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Medicine

Reproduzierbare Paraplegie von thorakalen Aorta Occlusion in einem Mausmodell der Spinal Cord Ischämie-Reperfusion

doi: 10.3791/50910 Published: March 3, 2014

Summary

Der Mangel an Verständnis der Mechanismen des Rückenmarks Ischämie-Reperfusion Verletzungen hat weitere Zusätze behindert eine Querschnittslähmung nach Aorten-Operationen mit hohem Risiko zu verhindern. Somit ist die Entwicklung von Tiermodellen zwingend. Dieses Manuskript zeigt, reproduzierbare Lähmung der unteren Extremitäten nach Thorax Aortenokklusionsvorrichtung in einem Mausmodell.

Abstract

Hintergrund
Untere Extremität Lähmung weiterhin Aorten-Interventionen erschweren. Der Mangel an Verständnis für die zugrunde liegende Pathologie hat Fortschritte behindert, um das Auftreten dieser Verletzung zu verringern. Das aktuelle Modell zeigt reproduzierbare Lähmung der unteren Extremitäten nach thorakalen Aorta Okklusion.

Methoden
Erwachsene männliche C57BL6 Mäuse wurden mit Isofluran betäubt. Durch eine cervicosternal Einschnitt wurde die Aorta freigelegt. Die absteigenden Aorta und linken Schlüsselbeinarterien wurden ohne Eintritt in Pleuraraum identifiziert. Skelettierung dieser Arterien wurde durch sofortige Schließung (Sham) oder Verschluss für 4 min (moderaten Ischämie) oder 8 min (verlängerte Ischämie) gefolgt. Die Sternotomie und die Haut wurden geschlossen und die Maus wurde für die Wiederherstellung, um Wärmebett übertragen. Nach Wiederherstellung der Funktionsanalyse wurde bei 12 h Intervallen bis zu 48 h erhalten.

Ergebnisse
Mäuse, die Schein-Operation unterzogen zeigte keine beobachtbare Hinterbein Defizit. Mäuse zu moderaten Ischämie für 4 min unterzogen hatten minimale Funktionsdefizit auf 12 Stunden, gefolgt von Progression zu einer Lähmung bei 48 Stunden zu beenden. Mäuse verlängert Ischämie hatte eine sofortige Lähmung ohne beobachtbare Hintergliedbewegung an einem beliebigen Punkt in der postoperativen Phase. Es gab keine beobachtet intraoperative oder postoperative Mortalität.

Abschluss
Reproduzierbare Lähmung der unteren Extremitäten, ob sofort oder verzögert kann in einem Mausmodell erreicht werden. Zusätzlich wird durch Verwendung eines Längssternotomie und sorgfältige Präparation, hohe Überlebensraten und Reproduzierbarkeit erreicht werden kann.

Introduction

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Untere Extremität Lähmung weiterhin thorakoabdominellen Interventionen erschweren. Die Verletzung, wie Rückenmark Ischämie-Reperfusion Verletzung (SCIR) bekannt ist, führt zu Lähmungen in bis zu 20% der Patienten mit hohem Risiko ein. Chirurgische Hilfsstoffe wie links Herz-Bypass-, Lenden-cerbrospinal Flüssigkeit Kanalisation, hypothermen Kreislaufstillstand und Zwischenrippenarterie Reimplantation haben die Inzidenz dieser Komplikation 2 reduziert, aber viel zu viele Patienten weiterhin betroffen sein.

Klinisch, Rückenmark Ischämie und Reperfusion wird entweder sofort oder verzögert Lähmung nach der Intervention 3 zu sehen. Allerdings hat unser Verständnis von dieser Verletzung durch einen Mangel an mechanistischen Detail erstickt worden. Als Ergebnis sind einige Optionen zur Verfügung, um die Schädigung zu dämpfen, wenn es aufgetreten ist.

Wir haben so ein kleines Tier angeworben, murinen Modell des Rückenmarks Ischämie und Reperfusion zubesser zu charakterisieren seine Pathogenese. Die Mehrzahl der Studien haben bisher größere Tiermodelle verwendet werden, um diese Verletzung, nämlich Ratte 4, 5 Kaninchen, Schwein und 6 Modelle charakterisieren. Diese sind aber durch ihre Kosten, Komplexität, variable Reproduzierbarkeit, und, am wichtigsten, der Mangel an verfügbaren Techniken zur genetischen Manipulation beschränkt. Die zuverlässigste dieser veröffentlicht Tiermodellen beinhaltet infra Abklemmen der Bauchaorta bei Kaninchen. Allerdings menschlichen vorderen Rückenmarkneuronen am häufigsten leiten ihre Gefäßversorgung von mehr proximalen Äste 7. Variable vaskulären Anatomie der Wirbelsäule in diesen Modellen addiert zu Schwierigkeiten beim Übergang ihre Ergebnisse in die klinische Verwendung.

Dieses Manuskript präsentiert ein Modell für die sofortige oder spätere Querschnittslähmung nach Thorax Aortenokklusionsvorrichtung, die klinisch relevant und einfach zu verwenden ist. Die Belichtung der Aortenbogen über Mini sternotomeine ist weniger invasiv und hoch reproduzierbare Ergebnisse mit minimaler Morbidität und Mortalität zu entlocken. Während dieses Modell in nicht ohne Herausforderungen und technischen Nuancen, können diese mit einer sorgfältigen Präparation und Gewebebehandlung überwunden werden, um ein Modell der Hinterbeinlähmung, die leicht implementiert werden kann produzieren.

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Protocol

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1. Die präoperative Vorbereitung und Anästhesie

  1. Achten Sie darauf, steriler Technik während des gesamten Verfahrens zu beobachten. Legen Sie alle Instrumente.
  2. Einschalten des Temperatur-Steuerbett vor Narkoseeinleitung, so daß sie auf die geeignete Temperatur (36,5 ° C) zu erwärmen. Schalten Sie den Laser-Doppler-Perfusion-Monitor, so dass es während der Induktion kann booten.
  3. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer.
    1. Die Atemfrequenz der Maus während der Induktion sorgfältig überwachen.
    2. Sobald die Atemfrequenz ist visuell verlangsamt, entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer.
    3. Führen Zehe Prise zu Angemessenheit der Narkose zu beurteilen.
  4. Mit der Maus richtig betäubt, statt der Maus in Rückenlage.
  5. Legen Gesicht in Nasenkegel und sichern Sie alle Extremitäten an die Heizungs Tisch.
    1. Achten Sie besonders auf, um sicherzustellen, dass die Extremitäten sind in anatomischen Position gesichert, ohne deviatiauf der einen Seite. Wenn die Maus nicht richtig positioniert ist, ist es schwierig, Brustwandarterie Trennung während Sternotomie zu vermeiden.
  6. Mit Knipser oder handelsübliche Haarentfernungscreme, entfernen Haare von der Mittellinie Thorax und linken unteren Extremität Bauchseite.
    1. Bei der Verwendung von Haarentfernungscreme, Sahne vermeiden, dass an Ort und Stelle für mehr als 30 Sekunden, kann als Verätzungen auftreten.
  7. Titriert flüchtigen Narkosezerstäubers Konzentration, um eine ausreichende Anästhesie erhalten.
    1. Erwartete Verdampfer Fraktionen sind zwischen 1-5% mit Isofluran mit hohen Durchfluss O 2.
    2. Flüchtige Narkosezerstäubers Konzentration sollte titriert werden, um Anästhesie bei chirurgischen Stimulierung während spontane Atmung.

2. Rektale Sonde Laser-Doppler-Placement

  1. Legen geschmiert rektale Sonde in der Maus die Rektum. Sichern Sie in Ort, um opertriebs Bett.
  2. Stellen Sie die Heizung Bett für eine Ziel rektale Temperatur von 36,5 ° C
  3. Machen Sie kleine Inzision über Oberschenkelarterie Maus und sezieren Haut vom Unterhautgewebe.
  4. Legen Laser-Doppler-Sonde über Oberschenkelarterie.
  5. Stellen Sondenpositionen bis die Perfusion Monitor registriert mehr als 800 Einheiten Perfusion.
    1. Fest sichere Sonde an Ort und Stelle. Nicht ordnungsgemäß gesichert Sonden können falsch niedrige Perfusionsmessungen haben.

3. Dissektion der Aorta Arch / subclavia

  1. Machen Sie eine 2 cm Hautschnitt über dem Brustbeinende und sanft sezieren Haut vom Unterhautgewebe.
  2. Präparieren Sie die Unterkieferspeicheldrüse kostenlos.
    1. Wenn die Blutung auftritt, kann sanften Druck mit einem Wattestäbchen aufgetragen werden.
    2. Teilen Sie die Unterkieferspeicheldrüse durch Mittellinie in der avaskulären-Ebene.
  3. Heben Sie mit einer Pinzette und Brustbein mit der scissors machen 1 cm Sternotomie Mittellinie durch die Mittellinie des Brustbeins. Jede Abweichung von der Mittellinie in der inneren Brustarterie Blutung, die schwer zu kontrollieren sein wird, führen.
  4. Platzieren 5-0 Rückzugs Nähte auf jeder Seite an der Kante des Brustbein-und Einfahren Brustbein seitlich Befestigungsnähte an den Betriebs Bett. Vermeiden Rückzugs Nähte seitlich Pneumothorax zu verhindern.
  5. Mit stumpf freie Band Muskeln entlang der Luftröhre. Die linke Gurt Muskel kann mit einer Schere geteilt werden, um die Exposition zu verbessern.
  6. Präparieren Sie befreien den Thymus vom umgebenden Gewebe. Weiter stumpf, bis die großen Gefäße sichtbar gemacht werden. Seien Sie äußerst vorsichtig, um Eingang in den Brustraum zu verhindern.
  7. Zeigen Gefäßklemmen auf Aortenbogen und linken Schlüsselbeinarterie.
  8. Stellen Sie sicher, distalen Fluss hat entsprechend gestört. Dies wird als eine Reduktion von> 90% in Perfusion Einheiten gesehen werden.
    1. Weiter Okklusion für desirot für 4-8 min.
  9. Gefäßklemme entfernen und überprüfen, Blutstillung vor Schließung der Brust.

4. Schließung von Sternotomy und Haut

  1. Entfernen der Rückzugs Naht auf der linken Seite der Maus.
  2. Schließen Sie die Sternotomie mit der rechten Rückzug Naht.
    1. Eine einzelne Brustbeinnaht (mit der zuvor platziert Rückzug Stich) ist ausreichend für die Brustbeinverschluss. Platzieren anderen Stich ist unnötig und erhöht die Risiken der Pneumothorax und Blutungen.
  3. Schließen Haut mit fließendem 5-0 Stich.

5. Recovery-und postoperative Beurteilung

  1. Übertragen Sie die Maus, um Recovery-Käfig. Cage sollte auf einem Heizkissen, um die Umgebungstemperatur der Rückgewinnungskammer zu erhöhen und den Wärmeverlust an die Umwelt zu reduzieren platziert werden.
  2. Die Maus auf Anzeichen Atemnot oder Krampfaktivität genau beobachten. Verwalten Analgesie pro Einrichtung Richtlinien. Euthanize Mäuse sofort, wenn Beschlagnahme oder Atemnot beobachtet.
    1. CO 2-Kammer-Euthanasie ist unsere bevorzugte Methode. Genickbruch ist eine weitere Option, wenn CO 2 ist nicht verfügbar.
    2. Vollständige Rückgewinnung kann in 1-2 Stunden erwartet werden, abhängig von der Länge der flüchtigen Anästhetikums und der verwendeten Konzentration.
  3. Bringen Sie die Maus, um normalen Käfig. Zeigen Nahrung und Wasser statt auf dem Boden des Käfigs.
  4. Bewerten neurologischen Status bei 12 h Abständen mit Basso Maus Skala für Locomotion 8.

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Representative Results

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Mäuse Scheinoperation unterzogen (n = 3) oder Aortenokklusionsvorrichtung 4 (n = 3) bis 8 min (n = 3). Postoperativ wurden die Mäuse durch das Basso Maus Punktzahl (1) bewertet. Mäuse, die Scheinoperation unterzogen hatte keine feststellbaren Funktionsdefizite an jedem Punkt postoperativ. Mäuse zu moderaten Ischämie (4 min) unterzogen hatten in der Nähe von normalen Hintergliedmaßenfunktion bei 12 h mit progressiven Funktionsabnahme zu Lähmungen von 48 Stunden zu beenden. Mäuse in längerer Ischämie-Gruppe (8 min) hatte vollständige Lähmung nach der Operation ohne erzielbaren-Funktion (Abbildung 2).

Figur 1
Fig. 1 ist. Basso Ergebnis für Hind Gliedmaßen Motor Function 8. Bewertungssystem für die hinteren Gliedmaßen neurologische Dysfunktion von 0 (keine Funktion) bis 9 (normale Funkti benotetauf). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
Abbildung 2. Postoperative Hind-Limb-Funktion. Die Schwere der neurologischen Defizit wurde mit der Basso-Maus-Skala bei 12 Stunden postoperativ Intervallen bis zu 48 Stunden bewertet. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Discussion

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Paraplegie sekundäre Rückenmark-Ischämie Reperfusion ist das Ergebnis eines komplexen schlecht verstanden Pathologien 9. Während dieser wird am häufigsten nach thorakoabdominellen Aorten-Operation gesehen hat, kann eine Vielzahl von anderen Beleidigungen wie Aortendissektion, Trauma, Embolie, Vaskulitis, Hypotonie und systemischen 10 in Querschnittslähmung führen. Zum weiteren Verständnis dieser Verletzung zu gewinnen und Ziele für die Zukunft stellen, um diese Verletzung zu beseitigen, haben Tiermodelle eine Notwendigkeit geworden.

Patienten mit dieser Komplikation weisen entweder eine sofortige oder verzögerte Lähmung befallen. Dieses Modell und andere adäquat parallel 11 die bimodale Verteilung der Lähmung klinisch gesehen. Während moderate Ischämie (4 min) erzeugt eine verzögerte Lähmung, verlängert Ischämie (8 min) führte zu einer sofortigen und dauerhaften Lähmung.

Das vorgestellte Modell hat Vorteile im Vergleich zu denen al erfordernateral Thorakotomie 12,13. Die mediane Sternotomie Belichtung lässt die Brusthöhle intakt und eliminiert die Notwendigkeit für tracheale Intubation oder Wiederherstellung der Unterdruck im Brustraum. Klinisch wird die Sternotomie mit viel weniger postoperative Schmerzen in als die laterale Thorakotomie assoziiert und könnten postoperative analgetische Anforderungen zu reduzieren.

Dieses Modell ist nicht ohne Einschränkungen. Wie bei anderen Modellen hat murinen Operation eine Lernkurve und gute OP-Technik ist zwingend erforderlich. Mäuse können schnell erliegen, wenn Dissektion nicht mit Sorgfalt getan. Die häufigsten Ursachen für die intraoperative Mortalität sind Blutungen oder Pneumothorax. Um potenziell tödliche Blutungen zu vermeiden, müssen die Sternotomie Mittellinie vorgenommen werden. Wenn die Sternotomie zu seitlich gemacht eine Transaktion von inneren Brustarterien und anschließende Blutung auftreten. Darüber hinaus können grobe Dissektion der absteigenden Aorta und der A. subclavia in die Blutung führen wird Schwierigkeiten seint oder unmöglich zu kontrollieren. Pneumothorax sind ein weiterer potenziell tödliche Komplikation. Diese in der Regel während der Platzierung der Rückzug Nähte oder Dissektion der Aorta auftreten. Wenn Rückzugs Nähte Ort auch seitlich oder in der Aortenbogen nicht mit Sorgfalt seziert ein Pneumothorax auftreten können und sind universell fatal.

Weitere Schritte müssen eingesetzt werden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Normothermie ist kritisch. Mäuse werden während der Operation so nahe 36,5 ° C wie möglich gehalten. Auch leichte Unterkühlung hat gezeigt, dass sie in signifikanten neuroprotektive Effekte in Rückenmark und Taktmodelle 14,15 zu haben. Darüber hinaus sollte der Laser-Doppler-Messungen genau überwacht und Mäusen mit nur 90% Reduktion der distalen Fluss sollte zum Vergleich einbezogen werden. Unvollständige Verschluss der Aorta oder subclavia kann zu höheren distalen Ströme und Ergebnisse, die sehr unterschiedlich sind.

Im Ergebnis der Mausmodell der lower Extremität Lähmung vorgestellt leicht angenommen werden, was sehr reproduzierbare Ergebnisse. Anwendungen dieses Modells kann mit einem Mittel, um die sofortige und verzögerte Lähmung zu studieren, sofern die Ermittler. Darüber hinaus könnten Annahme dieses Modell als nützlich erweisen, im Kampf gegen diese verheerende Komplikation.

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Disclosures

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Wir möchten die Thoraxchirurgie-Stiftung für Bildung und Forschung für die finanzielle Unterstützung dieses Projekts danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VMS Anesthesia Machine MDS Matrx
Isoflurane Vet One 13985-528-60 2.0% through nose cone 
Induction Chamber Vet Equip 941444
Heating Bed Vestavia Scientific
Lazer Doppler Monitor Moor Instruments VMS-LDF1
5-0 Suture, Polyester Surgidac VD-551 Taper Needle
Microdissecting Clips Biomedical Research Instruments 14-1030, 14-1060
Surgical Instruments Fine Surgical Instruments Forceps, needle holder

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References

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Cite this Article

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).More

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).

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