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Reproducable Paraplegia por Thoracic Aorta Oclusão em um modelo murino de Medula Espinhal A isquemia-reperfusão

doi: 10.3791/50910 Published: March 3, 2014

Summary

A falta de entendimento mecanicista da medula espinhal lesão de isquemia-reperfusão tem dificultado mais adjuntos para evitar paraplegia após operação da aorta alto risco. Assim, o desenvolvimento de modelos animais é imperativo. Este manuscrito demonstra reprodutível menor paralisia extremidade após oclusão da aorta torácica em um modelo murino.

Abstract

Fundo
Baixa paralisia extremidade continua a complicar intervenções aorta. A falta de compreensão da patologia subjacente tem dificultado avanços para diminuir a ocorrência desta lesão. O modelo atual demonstra reprodutível menor paralisia extremidade após oclusão da aorta torácica.

Métodos
Camundongos C57BL6 machos adultos foram anestesiados com isoflurano. Através de uma incisão cervicosternal a aorta foi exposta. A aorta e subclávia esquerda descendente artérias torácicas foram identificados sem entrada para o espaço pleural. Esqueletização destas artérias foi seguido pelo fechamento imediato (Sham) ou oclusão de 4 min (isquemia moderada) ou 8 min (isquemia prolongada). A esternotomia e pele foram fechados eo rato foi transferido para a cama aquecimento para a recuperação. Após a recuperação, análise funcional foi obtida em 12 intervalos hr até 48 horas.

Resultados jove_content
Os ratos que foram submetidos à cirurgia sham não mostraram déficit membro posterior observável. Ratos submetidos à isquemia moderada por 4 min teve déficit funcional mínimo em 12 horas seguido de progressão para completar a paralisia em 48 horas. Ratos submetidos à isquemia prolongada teve uma paralisia imediata com qualquer movimento posterior de membros observável em qualquer ponto no pós-operatório. Não houve mortalidade intra-operatória observada ou pós-operatório.

Conclusão
Reprodutível menor paralisia extremidade imediato ou retardado pode ser alcançado em um modelo murino. Além disso, usando uma esternotomia mediana e cuidadosa dissecação, as taxas de sobrevivência elevadas, e reprodutibilidade pode ser conseguida.

Introduction

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Menor paralisia extremidade continua a complicar as intervenções toracoabdominal. A lesão, conhecido como medula espinhal lesão de isquemia-reperfusão (SCIR), resulta em paralisia em até 20% dos pacientes de alto risco 1. Adjuntos cirúrgicos, tais como desvio esquerda coração, drenos fluidos cerbrospinal lombares, parada circulatória hipotérmica e reimplante da artéria intercostal ter reduzido a incidência desta complicação 2, no entanto, demasiado muitos pacientes continuam a ser afetados.

Clinicamente, a isquemia medular e reperfusão é visto como imediatos ou retardados paralisia após a intervenção 3. No entanto, a nossa compreensão desta lesão foi sufocada pela falta de detalhes mecanicista. Como resultado, algumas opções estão disponíveis para atenuar a lesão, uma vez que tenha ocorrido.

Temos, assim, se alistou um animal pequeno, murino, o modelo de isquemia medular, e reperfusão demelhor caracterizar sua patogênese. A maioria dos estudos até agora usaram modelos animais maiores para caracterizar esta lesão, ou seja, 4 rato, coelho 5, e porco 6 modelos. No entanto, estes são limitados pelo seu custo, complexidade, reprodutibilidade variável, e, mais importante, a falta de técnicas disponíveis para a manipulação genética. O mais confiável desses modelos animais publicados envolve pinçamento infra-renal da aorta abdominal em coelhos. No entanto, anterior humana neurônios espinhais na maioria das vezes derivam seu suprimento vascular dos ramos mais proximais 7. Anatomia vascular variável da medula espinal em modelos estes adiciona à dificuldade em fazer a transição seus resultados em utilização clínica.

Este manuscrito apresenta um modelo de paraplegia imediato ou tardio, após oclusão da aorta torácica que é clinicamente relevante e fácil de empregar. A exposição do arco aórtico via mini-esternotomiao meu é menos invasiva e pode provocar resultados altamente reprodutíveis com morbidade e mortalidade mínima. Embora este modelo em não sem desafios e nuances técnicas, estas podem ser superadas com dissecção cuidadosa e manipulação de tecidos para produzir um modelo de paralisia dos membros traseiros que podem ser facilmente implementados.

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Protocol

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1. Pré-operatório Preparação e Anestesia

  1. Não deixe de observar técnica estéril durante todo o procedimento. Deite fora todos os instrumentos.
  2. Ligue o leito de controlo da temperatura antes da indução da anestesia de modo que ele pode aquecer até à temperatura apropriada (36,5 ° C). Ligue o monitor de laser Doppler perfusão de modo que ele pode iniciar durante a indução.
  3. Posicione o mouse na câmara de indução.
    1. Monitorar cuidadosamente a frequência respiratória do mouse durante a indução.
    2. Assim que a taxa respiratória abrandou visualmente, remover o rato da câmara de indução.
    3. Realize toe pitada para avaliar a adequação de anestésico.
  4. Com o mouse devidamente anestesiados, lugar do mouse na posição supina.
  5. Insira rosto no nariz cone e proteger todos os membros para a mesa de aquecimento.
    1. Preste atenção especial para garantir que as extremidades estão garantidos na posição anatômica, sem deviatiem que um dos lados. Se o mouse é posicionado de forma inadequada, é difícil evitar a transecção da artéria torácica interna durante a esternotomia.
  6. Usando clippers ou disponíveis comercialmente creme de depilação, remover os pêlos da linha média do tórax e deixou extremidade superfície ventral inferior.
    1. Se estiver usando creme de depilação, evite deixar o creme no lugar por mais de 30 segundos, as queimaduras como alcalinos podem ocorrer.
  7. Titular concentração vaporizador de anestesia volátil para manter a anestesia adequada.
    1. Frações vaporizador esperados são entre 1-5% utilizando isoflurano com alto fluxo de O 2.
    2. Concentração vaporizador anestésico volátil deve ser ajustada para manter a anestesia durante a estimulação cirúrgica, mantendo a respiração espontânea.

2. Colocação retal Probe Laser Doppler

  1. Insira sonda retal lubrificado no reto do mouse. Seguro em lugar para operAting cama.
  2. Ajuste a cama de aquecimento para um alvo a temperatura retal de 36,5 ° C.
  3. Faça pequena incisão ao longo da artéria femoral de rato e dissecar a pele longe do tecido subcutâneo.
  4. Insira sonda laser Doppler ao longo da artéria femoral.
  5. Ajuste as posições da sonda até o monitor de perfusão registra maior do que 800 unidades de perfusão.
    1. Sonda firmemente seguro no lugar. Sondas Indevidamente garantidos pode ter medições de perfusão falsamente baixos.

3. Dissecção da aorta Arch / artéria subclávia

  1. Faça uma incisão de pele 2 cm acima da fúrcula e gentilmente dissecar a pele longe do tecido subcutâneo.
  2. Dissecar a glândula submandibular livre.
    1. Se ocorrer sangramento, pressão suave pode ser aplicado com um cotonete.
    2. Dividir a glândula submandibular, através da linha média, no plano avascular.
  3. Levante cuidadosamente esterno com uma pinça e usando o scissors fazer um centímetro da linha média esternotomia através da linha média do esterno. Qualquer desvio da linha média pode resultar em hemorragia artéria mamária interna, que será difícil de controlar.
  4. Coloque 5-0 retração de cada lado na borda do esterno e retrair esterno lateralmente garantir suturas para a cama em funcionamento. Evite colocar suturas de retração também lateralmente para evitar pneumotórax.
  5. Usando dissecção romba músculos cinta livre junto traquéia. O músculo cinta à esquerda pode ser dividida com uma tesoura para melhorar a exposição.
  6. Dissecar libertar o timo a partir do tecido circundante. Continuar dissecção romba até os grandes vasos são visualizados. Tenha muito cuidado para evitar a entrada no espaço pleural.
  7. Coloque grampos vasculares no arco aórtico e artéria subclávia esquerda.
  8. Verifique o fluxo distal foi devidamente interrompida. Isto irá ser visto como uma redução> 90% nas unidades de perfusão.
    1. Continuar oclusão para desivermelho para 4-8 min.
  9. Remover grampo vascular e verificar a hemostasia antes do fechamento do tórax.

4. Encerramento da esternotomia e Pele

  1. Retirar a sutura retracção no lado esquerdo do rato.
  2. Feche a esternotomia com a sutura retração direita.
    1. A única sutura esternal (usando o ponto de retração previamente colocado) é adequada para fechamento do esterno. Colocar outro ponto é desnecessário e aumenta os riscos de pneumotórax e hemorragia.
  3. Fechar pele com o funcionamento de 5-0 ponto.

5. Avaliação de recuperação pós-operatória e

  1. Transfira o mouse para gaiola de recuperação. Gaiola deve ser colocado sobre uma almofada de aquecimento para aumentar a temperatura ambiente da câmara de recuperação e reduzir a perda de calor para o ambiente.
  2. Acompanhar de perto o mouse em busca de sinais de dificuldade respiratória ou atividade convulsiva. Administrar analgesia por diretrizes da instituição. Euthacamundongos Nize imediatamente se apreensão ou desconforto respiratório é observado.
    1. CO 2 eutanásia câmara é o nosso método preferido. Deslocação cervical é uma outra opção se CO 2 não está disponível.
    2. A recuperação completa pode ser esperado em 1-2 horas, dependendo do comprimento de anestésico volátil e a concentração usadas.
  3. Retorne o mouse para gaiola normal. Coloque os alimentos e coloque água no chão da gaiola.
  4. Avaliar o estado neurológico em 12 intervalos hr usando Basso Rato Escala para Locomotion 8.

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Representative Results

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Ratos foram submetidos a cirurgia sham (n = 3) ou oclusão aórtica por 4 (n = 3) a 8 min (n = 3). Camundongos pós-operatório foram classificados pelo Índice de Basso Mouse (Figura 1). Os ratos que foram submetidos à cirurgia sham não tinha déficits funcionais observáveis ​​em qualquer ponto no pós-operatório. Ratos submetidos à isquemia moderada (4 min) tiveram perto de função normal traseira de membros em 12 horas com o declínio funcional progressivo para completar paralisia por 48 horas. Ratos no grupo isquemia prolongada (8min) teve paralisia completa após a cirurgia, sem qualquer função recuperável (Figura 2).

Figura 1
Figura 1. Basso Pontuação para Função Hind Limb Motor 8. Sistema de pontuação para o membro posterior disfunção neurológica graduada de 0 (sem função) a 9 (functi normaispor diante). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2
Função pós-operatória Hind-Limb Figura 2.. A gravidade do déficit neurológico foi classificado usando o mouse Basso Scale em 12 intervalos de RH no pós-operatório, até 48 horas. Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Discussion

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Paraplegia secundária a isquemia reperfusão medular, é o resultado de um complexo de patologias mal compreendidos 9. Embora este é mais comumente visto após a cirurgia da aorta toracoabdominal, uma variedade de outros insultos, como dissecções aórticas, trauma, fenômenos embólicos, vasculite e hipotensão sistêmica 10 pode resultar em paraplegia. Para obter uma maior compreensão desta lesão e fornecer metas futuras para eliminar esse prejuízo, os modelos animais se tornaram uma necessidade.

Os pacientes aflitos com esta exposição complicação ou uma paralisia imediato ou tardio. Este modelo e outros adequadamente paralelo 11 da distribuição bimodal de paralisia visto clinicamente. Enquanto a isquemia moderada (4 min) produziu uma paralisia retardada, isquemia prolongada (8 min) resultou em uma paralisia imediata e permanente.

O modelo apresentado tem vantagens em comparação com os que necessitam aiateral toracotomia 12,13. A exposição esternotomia mediana sai da cavidade pleural intacta e elimina a necessidade de intubação da traqueia ou restabelecer a pressão negativa na cavidade pleural. Clinicamente, a esternotomia está associada com muito menos dor pós-operatória em que a toracotomia lateral e pode reduzir a necessidade de analgésicos no pós-operatório.

Este modelo não é sem limitações. Tal como acontece com outros modelos, a cirurgia murino tem uma curva de aprendizado e boa técnica cirúrgica é imperativa. Ratos podem rapidamente sucumbir se dissecção não for feito com cuidado. As causas mais comuns de mortalidade intra-operatória são hemorragia ou pneumotórax. Para evitar a hemorragia potencialmente fatal esternotomia deve ser feita na linha média. Se a esternotomia é feita também lateralmente pode ocorrer uma transação de artérias mamárias internas e hemorragia subseqüente. Além disso, a dissecção da aorta descendente, áspero e artéria subclávia pode resultar em hemorragia será a dificuldadest ou impossível de controlar. Pneumotórax são outra complicação potencialmente fatal. Estes geralmente ocorrem durante a colocação de suturas de retração ou dissecção da aorta. Se suturas de retração são lugar muito lateralmente ou arco aórtico não é dissecada com cuidado um pneumotórax podem ocorrer e são universalmente fatal.

Outras medidas precisam ser empregadas para garantir a reprodutibilidade. Normotermia é crítica. Durante a cirurgia os ratos são mantidos como perto de 36,5 ° C quanto possível. Mesmo a hipotermia foi mostrado para ter efeitos neuroprotectores significativos na espinal medula e modelos de AVC 14,15. Além disso, as medições laser Doppler devem ser cuidadosamente monitorizados e ratos com redução de apenas 90% no fluxo distal devem ser incluídos para comparação. Oclusão incompleta da aorta ou subclávia artérias podem resulta em fluxos e resultados superiores distais que são altamente variáveis.

Em conclusão, o modelo murino de lower paralisia extremidade apresentado pode ser facilmente adotada, produzindo resultados altamente reprodutíveis. Aplicações deste modelo pode, desde que o investigador com um meio para estudar a paralisia imediata e retardada. Além disso, a adoção deste modelo pode ser benéfico no combate a esta complicação devastadora.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer à Fundação Cirurgia Torácica para Pesquisa e Educação pelo apoio financeiro do projeto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VMS Anesthesia Machine MDS Matrx
Isoflurane Vet One 13985-528-60 2.0% through nose cone 
Induction Chamber Vet Equip 941444
Heating Bed Vestavia Scientific
Lazer Doppler Monitor Moor Instruments VMS-LDF1
5-0 Suture, Polyester Surgidac VD-551 Taper Needle
Microdissecting Clips Biomedical Research Instruments 14-1030, 14-1060
Surgical Instruments Fine Surgical Instruments Forceps, needle holder

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References

  1. Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J. Vasc. Surg. 48, 47-53 (2008).
  2. Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen. Thorac. Cardiovasc. Surg. 59, 79-90 (2011).
  3. Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann. Thorac. Surg. 83, 1345-1355 (2007).
  4. Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27, 1850-1858 (1996).
  5. Naslund, T. C., Hollier, L. H., Money, S. R., Facundus, E. C., Skenderis, B. S. Protecting the ischemic spinal cord during aortic clamping. The influence of anesthetics and hypothermia. Ann. Surg. 409-515 (1992).
  6. Qayumi, A. K., Janusz, M. T., Lyster, D. M., Gillespie, K. D. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J. Invest. Surg. 10, 47-52 (1997).
  7. Lang-Lazdunski, L., Matsushita, K., Hirt, L., Waeber, C., Vonsattel, J. P., Moskowitz, M. A., Dietrich, W. D. Spinal Cord Ischemia: Development of a model in the mouse. Stroke. 31, 208-213 (2000).
  8. Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J. Neurotrauma. 23, 635-659 (2006).
  9. Kwon, B. K., Tetzlaff, W., Grauer, J. N., Beiner, J., Vaccaro, A. R. Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury. Spine. J. 4, 451-464 (2004).
  10. Cheshire, W. P., Santos, C. C., Massey, E. W., Howard, J. F. Spinal cord infarction: etiology and outcome. Neurology. 47, 321-330 (1996).
  11. Kakinohana, M., et al. Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires caspase-3 activation in mice. Stroke. 42, (8), 2302-2307 (2011).
  12. Wang, Z., Yang, W., Britz, G. W., Lombard, F. W., Warner, D. S., Sheng, H. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J. Neurosci. Methods. 189, 246-251 (2010).
  13. model of ischemic spinal cord injury with delayed paralysis caused by aortic cross-clamping. Anesthesiology. 113, 880-891 (2010).
  14. Kang, J., et al. The effects of systemic hypothermia on a murine model of thoracic aortic ischemia reperfusion. J. Vasc. Surg. 52, 435-443 (2010).
  15. Li, J., Benashski, S., McCullough, L. D. Post-stroke hypothermia provides neuroprotection through inhibition of AMP-activated protein kinase. J. Neurotrauma. 28, (7), 1281-1288 (2011).
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Cite this Article

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).More

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).

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