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Medicine

Reproductible paraplégie par l'aorte thoracique occlusion dans un modèle murin de la moelle épinière ischémie-reperfusion

doi: 10.3791/50910 Published: March 3, 2014

Summary

Le manque de compréhension des mécanismes de la moelle épinière lésion d'ischémie-reperfusion a empêché d'autres additifs pour empêcher la paraplégie suite à des opérations de l'aorte à haut risque. Ainsi, le développement de modèles animaux est impératif. Ce manuscrit démontre reproductible inférieure paralysie des extrémités après occlusion de l'aorte thoracique dans un modèle murin.

Abstract

Fond
Basse-paralysie du membre continue à compliquer les interventions aortiques. Le manque de compréhension de la pathologie sous-jacente a entravé les progrès de diminuer l'apparition de cette blessure. Le modèle actuel démontre reproductible inférieure paralysie des extrémités après occlusion de l'aorte thoracique.

Méthodes
Souris C57BL6 mâles adultes ont été anesthésiés avec de l'isoflurane. Grâce à une incision cervicosternal l'aorte a été exposé. L'aorte et les artères sous-clavière gauche thoracique descendante ont été identifiés sans entrée dans l'espace pleural. Squelettisation de ces artères a été suivie par la fermeture immédiate (Sham) ou occlusion pendant 4 min (ischémie modérée) ou 8 min (ischémie prolongée). La sternotomie et de la peau ont été fermés et la souris ont été transférés au lit de réchauffement pour la récupération. Après la récupération, l'analyse fonctionnelle a été obtenue à des intervalles de 12 h jusqu'à 48 h.

Résultats jove_content
Les souris qui ont subi une intervention chirurgicale fictive ne présentaient aucun déficit membre postérieur observable. Souris soumises à une ischémie modérée pendant 4 min avaient déficit fonctionnel minimal à 12 h suivie par la progression de la paralysie complète à 48 h. Souris soumises à une ischémie prolongée avaient une paralysie immédiate sans mouvement des membres postérieurs observable à tout moment dans la période post-opératoire. Il n'y avait pas observé peropératoire ou de la mortalité post-opératoire.

Conclusion
Reproductible inférieure paralysie des extrémités immédiat ou différé peut être obtenue dans un modèle murin. En outre, en utilisant une sternotomie médiane et une dissection minutieuse, les taux de survie élevé et la reproductibilité peut être atteint.

Introduction

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Basse-paralysie du membre continue à compliquer les interventions thoraco-abdominale. La blessure, connu sous le nom de la moelle épinière d'ischémie-reperfusion (CPRI), entraînant la paralysie chez jusqu'à 20% des patients à haut risque 1. Adjuvants chirurgicaux comme le pontage cardiaque gauche, liquide s'écoule cerbrospinal lombaires, arrêt circulatoire en hypothermie et la réimplantation de l'artère intercostale ont réduit l'incidence de cette complication 2, mais beaucoup trop de patients continuent de souffrir.

Cliniquement, l'ischémie de la moelle épinière et de reperfusion est considéré comme immédiat ou différé paralysie suite à l'intervention 3. Cependant, notre compréhension de cette blessure a été étouffé par le manque de détail mécaniste. En conséquence, peu d'options sont disponibles pour atténuer la blessure une fois qu'elle s'est produite.

Nous avons donc fait appel un petit animal, souris, modèle de ischémie de la moelle épinière, et reperfusion àmieux caractériser sa pathogénie. La majorité des études à ce jour ont utilisé des modèles animaux plus grands pour caractériser ce préjudice, à savoir 4 rat, lapin 5, et 6 modèles de porc. Cependant, ceux-ci sont limités par leur coût, de la complexité, de la reproductibilité de variable, et, plus important encore, le manque de techniques disponibles pour la manipulation génétique. La plus fiable de ces modèles animaux implique publié Croix-rénal serrage de l'aorte abdominale chez les lapins. Cependant, antérieures humaine neurones spinaux tirent le plus souvent leur approvisionnement vasculaire de plusieurs branches proximales 7. Variable anatomie vasculaire de la moelle épinière dans ces modèles ajoute à la difficulté à faire la transition de leurs résultats dans l'utilisation clinique.

Ce manuscrit présente un modèle de paraplégie immédiate ou différée après occlusion de l'aorte thoracique qui est cliniquement pertinente et facile à utiliser. Exposition de la crosse aortique par mini-sternotoma est moins invasive et peut provoquer des résultats très reproductibles à une morbidité et une mortalité minimale. Bien que ce modèle dans pas sans défis et les nuances techniques, ceux-ci peuvent être surmontés avec dissection minutieuse et la manipulation des tissus pour produire un modèle de paralysie des membres postérieurs qui peuvent être facilement mis en œuvre.

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Protocol

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Une. Préparation préopératoire et anesthésie

  1. Veillez à respecter une technique stérile tout au long de la procédure. Disposez tous les instruments.
  2. Allumer le lit de régulation de température avant l'induction anesthésique afin qu'elle puisse se réchauffer à la température appropriée (36,5 ° C). Puissance sur le moniteur de perfusion par laser Doppler de sorte qu'il puisse démarrer lors de l'induction.
  3. Placer la souris dans la chambre d'induction.
    1. Surveiller attentivement le rythme respiratoire de la souris lors de l'induction.
    2. Dès que la fréquence respiratoire est visuellement ralenti, retirer la souris de la chambre de l'induction.
    3. Effectuer pincement de l'orteil à évaluer l'adéquation de l'anesthésie.
  4. Avec la souris correctement anesthésié, lieu souris en position couchée.
  5. Insérez visage en cône et sécuriser toutes les extrémités de la table chauffante.
    1. Portez une attention particulière à ce que les extrémités sont fixées en position anatomique, sans deviatisur un côté. Si la souris n'est pas correctement positionné, il est difficile d'éviter la dissection transversale de l'artère thoracique interne au cours de la sternotomie.
  6. L'aide de tondeuses ou disponible dans le commerce la crème d'épilation, enlever les poils de la poitrine de la ligne médiane et inférieure gauche face ventrale de l'extrémité.
    1. Si vous utilisez de la crème d'épilation, éviter de laisser la crème en place pendant plus de 30 secondes, brûlures alcalins peuvent se produire.
  7. Titrer concentration volatile de vaporisateur d'anesthésique pour maintenir l'anesthésie adéquate.
    1. Fractions de vaporisateur attendus sont entre 1-5% à l'isoflurane à haut débit O 2.
    2. Concentration volatile vaporisateur d'anesthésique doit être ajustée pour maintenir l'anesthésie pendant la stimulation chirurgicale, tout en maintenant la respiration spontanée.

2. Placement sonde rectale Laser Doppler

  1. Insérer la sonde rectale lubrifié dans le rectum de la souris. Fixez en place pour OperAting lit.
  2. Ajuster le lit de chauffage pour une température rectale de cible de 36,5 ° C.
  3. Faites petite incision sur l'artère fémorale de la souris et de disséquer la peau loin de tissu sous-cutané.
  4. Insérer la sonde laser Doppler au-dessus de l'artère fémorale.
  5. Ajuster les positions de la sonde jusqu'à ce que l'écran de perfusion enregistre plus de 800 unités de perfusion.
    1. Sonde fermement sécurisé en place. Sondes mal fixés peuvent avoir des mesures de perfusion faussement bas.

3. Dissection de l'aorte Arch / Artère sous-clavière

  1. Faire une incision de 2 cm de la peau au-dessus de la fourchette sternale et doucement disséquer la peau loin de tissu sous-cutané.
  2. Disséquer la glande sous-maxillaire libre.
    1. En cas de saignement, une légère pression peut être appliquée avec un coton-tige.
    2. Diviser la glande sous-maxillaire par la ligne médiane dans le plan avasculaire.
  3. Soulevez doucement sternum avec une pince et l'utilisation de la scissors font 1 cm médiane sternotomie par la ligne médiane du sternum. Tout écart par rapport à la ligne médiane peut entraîner une hémorragie de l'artère mammaire interne qui sera difficile à contrôler.
  4. Placez 5-0 sutures de rétraction de chaque côté au bord du sternum et se rétracter sternum assurer latéralement sutures au lit exploitation. Évitez de placer des sutures de rétraction trop latéralement pour éviter pneumothorax.
  5. Utilisation de dissection courroie sans muscles le long de la trachée. La sangle musculaire gauche peut être divisé avec des ciseaux pour améliorer l'exposition.
  6. Disséquer libérer le thymus du tissu environnant. Continuer dissection jusqu'à ce que les grands navires sont visualisés. Utilisez une extrême prudence pour éviter l'entrée dans l'espace pleural.
  7. Placez pinces vasculaires sur l'arc aortique et gauche artère sous-clavière.
  8. Vérifiez flux distal a perturbé de manière appropriée. Ceci sera considéré comme une réduction> 90% de parts de perfusion.
    1. Continuer occlusion pour desirouge pour 4-8 min.
  9. Retirer vasculaire pince et vérifier l'hémostase avant la fermeture de la poitrine.

4. Clôture de la sternotomie et la peau

  1. Retirer la suture de rétraction sur le côté gauche de la souris.
  2. Fermez la sternotomie avec la suture de droit de rétractation.
    1. Une suture sternale unique (via le point de retrait préalablement placé) est suffisante pour la fermeture du sternum. Placer un autre point est inutile et augmente les risques de pneumothorax et d'hémorragie.
  3. Fermer la peau avec l'exécution de 5-0 points.

5. Évaluation du rétablissement postopératoire et

  1. Transférer la souris pour cage de récupération. Cage doit être placé sur un coussin chauffant pour augmenter la température ambiante de la chambre de récupération et de réduire la perte de chaleur vers l'environnement.
  2. Suivre de près la souris pour des signes de détresse respiratoire ou de l'activité de saisie. Administrer l'analgésie par les directives de l'institution. Euthasouris niser immédiatement si la saisie ou la détresse respiratoire est observée.
    1. CO 2 chambre euthanasie est notre méthode préférée. Dislocation cervicale est une autre option si le CO 2 n'est pas disponible.
    2. Le rétablissement complet peut s'attendre à 1-2 heures, en fonction de la longueur d'un anesthésique volatil et de la concentration utilisée.
  3. Retour à la souris cage normale. Placez les aliments et le lieu de l'eau sur le plancher de la cage.
  4. Évaluer l'état neurologique à intervalles de 12 h à l'aide de souris Basso échelle pour Locomotion 8.

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Representative Results

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Souris a subi une opération fictive (n = 3) ou une occlusion aortique pour 4 (n = 3) à 8 min (n = 3). Souris après l'opération ont été classés par le Score Basso souris (figure 1). Les souris qui ont subi une chirurgie fictive n'avaient pas de déficits fonctionnels observables à tout moment après l'opération. Souris soumises à une ischémie modérée (4 min) ont près de la fonction normale des membres postérieurs à 12 heures avec le déclin fonctionnel progressif à la paralysie complète de 48 heures. Souris dans le groupe de l'ischémie prolongée (8min) avait une paralysie complète après la chirurgie sans fonction récupérable (Figure 2).

Figure 1
Figure 1. Basso Note pour la fonction des membres postérieurs moteur 8. Système de notation pour des membres postérieurs dysfonction neurologique graduée de 0 (pas de fonction) à 9 (foncti normalesur). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. Fonction postopératoire Hind-Limb. La gravité de déficit neurologique a été évaluée en utilisant la souris Basso échelle à intervalles de 12 h après l'opération jusqu'à 48 h. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

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Paraplégie secondaire à une ischémie reperfusion de la moelle épinière est le résultat d'un complexe de pathologies mal comprises 9. Tandis que ceci est le plus souvent observée après une intervention chirurgicale de l'aorte thoraco-abdominale, une variété d'autres agressions telles que les dissections aortiques, les traumatismes, les phénomènes emboliques, vascularite, hypotension systémique et 10 peut aboutir à une paraplégie. Pour avoir une meilleure compréhension de cette blessure et fournir des cibles futures pour éliminer ce préjudice, les modèles animaux sont devenus une nécessité.

Les patients atteints de cette complication exposition soit une paralysie immédiate ou différée. Ce modèle et d'autres parallèles de manière adéquate la 11 distribution bimodale de la paralysie vu cliniquement. Alors que l'ischémie modérée (4 min) produit une paralysie retardée, ischémie prolongée (8 min) a entraîné une paralysie immédiate et permanente.

Le modèle présenté a des avantages par rapport à ceux qui ont besoin alateral thoracotomie 12,13. L'exposition de la sternotomie médiane laisse intacte la cavité pleurale et élimine la nécessité d'intubations trachéales ou le rétablissement de la pression négative dans l'espace pleural. Cliniquement, la sternotomie est associée à beaucoup moins de douleur post-opératoire dans de la thoracotomie latérale et pourrait réduire les besoins analgésiques postopératoires.

Ce modèle n'est pas sans limites. Comme pour les autres modèles, la chirurgie murin a une courbe d'apprentissage et une bonne technique chirurgicale est impérative. Les souris peuvent rapidement succomber si la dissection n'est pas fait avec soin. Les causes les plus fréquentes de mortalité peropératoire sont l'hémorragie ou pneumothorax. Pour éviter l'hémorragie potentiellement mortelle la sternotomie médiane doit être faite. Si la sternotomie est faite trop latéralement une opération des artères mammaires internes et hémorragie subséquente peut se produire. En outre, la dissection de l'aorte descendante rude et sous-clavière peut entraîner une hémorragie le sera diffit ou impossibles à contrôler. Pneumothorax sont une autre complication potentiellement mortelle. Elles se produisent généralement au cours de la mise en place de sutures de rétraction ou dissection de l'aorte. Si les sutures de rétraction sont placés trop latéralement ou la crosse aortique n'est pas disséqué avec soin un pneumothorax peut se produire et sont universellement fatale.

D'autres mesures doivent être prises pour assurer la reproductibilité. La normothermie est critique. Pendant la chirurgie souris sont placées le plus près à 36,5 ° C que possible. Même une légère hypothermie a été montré pour avoir des effets neuroprotecteurs significatifs dans la moelle épinière et les modèles de course 14,15. En outre, des mesures Doppler laser doivent être étroitement surveillés et souris avec une réduction de seulement 90% des flux distal doivent être inclus pour comparaison. Occlusion incomplète de l'aorte ou sous-clavière artères peut résultats dans les flux et les résultats à long terme plus élevés qui sont très variables.

En conclusion, le modèle murin de leur extrémité paralysie présentée peut être facilement adoptée, ce qui donne des résultats très reproductibles. Les applications de ce modèle peuvent fourni à l'enquêteur un moyen d'étudier la paralysie immédiate et différée. En outre, l'adoption de ce modèle pourrait s'avérer bénéfique dans la lutte contre cette complication dévastatrice.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier la Fondation de chirurgie thoracique pour la recherche et l'éducation pour leur soutien financier à ce projet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VMS Anesthesia Machine MDS Matrx
Isoflurane Vet One 13985-528-60 2.0% through nose cone 
Induction Chamber Vet Equip 941444
Heating Bed Vestavia Scientific
Lazer Doppler Monitor Moor Instruments VMS-LDF1
5-0 Suture, Polyester Surgidac VD-551 Taper Needle
Microdissecting Clips Biomedical Research Instruments 14-1030, 14-1060
Surgical Instruments Fine Surgical Instruments Forceps, needle holder

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References

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Cite this Article

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).More

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).

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