Optik Algılama<em> E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından> Bakteri
Summary
Bakterilerin hızlı tespiti için bir etiket içermeyen optik biyosensör sokulur. Biosensor direkt olarak yüzey üzerine, hedef bakteri hücreleri yakalamak için tasarlanmış bir nano yapılı gözenekli Si, dayanmaktadır. Bu yakalama problar olarak, gözenekli transdüktörün üzerine immobilize monoklonal antikorları kullanır. Çalışmalarımız (örneğin, hücre liziz gibi) önceden bir numune işleme ile birkaç dakika içinde, düşük bakteriyel konsantrasyonlarının saptanması için, bu biyosensör uygulanabilirliğini göstermektedir.
Abstract
Nano yapılı bir gözenekli Si göre bir etiket içermeyen optik biyosensör model bir mikroorganizma olarak, Escherichia coli K12 bakterilerin hızlı yakalanması ve teşhisi için tasarlanmıştır. Incelenen numunenin (hücre lizizi ile) herhangi bir ön-muamele gerekli iken biosensor, kendi yüzeyi üzerine hedef bakteri hücrelerinin doğrudan bağlanma dayanır. Bir gözenekli Si ince film biyosensör optik dönüştürücü eleman olarak kullanılır. Beyaz ışık aydınlatma altında, gözenekli katman kendi yansıtma spektrumu iyi bir çözüme Fabry-Perot saçak desenleri görüntüler. Hızlı Fourier tek bir zirve yansıtma veri sonuçlarına (FFT) dönüşümü uygulamak. FFT tepe yoğunluğuna değişiklikler izlenir. Bu nedenle, hedef bakteri, bir antikor-antijen etkileşimleri yoluyla bir biyo-algılayıcı yüzeyi üzerine yakalama bakteri ek bir "gerçek zamanlı" gözlem için izin FFT piklerin yoğunluğu ölçülebilir bir değişiklik, neden olur.
nt "> elektrokimyasal anotlama işlemi ile imal edilmiş gözenekli Si film, hedef bakterilere özel monoklonal antikorlar ile konjuge edilir. Hareketsizleştirme, immunoactivity ve antikor özgüllüğü floresan etiketleme deneyleri ile teyit edilir. biyosensör için ortaya çıktığında Hedef bakteri, hücreler direkt olarak antikor ile modifiye edilmiş gözenekli Si yüzeyi üzerine yakalanır. Bunlar, belli olaylar yakalama biyosensör ince film optik girişim spektrumu yoğunluk değişikliklere neden olmaktadır. Bunların biyosensörler (saptama, nispeten düşük bakteri konsantrasyonu algılayabilir olduğunu göstermektedir Bir saatten az 10 4 hücre / ml) sınırı.Introduction
Patojenik bakterilerin erken ve doğru tespit gıda ve su güvenliği, çevresel izleme ve nokta-bakım teşhis 1 için son derece önemlidir. Geleneksel mikrobiyoloji teknikleri zaman zahmetli, alıcı, ve "gerçek-zamanlı" veya laboratuvar ortamı dışında mikroorganizmaları tespit yeteneğinden yoksun olarak, biyosensörler bu zorlukların 2-5 karşılamak için gelişmektedir.
Son yıllarda, gözenekli Si (PSI) sensörler ve biyosensör 6-20 tasarımı için umut verici bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Geçtiğimiz on yıl içinde PSi-tabanlı optik sensörler ve biyohissedicilerin ilgili çok sayıda çalışmalar 21,22 yayınlandı. Nano yapılı PSi tabaka tipik olarak, tek-kristal Si gofret anodik elektro-kimyasal bir dağlama aracılığı ile imal edilmektedir. Elde edilen nano PSi gibi büyük yüzeyi ve serbest hacmi olarak çok avantajlı özellikler sergiler, kontrol edilebilir ve ayarlanabilir boyutları Opti gözenekcal özellikleri 10,16. Böyle fotolüminesans 8,11 ve beyaz ışık yansıtma tabanlı interferometri 7,19 olarak PSi tabakasının optik özellikleri, çevresel şartlardan etkilenmektedir. Fotolüminesans spektrumda bir modülasyon veya yansıtma spektrumu dalga boyu 10 bir kayma olarak gözlenen film, ortalama kırılma endeksi bir değişiklik ile, gözenekli tabaka sonuçları içinde konuk moleküllerin / hedef analitlerin Capture.
PSi optik biyosensör teknolojisinde büyük yenilik olsa da, bakteri tespiti 6,8,20,23-29 için PSi-tabanlı platformlarda sadece birkaç raporlar vardır. Buna ek olarak, bu proof-of-concept çalışmaların çoğu "dolaylı" bakteriler tespit göstermiştir. Bu durumda, hücre, genellikle önce lizis üzerinde çalışılan bakteriler 29 karakteristik hedeflenen protein / DNA fragmanları elde etmek için gereklidir. Bizim yaklaşım doğrudan hedef bakteri yakalamak içinPSi biyosensöründeki üzerine hücreler. Bu nedenle, hedef bakteri için özel olan monoklonal antikorlar, gözenekli yüzey üzerine immobilize edilir. , Antikor-antijen etkileşimleri yoluyla, bakteri hücrelerinin bağları, biyosensör yüzeyine yansıtma spektrumu 24-26 genliği (yoğunluk) içinde değişikliklere sebep olur.
Bu çalışmada, bir optik PSi bazlı biyosensör yapımı hakkında rapor ve Escherichia coli tespiti (E. coli) (model mikroorganizma olarak kullanılan) K12 bakteri. Izlenmesi için bir etiket içermeyen biyo-algılayıcı platformu olarak uygulanmasını göstermek optik sinyal nedeniyle Fabry-Perot ince film girişim (Şekil 1A) için PSi nano yansıyan ışıktır. Işık genlik / yoğunluğundaki değişiklikler hızlı algılama ve bakterilerin miktarının sağlayan, biyosensör yüzeyi üzerine hedef bakteri hücrelerinin spesifik hareketsizliğe bağlı olarak ilişkilidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir PSiO 2 nano (bir Fabry-Perot ince film) dayalı bir etiket içermeyen optik immunosensor, fabrikasyon ve bakteri tespiti için bir biyosensör olarak potansiyel uygulanabilirliği doğrulanmıştır.
Değişiklikler ve sorun giderme
Bir immunosensor tasarımı en önemli sorunlardan biri de biyosensör duyarlılık 31,32 bir azalmaya yol açabilir katı substrat üzerine birikimi ve modelleme sırasında istenmeyen yapı değişikliklere ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (hibe No 1118-1108 ve hibe No 1146-1112) ve Minna Kroll Memorial Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. ES minnetle Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü'nün mali desteği kabul eder.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
References
- Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
- Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
- Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
- Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
- Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
- Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
- Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
- Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
- Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
- D’Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys – Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
- de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
- Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
- Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
- Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
- Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
- Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
- Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
- Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
- Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
- Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
- Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
- Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
- Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
- Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via “Direct Cell Capture”. Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
- Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
- Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
- Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
- Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
- Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
- Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
- Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
- Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
- Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
- Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).
