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Medicine

स्पाइनल कॉर्ड Ischemia-reperfusion की एक murine मॉडल में वक्ष महाधमनी आड़ द्वारा reproducable Paraplegia

doi: 10.3791/50910 Published: March 3, 2014

Summary

रीढ़ की हड्डी ischemia-reperfusion चोट के यंत्रवत समझ की कमी के कारण उच्च जोखिम महाधमनी आपरेशन निम्न अंगों का पक्षाघात रोकने के लिए आगे adjuncts रुकावट है. इस प्रकार, पशु मॉडल का विकास जरूरी है. इस पांडुलिपि एक murine मॉडल में वक्ष महाधमनी रोड़ा निम्नलिखित प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निचले छोर पक्षाघात दर्शाता है.

Abstract

पृष्ठभूमि
निचले छोर पक्षाघात महाधमनी उपायों को मुश्किल बना हुआ है. अंतर्निहित विकृति की समझ की कमी के कारण घटना को इस चोट को कम करने के लिए प्रगति रुकावट है. मौजूदा मॉडल वक्ष महाधमनी रोड़ा निम्नलिखित प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निचले छोर पक्षाघात दर्शाता है.

तरीके
वयस्क पुरुष C57BL6 चूहों isoflurane के साथ anesthetized थे. एक cervicosternal चीरा के माध्यम से महाधमनी अवगत कराया गया था. उतरते वक्ष महाधमनी और बाएं अवजत्रुकी धमनियों फुफ्फुस अंतरिक्ष में प्रवेश द्वार के बिना पहचान की गई. इन धमनियों की Skeletonization 4 मिनट (मध्यम ischemia) या 8 मिनट (लंबे समय तक ischemia) के लिए तत्काल बंद (नकली) या रोड़ा द्वारा पीछा किया गया था. sternotomy और त्वचा बंद कर दिया गया और माउस वसूली के लिए वार्मिंग बिस्तर पर स्थानांतरित किया गया था. वसूली के बाद, कार्यात्मक विश्लेषण 48 घंटा तक 12 घंटे के अंतराल पर प्राप्त हुई थी.

परिणाम
नकली सर्जरी कराना पड़ा कि चूहों कोई नमूदार पिछले अंग घाटा दिखाया. 4 मिनट के लिए मध्यम ischemia के अधीन चूहों 48 घंटा में पक्षाघात पूरा करने के लिए प्रगति के द्वारा पीछा किया 12 घंटे में कम से कम कार्यात्मक घाटा था. लंबे समय तक ischemia के अधीन चूहों पश्चात की अवधि में किसी भी बिंदु पर कोई प्रत्यक्ष हिंद अंग आंदोलन के साथ एक तत्काल पक्षाघात था. कोई मनाया intraoperative या पोस्ट ऑपरेटिव मृत्यु दर हुई थी.

समापन
चाहे तत्काल देरी या प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निचले छोर पक्षाघात एक murine मॉडल में प्राप्त किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, एक औसत sternotomy और सावधान विच्छेदन, उच्च जीवित रहने की दरों, और reproducibility का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.

Introduction

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निचले छोर पक्षाघात thoracoabdominal उपायों को मुश्किल बना हुआ है. रीढ़ की हड्डी ischemia-reperfusion चोट (SCIR) के रूप में जाना जाता चोट, उच्च जोखिम वाले रोगियों 1 के 20% में पक्षाघात में परिणाम है. इस तरह छोड़ दिया है दिल की बाईपास, काठ cerbrospinal तरल पदार्थ नालियों, hypothermic संचार गिरफ्तारी और पसलियों के बीच धमनी reimplantation रूप में शल्य चिकित्सा adjuncts इस जटिलता 2 की घटनाओं को कम कर दिया है, लेकिन, अभी तक भी कई रोगियों प्रभावित हो रहे हैं.

चिकित्सकीय, रीढ़ की हड्डी ischemia और reperfusion चोट हस्तक्षेप 3 निम्नलिखित पक्षाघात तत्काल देरी या किसी भी रूप में देखा जाता है. हालांकि, इस चोट के बारे में हमारी समझ को यंत्रवत विस्तार की कमी से दबा दिया गया है. नतीजतन, कुछ विकल्प यह हो गई है एक बार चोट attenuate करने के लिए उपलब्ध हैं.

हम इस तरह की रीढ़ की हड्डी ischemia के एक छोटे जानवर, murine, मॉडल आयोजिक, और reperfusion चोट करने के लिए हैबेहतर अपनी रोगजनन विशेषताएँ. तिथि करने के लिए अध्ययन के बहुमत इस चोट, अर्थात् चूहा 4, खरगोश 5, और सुअर 6 मॉडल चिह्नित करने के लिए बड़ा पशु मॉडल का इस्तेमाल किया है. हालांकि, इन उनकी लागत, जटिलता, चर reproducibility, और, सबसे महत्वपूर्ण बात, आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपलब्ध तकनीक के अभाव के कारण सीमित कर रहे हैं. इन प्रकाशित पशु मॉडल की सबसे विश्वसनीय खरगोश में उदर महाधमनी के अधोमूत्र पिंडीय पार clamping शामिल है. बहरहाल, मानव पूर्वकाल रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स सबसे अक्सर अधिक समीपस्थ शाखाओं 7 से उनके संवहनी आपूर्ति निकाले जाते हैं. इन मॉडलों में रीढ़ की हड्डी के चर नाड़ी शरीर रचना नैदानिक ​​प्रयोग में उनके परिणाम संक्रमण में कठिनाई के लिए कहते हैं.

इस पांडुलिपि नैदानिक ​​प्रासंगिक और रोजगार के लिए आसान है कि वक्ष महाधमनी रोड़ा निम्नलिखित तत्काल या देरी के अंगों का पक्षाघात के लिए एक मॉडल प्रस्तुत करता है. मिनी sternoto के माध्यम से महाधमनी चाप का एक्सपोजरमेरी कम आक्रामक है और कम से कम रुग्णता और मृत्यु दर के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों बटोर कर सकते हैं. चुनौतियों और तकनीकी बारीकियों के बिना नहीं में इस मॉडल, ये आसानी से लागू किया जा सकता है कि पिछले अंग पक्षाघात का एक मॉडल का उत्पादन करने के लिए सावधान विच्छेदन और ऊतक से निपटने के साथ दूर किया जा सकता है.

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Protocol

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1. शल्यक्रिया पूर्व तैयारी और संज्ञाहरण

  1. प्रक्रिया के दौरान बाँझ तकनीक का पालन सुनिश्चित करें. सभी उपकरणों बाहर रखना.
  2. यह उचित तापमान (36.5 डिग्री सेल्सियस) के लिए गर्म हो सकता है, ताकि पूर्व संवेदनाहारी प्रेरण को तापमान नियंत्रण बिस्तर पर मुड़ें. लेजर डॉपलर छिड़काव मॉनीटर पर पॉवर यह प्रेरण दौरान बूट कर सकते हैं.
  3. प्रेरण कक्ष में माउस रखें.
    1. ध्यान से प्रेरण दौरान माउस की सांस की दर पर नजर रखने के.
    2. जैसे ही श्वसन दर नेत्रहीन धीमी कर दी है, के रूप में शामिल कक्ष से माउस को हटा दें.
    3. संवेदनाहारी की पर्याप्तता का आकलन करने के लिए पैर के अंगूठे चुटकी प्रदर्शन करना.
  4. लापरवाह स्थिति में माउस ठीक से anesthetized के साथ, जगह माउस.
  5. नाक शंकु में चेहरा डालें और हीटिंग मेज पर सभी हाथ - पांव सुरक्षित.
    1. हाथ - पांव कोई deviati साथ, शारीरिक स्थिति में सुरक्षित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान देनाएक तरफ पर. माउस को अनुचित तरीके से तैनात किया जाता है, यह sternotomy दौरान आंतरिक वक्ष धमनी transection से बचने के लिए मुश्किल है.
  6. कतरनी या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बालों को हटाने क्रीम का उपयोग, midline छाती से बालों को हटाने और निचले छोर उदर सतह छोड़ दिया है.
    1. बालों को हटाने क्रीम का उपयोग, अधिक से अधिक से अधिक 30 सेकंड के लिए जगह में क्रीम छोड़ने से बचने के हैं, के रूप में क्षार जलता हो सकता है.
  7. पर्याप्त संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए अस्थिर संवेदनाहारी vaporizer एकाग्रता टाइट्रेट.
    1. उच्च प्रवाह ओ 2 के साथ isoflurane का उपयोग% 1-5 के बीच उम्मीद vaporizer भिन्न हैं.
    2. अस्थिर संवेदनाहारी vaporizer एकाग्रता सहज respirations बनाए रखते हुए शल्य उत्तेजना के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए titrated किया जाना चाहिए.

2. गुदा जांच लेजर डॉपलर प्लेसमेंट

  1. माउस के मलाशय में चिकनाई गुदा जांच डालें. कार्रवाई करने के स्थान पर सुरक्षितबिस्तर ating.
  2. 36.5 डिग्री सेल्सियस का लक्ष्य गुदा तापमान के लिए ताप बिस्तर समायोजित
  3. माउस की ऊरु धमनी के ऊपर छोटा सा चीरा और दूर चमड़े के नीचे ऊतक से त्वचा काटना.
  4. ऊरु धमनी के ऊपर लेजर डॉपलर जांच डालें.
  5. छिड़काव की निगरानी 800 छिड़काव इकाइयों की तुलना में अधिक से अधिक पंजीकृत करता है जब तक जांच पदों को समायोजित.
    1. जगह में मजबूती से सुरक्षित जांच. अनुचित सुरक्षित जांच झूठा कम छिड़काव माप हो सकता है.

3. महाधमनी चाप / अवजत्रुकी धमनी के विच्छेदन

  1. Sternal पायदान ऊपर एक 2 सेमी त्वचा चीरा और धीरे दूर चमड़े के नीचे ऊतक से त्वचा काटना.
  2. अवअधोहनुज ग्रंथि मुक्त काटना.
    1. खून बह रहा होता है, तो कोमल दबाव एक कपास झाड़ू के साथ लागू किया जा सकता है.
    2. Avascular विमान में midline के माध्यम से अवअधोहनुज ग्रंथि फूट डालो.
  3. धीरे संदंश के साथ उरोस्थि और sciss का उपयोग लिफ्टअन्य रैंकों उरोस्थि के midline के माध्यम से 1 सेमी midline sternotomy बनाते हैं. midline से कोई विचलन को नियंत्रित करना मुश्किल हो जाएगा जो आंतरिक स्तन धमनी नकसीर में परिणाम कर सकते हैं.
  4. उरोस्थि के किनारे पर प्रत्येक पक्ष पर 5-0 त्याग टांके प्लेस और laterally संचालन बिस्तर पर टांके हासिल उरोस्थि वापस लेना. Pneumothoraces को रोकने के लिए भी laterally त्याग टांके रखने से बचें.
  5. श्वासनली साथ कुंद विच्छेदन मुक्त पट्टा की मांसपेशियों का उपयोग करना. छोड़ दिया पट्टा मांसपेशियों जोखिम में सुधार करने के लिए कैंची के साथ बांटा जा सकता है.
  6. आसपास के ऊतकों से थाइमस मुक्त काटना. महान जहाजों कल्पना कर रहे हैं जब तक कुंद विच्छेदन जारी. फुफ्फुस अंतरिक्ष में प्रवेश को रोकने के लिए अत्यधिक सावधानी का प्रयोग करें.
  7. महाधमनी चाप और बाएं अवजत्रुकी धमनी पर संवहनी clamps रखें.
  8. सत्यापित बाहर का प्रवाह उचित बाधित है. यह छिड़काव इकाइयों में एक> 90% की कमी के रूप में देखा जाएगा.
    1. देसी के लिए रोड़ा जारी4-8 मिनट के लिए लाल.
  9. संवहनी दबाना निकालें और छाती के बंद होने से पहले रक्तस्तम्भन सत्यापित.

4. Sternotomy और त्वचा की क्लोजर

  1. माउस के बाईं ओर का त्याग सिवनी निकालें.
  2. सही त्याग सीवन के साथ sternotomy बंद करें.
    1. (पहले से रखा त्याग सिलाई का प्रयोग करके) एक एकल sternal सिवनी sternal बंद करने के लिए पर्याप्त है. एक और सिलाई रखकर अनावश्यक है और वातिलवक्ष और रक्तस्राव का जोखिम बढ़ जाता है.
  3. 5-0 सिलाई चलाने के साथ बंद त्वचा.

5. रिकवरी और पश्चात आकलन

  1. वसूली पिंजरे में माउस स्थानांतरण. केज वसूली चैंबर के परिवेश के तापमान में वृद्धि और पर्यावरण के लिए गर्मी के नुकसान को कम करने के लिए एक हीटिंग पैड पर रखा जाना चाहिए.
  2. बारीकी से संकेत श्वसन संकट या जब्ती गतिविधि के लिए माउस की निगरानी. संस्था के दिशानिर्देशों के अनुसार पीड़ानाश प्रशासन. Euthanize चूहों तुरंत जब्ती या श्वसन संकट मनाया जाता है.
    1. सीओ 2 चैम्बर इच्छामृत्यु हमारे पसंदीदा तरीका है. सीओ 2 उपलब्ध नहीं है तो ग्रीवा अव्यवस्था एक और विकल्प है.
    2. पूरी तरह ठीक होने में इस्तेमाल किया अस्थिर संवेदनाहारी और एकाग्रता की लंबाई के आधार पर 1-2 घंटे में उम्मीद की जा सकती.
  3. सामान्य पिंजरे के लिए माउस लौटें. पिंजरे के तल पर भोजन और पानी की जगह रखें.
  4. हरकत 8 Basso माउस स्केल का उपयोग करते हुए 12 घंटा के अंतराल पर तंत्रिका संबंधी स्थिति का आकलन करें.

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Representative Results

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चूहे नकली सर्जरी कराना पड़ा (n = 3) या 4 (n = 3) से 8 मिनट के लिए महाधमनी रोड़ा (n = 3). Postoperatively चूहों Basso माउस स्कोर (चित्रा 1) द्वारा वर्गीकृत किया गया. नकली सर्जरी कराना पड़ा कि चूहे postoperatively किसी भी बिंदु पर कोई प्रत्यक्ष कार्यात्मक घाटा था. मध्यम ischemia (4 मिनट) के अधीन चूहों 48 घंटा से पक्षाघात पूरा करने के लिए प्रगतिशील कार्यात्मक गिरावट के साथ 12 घंटे में सामान्य हिंद अंग समारोह के पास था. लंबे समय तक ischemia के समूह (8min) में चूहे किसी भी वसूली समारोह के बिना सर्जरी (चित्रा 2) निम्नलिखित पूरा पक्षाघात था.

चित्रा 1
चित्रा 1. Basso पिछले अंग मोटर समारोह 8 स्कोर. 9 (सामान्य कामकाज 0 (कोई समारोह) से उच्च श्रेणी के पिछले अंग तंत्रिका संबंधी रोग के लिए स्कोरिंग प्रणाली) पर. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. पश्चात हिंद अंग समारोह. Neurologic घाटे की गंभीरता को 48 घंटे तक postoperatively 12 घंटा के अंतराल पर Basso माउस स्केल का उपयोग कर वर्गीकृत किया गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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रीढ़ की हड्डी ischemia reperfusion के लिए माध्यमिक अंगों का पक्षाघात खराब समझ विकृतियों 9 की एक जटिल का परिणाम है. यह सबसे अधिक thoracoabdominal महाधमनी सर्जरी के बाद देखा जाता है, इस तरह के महाधमनी विच्छेदन, आघात, embolic घटना, वाहिकाशोथ, और प्रणालीगत हाइपोटेंशन के रूप में 10 अन्य अपमान की एक किस्म के अंगों का पक्षाघात में परिणाम कर सकते हैं. इस चोट की आगे की समझ पाने और इस चोट को खत्म करने के लिए भविष्य के लक्ष्यों को प्रदान करने के लिए, पशु मॉडल एक जरूरत बन गए हैं.

मरीजों को इस जटिलता निशंक या तो एक तत्काल देरी या पक्षाघात से पीड़ित. इस मॉडल को और दूसरों को पर्याप्त रूप से चिकित्सकीय देखा पक्षाघात के 11 bimodal वितरण समानांतर. मध्यम ischemia (4 मिनट) एक देरी पक्षाघात का उत्पादन किया है, जबकि लंबे समय तक ischemia (8 मिनट) एक तत्काल और स्थायी पक्षाघात में हुई.

प्रस्तुत मॉडल अल आवश्यकता होती है उन लोगों की तुलना फायदेateral thoracotomy 12,13. मंझला sternotomy जोखिम बरकरार फुफ्फुस गुहा छोड़ देता है और सांस की नली intubations या फुफ्फुस अंतरिक्ष में नकारात्मक दबाव reestablishing के लिए की आवश्यकता समाप्त. चिकित्सकीय, sternotomy पार्श्व thoracotomy से काफी कम पश्चात दर्द के साथ जुड़ा हुआ है और पश्चात एनाल्जेसिक आवश्यकताओं को कम कर सकते हैं.

इस मॉडल सीमाओं के बिना नहीं है. अन्य मॉडलों के साथ के रूप में, murine सर्जरी एक सीखने की अवस्था है और अच्छा सर्जिकल तकनीक जरूरी है. विच्छेदन की देखभाल के साथ नहीं किया जाता है तो चूहे जल्दी से परास्त कर सकते हैं. intraoperative मृत्यु का सबसे आम कारण रक्तस्राव या वातिलवक्ष हैं. घातक नकसीर से बचने के लिए sternotomy midline बनाया जाना चाहिए. Sternotomy भी laterally किया जाता है, तो आंतरिक स्तन धमनियों और बाद में रक्तस्राव की एक लेन - देन हो सकती है. इसके अतिरिक्त, महाधमनी और अवजत्रुकी धमनी अवरोही का किसी न किसी विच्छेदन difficul हो जाएगा नकसीर में परिणाम कर सकते हैंटी या नियंत्रित करने के लिए असंभव है. Pneumothoraces एक और घातक उलझन में हैं. ये आम तौर पर त्याग टांके या महाधमनी के विच्छेदन की नियुक्ति के दौरान हो. त्याग टांके भी laterally जगह हैं या महाधमनी चाप देखभाल के साथ विच्छेदित नहीं है, तो एक वातिलवक्ष होते हैं और सार्वभौमिक घातक हो सकता है.

आगे कदम reproducibility सुनिश्चित करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए. Normothermia महत्वपूर्ण है. शल्य चिकित्सा के दौरान चूहों संभव के रूप में 36.5 डिग्री सेल्सियस के करीब के रूप में रखा जाता है. यहां तक कि हल्के हाइपोथर्मिया रीढ़ की हड्डी और स्ट्रोक मॉडल 14,15 में महत्वपूर्ण neuroprotective प्रभाव है में दिखाया गया है. इसके अलावा, लेजर डॉपलर माप बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए और बाहर का प्रवाह में केवल 90% की कमी के साथ चूहों की तुलना के लिए शामिल किया जाना चाहिए. अत्यधिक चर रहे हैं कि उच्च बाहर का प्रवाह और परिणामों में महाधमनी या अवजत्रुकी धमनियों का अधूरा रोड़ा कर सकते हैं परिणाम.

अंत में, एल के murine मॉडलप्रस्तुत ower सिरा पक्षाघात आसानी से अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों से बेदखल अपनाया जा सकता है. इस मॉडल के आवेदन तत्काल और देरी पक्षाघात का अध्ययन करने के लिए एक साधन के साथ अन्वेषक प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा, इस मॉडल की गोद लेने के लिए इस घातक जटिलता का मुकाबला करने में फायदेमंद साबित हो सकता है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

हम इस परियोजना के अपने वित्तीय सहायता के लिए अनुसंधान और शिक्षा के लिए छाती रोगों की सर्जरी फाउंडेशन को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VMS Anesthesia Machine MDS Matrx
Isoflurane Vet One 13985-528-60 2.0% through nose cone 
Induction Chamber Vet Equip 941444
Heating Bed Vestavia Scientific
Lazer Doppler Monitor Moor Instruments VMS-LDF1
5-0 Suture, Polyester Surgidac VD-551 Taper Needle
Microdissecting Clips Biomedical Research Instruments 14-1030, 14-1060
Surgical Instruments Fine Surgical Instruments Forceps, needle holder

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References

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Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).More

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