğunluğu. HF oldukça aşındırıcı sıvı ve aşırı dikkatle ele alınması gerektiğini unutmayın.
  2. Mutlak etanol ile elde edilen gözenekli Si (PSI) filmin yüzeyi birkaç kez duruladıktan sonra, bir kuru azot gazı altında kuru filmler.
  3. Havadaki 1 saat boyunca 800 ° C (rahatsız edecek, 1 saat boyunca fırında bırakmak, 800 ° C'ye kadar ısıtmak, oda sıcaklığında, fırın içindeki numuneyi bir tüp fırın içinde taze kazınmış PSi örnekleri okside ve fırın) Sadece oda sıcaklığında fırından örnekleri çıkarın.

2. PSiO 2 iskelelerinin Biofunctionalization

  1. Oksitlenmiş psi (PSi inkübeO 2) merkaptopropil 1 saat (toluen trimetoksisilan-3)% 95 (MPTS) çözeltisi (108 mM) örneği.
  2. , Tolüen, metanol ve aseton ile muamele edilmiş silan PSiO 2 örnek yıkayınız, kuru Bir kuru azot gazı altında.
  3. 100 mM PEO-iodoasetil biotin solüsyonu 1 ml, 30 dakika için silan-modifiye PSiO 2 örnek inkübe edin.
  4. 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile birkaç kez biyotin ile tedavi edilen PSiO 2 örnek durulayın.
  5. 100 ug / ml streptavidin (SA) çözeltisi 1 ml, 30 dakika boyunca biyotin ile modifiye edilmiş PSiO 2 örnek inkübe edin.
  6. 0.1 M PBS solüsyonu birkaç kez ile SA-tedavi PSiO 2 örnek durulayın.
  7. 100 ug / ml biyotinile E: 1 ml, 30 dakika için sonuçtaki SA-değiştirilmiş PSiO 2 örnek inkübe coli monoklonal antikor (immunoglobulin G, IgG) çözelti ya da 100 ug / ml biyotinile edilmiş tavşan-IgG'si ile (bir monoklonal antikor için bir model olarak).

3. Floresan Etiketleme ve Floresan Mikroskopi

  1. 15 ug / ml floresan (FITC) ile IgG-tadil edilmiş yüzeyler inkübe edin, 40 dakika için anti-tavşan IgG etiketlendi ve 15 ug / ml floresan (FITC) ile birlikte bir kontrol olarak anti-fare IgG etiketlendi.
  2. 0.1 M PBS çözeltisi ile birkaç kez değiştirilmiş örnekleri durulayın.
  3. Flöresanlı bir mikroskop altında örnekleri inceleyin.

4. Bakteriler Culture

  1. E. Yetiştirmek coli K12 Luria Bertani (LB) ortamı (: NaCI, maya ekstresi, 5 g 5 g, tripton ve 10 g deiyonize su, 1 L orta bileşimi) 5 ml, 10 ml bir tüp içinde bakteri. Bakteriler, gece boyunca 37 ° C'de çalkalanarak inkübe
  2. 600 nm'lik bir dalga boyunda optik yoğunluk (OD) okuyarak, bakteri konsantrasyonu izleyin. LB ortamında gece boyunca büyütmeden sonra, bakteriyel konsantrasyonunu belirlemek için bir spektrofotometre kullanılarak OD 600 okuyun. Hücrelerin sayısı korkunç olduğunuOD 600 ölçümleri (1 OD 600 = 10 8 hücre / ml) ctly orantılıdır.

5. Bakteriler Algılama

  1. IgG-modifiye PSiO 2 ve düzgün PSiO 2 (kontrol olarak), ısmarlama bir Plexiglas akış hücresi örnekleri yerleştirin. Örnek yansıtma tüm ölçümler sırasında aynı noktada ölçülür sağlamak için akış hücresi düzeltildi.
  2. E ile örnekleri inkübe Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca coli K12 süspansiyonu (10 4 hücre / ml). Daha sonra 30 dakika boyunca v tuzlu su çözeltisi / ağ% 0.85 ile yıkanarak hücre bakteri süspansiyonu çıkarın.
  3. Deney boyunca yansıtma veri değişiklikleri izler. Tüm optik ölçümler çevreleyen bir sulu gerçekleştirilebilir gerekir. Spectra bir CCD spektrometre kullanılarak toplanan ve daha önce 25,26 açıklandığı gibi hızlı Fourier, (FFT) uygulanarak analiz edilmelidir.
  4. Üzerindeki bakteri varlığını doğrulamakbiyoalgılayıcı yüzeyi hemen biyo-algılayıcı deneyden sonra dik bir ışık mikroskobu altında örneklerin gözlenmesiyle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokol metin bölümünde açıklandığı gibi oksitlenmiş PSi (PSiO 2) filmler hazırlanır. Şekil 1B, termal oksidasyon sonra elde edilen PSi filmin yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu görüntüsüdür. PSiO 2 kat 30-80 nm aralığında bir çapı olan iyi tanımlanmış silindirik gözenekler ile karakterize edilir.

Monoklonal antikor (IgG) molekülleri, bir biotin-SA sistemi ile birlikte iyi kurulmuş bir silanizasyon teknolojisi kullanılarak PSiO 2 yüzeyleri üzerine yerleştirilir. Ayrıntılı sentez şeması Şekil 2'de gösterilmiştir. İlk olarak, termal olarak oksitlenmiş yüzeyin, bir tiol silisyum hidritleşmiş bir yüzeye (Şekil 2c) ile sonuçlanan MPTS ile silisyum hidritleşmiş edilir. Bir sonraki adımda, aktif yüzey biotin-SA köprüleri ile biyotin ile modifiye edilmiş bir yüzeye SA proteinlerin birleştirilmesi ve ardından bir SH-reaktif biyotin bağlayıcı moleküller (Şekil 2d) ile kuluçkalanır (Şekil 2e). Biosensor yüzeyinin işlevsellik en son adım SA (Şekil 2f) için biyotinlenmiş monoklonal antikorların bioconjugation içerir.

PSiO 2 yüzeyine antikorların bağlanma flöresanlı bir mikroskop altında gözlenmesi, yüzeyin, ardından floresan etiketleme ile teyit edilir. Buna ek olarak, floresan çalışmalar bize floresan, bir kontrol olarak anti-tavşan IgG, anti-fare IgG etiketli bağlama ile yüzey-hareketsizleştirilmiş antikor (tavşan IgG) aktivitesini ve antijen özgünlüğüne karakterize izin verir. 3 Bu deneylerin sonuçları özetlenmektedir Şekil .

Bakteri Biyoalgılayıcı göstermek için biz belirli E. kullanmış coli IgG yerine modeli IgG (tavşan IgG). Yine, bu yaklaşım PSiO 2 nanostr yansıyan ışığın genliği (yoğunluk) değişiklikleri izlemek içinucture. Algılama deneyler sırasında, biyosensörler örnek yansıtma tüm ölçümleri sırasında aynı noktada ölçülür sağlamak için bir akış hücresi giderilmiştir. Tüm deney ıslak bir ortamda gerçekleştirilir ve örnek yansıtma spektrumu sürekli olarak izlenir. Biyosensörler E. maruz bir tampon çözeltisi (serbest bakterilerin çıkarılması için) biyoalgılayıcı yüzeyi yıkamak için kullanılır, bundan sonra 30 dakika boyunca coli K12 süspansiyonu (10 4 hücre / ml). E. giriş öncesi ve sonrası biyosensör bir FFT spektrum koli bakterileri (10 4 hücre / ml) Şekil 4a (üst) 'de gösterilmiştir. E. Bu nedenle, aşağıdaki maruz önemsiz değişiklikler (FFT yoğunluğunda% 0.5 'den daha az düşüş) modifiye edilmemiş PSiO 2 yüzey (Şekil 4b, üst) için gözlenen ise coli bakterileri (ve daha sonra durulama aşaması) 7 ±% 1 bir yoğunluk azalma kaydedilir. Dahası, in oPSiO 2 yüzeyi üzerine çekilen hücrelerinin varlığını doğrulamak için Sarf hiçbir hücre gözlenir ise, biyosensörler, hemen biyo-algılayıcı Deneyin tamamlanması. Şekil 4a (alt) gösterir biyosensör yüzeyi üzerinde bakteri hücreleri hareketsiz sonra hafif bir mikroskop altında gözlenir değiştirilmemiş yüzeyleri (kontrol) ile ilgili, Şekil 4b (alt) bakın.

Şekil 1
Bir hızlı Fourier dönüşümü (sağ) dönüşümü Aşağıda, tipik bir Fabry-Perot PSiO 2 nano (sol) ve karşılık gelen spektrum Şekil 1.. (A) tipik yansıtma spektrumu. Elde edilen tek bir tepe noktası konumu ve büyüklüğü kontrol edilir. (B) A kesit yüksek çözünürlüklü tarama elektron mikrografı (sec385 mA / cm 2 de 30 saniye boyunca kazınmış bir PSiO 2 tabakasının () n sekonder elektronlar).

Şekil 2,
Sentez adımları Şekil 2.. Şematik temsili antikorlar ile PSiO 2 yüzeyi biofunctionalize için takip. (A) Bir anodik elektro etch tek kristal silisyum Bir PSi tabaka hazırlamak için kullanılır. (B) taze kazınmış Numune daha sonra termal olarak 800 ° C'de oksitlenir (C) 2 PSiO yüzeyi başlangıçta serbest tiol grubu yüzeyi (aktif PSiO 2 film) oluşturmak için MPTS ile reaksiyona sokulur. (D) bir yüzey oluşturmak için biyotinile PEO-iodoasetil biotin ile aktive edilmiş filmin inkübasyonu. Biyotinile s (e) İnkübasyonSA ile sert bir yere. (F) biyotinli antikorlar ile modifiye yüzeyin Kuluçka. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Hareketsizleştirilmiş IgG aktivitesi ve antijen özgünlüğüne teyit etmek için floresan etiketleme deneylerin sonuçları. Örnekler sabit bir maruz kalma süresinde, bir flüoresan mikroskop altında gözlenir. (A) Tam bioconjugation, PSiO 2 + + biotin MPTS + SA + biyotinile-tavşan IgG-ve FITC-anti-tavşan IgG, (B) FITC-anti-fare IgG ile kontrol deneyi, (C) kontrol deneyi, herhangi bir IgG, 2 PSiO + + MPTS biotin + SA ve FITC-anti-tavşan IgG.

Not: Bu şemadaki Illustrat içindirancak IgG konjugasyon gibi iyon amaçlar da gözenekleri içinde ortaya çıkar.

Şekil 4,
Şekil 4,. E. coli biyoalgı deneyler ve hemen deneylerden sonra biyosensör ilgili optik mikroskop görüntüleri. biyosensörleri 10 4 hücre / ml E. ile inkübe edilir coli süspansiyonlar bulunmaktadır. Anahtar: (a) PSiO 2, (b) saf (değiştirilmemiş) PSiO 2 IgG-modifiye.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir PSiO 2 nano (bir Fabry-Perot ince film) dayalı bir etiket içermeyen optik immunosensor, fabrikasyon ve bakteri tespiti için bir biyosensör olarak potansiyel uygulanabilirliği doğrulanmıştır.

Değişiklikler ve sorun giderme

Bir immunosensor tasarımı en önemli sorunlardan biri de biyosensör duyarlılık 31,32 bir azalmaya yol açabilir katı substrat üzerine birikimi ve modelleme sırasında istenmeyen yapı değişikliklere karşı antikor duyarlılığıdır. Bu sorunu azaltmak için, PSiO 2 yüzeyine antikorların birleşme biotin-SA köprü aracılığıyla gerçekleştirilir. SA ve biotin yaygın nedeniyle yüksek bir bağlanma afinitesi (Kd ~ 10 -13 M) için birçok biyoteknolojik uygulamada kullanılmaktadır. Biotin-SA bağlantı biyosensör geliştirme 10,32,33,34 uygulanan reseptör hareketsizleştirme için en yaygın kimyaları biridir. Hareketsizleştirilmiş antikor erişim katı yüzey ve IgG'lerin 31,35 arasında esnek bir bağlantı içerir biyotin-SA reaksiyonu ile kontrol edilebilir. Bu nedenle, ilk olarak 2 PSiO nano üzerine biyotinlenmiş antikor konjugasyonu izin vermek için biyotin / SA ile biofunctionalized edilir.

Tekniğin sınırlamaları

Bu biyo-algılayıcı düzeni ana sınırlamaları bakteri yakalama elemanı olarak kullanımı antikorlar atfedilir. Diğer İmmunosensörler ile olduğu gibi, mevcut antikorları kullanılan antikorların spesifitesini ve istikrar 36 olan hedeflerin tespiti ile sınırlıdır. Kullanılacak antikor tipi spesifik uygulamaya ve mümkün monoklonal antikorlar tercih edilir bağlıdır. Bununla birlikte, monoklonal antikorlar sağlamak spesifite derecesi yüksek olduğu halde, 1000 hücre / ml 'nin altında, tüm bakteri hücrelerinin tespiti hala bir sorundur35. Buna ek olarak, bu antikorların üretiminde yer alan yüksek maliyeti göz önüne alınmalıdır.

Diğer bir sınırlama, aşındırıcı / sulu ortamlarda okside PSi dönüştürücünün kimyasal stabilite ile ilişkilidir. Uzun süre (birkaç saat) yaparken PSiO 2 kararlılığı hala, PSi ince filmler ile karşılaştırıldığında, üstün olmasına rağmen akış deneyleri temel sürüklenir 14,15,21,24 gözlenebilir. Ayrıca, bu nano mekanik istikrarsızlığı önlemek amacıyla (6-8 aralığında), nötr pH değerinde bir çözüm için tercih edilmektedir.

Bakteriler ile kirlenmiş olan gerçek yiyecek veya su örnekleri ile uğraşırken Tabii ki, uygun bir ön-muamele işlemi, önceki algılama adımı olarak kabul edilmesi gerektiğini. Ön-muamele incelenen numunenin belirli özelliklerine uygun olarak tasarlanmalıdır. Örneğin, dispersiyon, filtrasyon, pH ba gibi hazırlama prosedürlerilance vb düşünülebilir. Ancak, bu tedavi öncesi teknikler bu işin kapsamı dışındadır.

Mevcut yöntemlere göre önemi

Bugüne kadar, algılama ve bakteriyel kontaminasyon belirlenmesi esas olarak klasik mikrobiyoloji kültür teknikleri üzerinde veya biyokimyasal kitler, ELISA (enzim bağlantılı bir immünosorbent) olarak mikrobiyoloji hızlı teknikleri, güveniyor, ve PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) 2,3 deneyleri. Bu yöntemler zaman alıcı ve olanaksız 2,4,5 kalır'' dolayısıyla, sonuç elde etmek için su ve gıda güvenliği gerçek zamanlı'' değerlendirmesini birkaç gün gerektiren, zahmetli. Bu çalışmada, bu tekniklerin dezavantajlarının üstesinden gelmek için PSi bazlı biyosensör yeteneğini göstermektedir. Mevcut biyosensör ile op değişiklikleri izleyerek, a'' doğrudan hücre yakalama'' yaklaşım ile bir bakteri, nispeten basit ve hassas bir şekilde tespit sağlar:tical girişim spektrumu. Bizim ilk sonuçlar 10 4 hücre / ml E. düşük bir algılama sınırı gösterilecek coli ve birkaç dakika hızlı bir tepki süresi vardır. Karşılaştırma için, mevcut state-of-the-art yüzey Plazmon rezonans (SPR) biyosensör tespit limiti 10 2 -10 6 hücreli / ml 37-40 aralığında olduğunu. Yanıt süresi açısından, bakteriler maruz için biyosensörler yanıt SPR teknikleri ile karşılaştırılabilir. Bu nedenle, bu biyo-algılayıcı düzeni en önemli güçlü hedef bakteri "gerçek zamanlı" tanımlama sağlayan deneyde ve hızlı algılama basitliği bulunmaktadır.

Gelecek uygulamalar

Çeşitli yaklaşımlar şu anda yerine bütün antikorlar veya antikor parçaları kullanarak, antikor konsantrasyonu ve yönlendirme optimizasyonu da dahil olmak üzere biyosensör algılama limiti ve hassasiyeti geliştirmek için araştırılmaktadır. Ayrıca, apt potansiyelini okuyoralternatif yakalama prob olarak amers. Sonuç olarak, burada sunulan çalışma çeşitli mikroorganizmalar birçok biyoalgı uygulamalarına tercüme edilebilir bir genel biyoalgı platform sağlar.

Protokolü içerisindeki kritik adım

Biyosensör en iyi performansı elde etmek için, bu PSiO 2 iskeleler (protokol metninde bölüm 3, Floresan Etiketleme ve floresan mikroskobu bakınız) biofunctionalization onaylamak için son derece önemlidir. Floresan çalışmalar bize transdüktör (PSiO 2) yüzeyine antikorların eki teyit etmek ve bir kontrol olarak bağlanması ile, etkinlik ve bağlı antikorların antijen özgünlüğüne floresan anti-tavşan IgG, anti-fare IgG etiketli karakterize izin .

Ayrıca, optik okuma yanlış sonuçlar ortadan kaldırmak için, bu uygun bir şekilde, aşağıdaki biyosensör exposu bir yüzeyin durulanması için gereklidirHedef bakteri ve yeniden temiz PSiO 2 ile kontrol deneyleri yürütmek için (spesifik olmayan bir tarzda bağlanmış ya da yüzey üzerinde bulunan edilir bakteri hücrelerinin ayrılması için). Kontrol deneyinin önemi (Bakteriler Algılama, protokol metninde bkz. Bölüm 5) biyosensör yüzeyinde belirsiz bakteri adsorpsiyon ortadan kaldırılması içindir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Acknowledgments

Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (hibe No 1118-1108 ve hibe No 1146-1112) ve Minna Kroll Memorial Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. ES minnetle Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü'nün mali desteği kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%) Merck 101513
Ethanol absolute Merck 818760
PBS buffer solution (pH 7.4) prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) Sigma Aldrich Chemicals 175617
PEO-iodoacetyl biotin Sigma Aldrich Chemicals B2059
Streptavidin (SA) Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 115-095-003
Biotinylated E. coli antibody Jackson ImmunoResearch Labs Inc. 1007
E. coli (K-12) was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28, (2), 232-23 (2010).
  2. Food Microbiol.: Fundamentals and Front. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. 2, ASM Press. Washington. (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5, (4), 744 (2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59, (2), 126 (2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32, (1), 3 (2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204, (5), 1439 (2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
  9. Dancil, K. -P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J. Development of a Porous Silicon Based Biosensor. Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. Proceedings of the Mat. Res. Soc. Symp, Boston, MA, 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18, (33), S2019 (2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84, (22), 4361 (2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120, (46), 12108 (1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127, (33), 11636 (2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. 1375 (2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79, (1), 327 (2007).
  18. Schwartz, M. ichaelP., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12, (12), 859 (2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8, (5-6), 775 (2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6, (10), 1755 (2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27, (4), 230 (2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22, (42), 425502 (2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. 733, Springer. Netherlands. (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83, (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20, (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20, (8), 1656 (2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79, (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. 1st, Academic Press. (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13, (3-4), 305 (1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8, (8), 4669 (2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85, (3), 1951 (2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23, (10), 5817 (2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. Springer. 567 (2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S. Designing receptores for the next generation of biosensors. Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. Springer. 105 (2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40, (7), 803 (2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4, (7), 1003 (2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24, (3), 339 (2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Springer. 83 (2008).
Optik Algılama<em&gt; E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından&gt; Bakteri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).More

Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors. J. Vis. Exp. (81), e50805, doi:10.3791/50805 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter