Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Reproduserbar Paraplegi av Thoracic Aorta Okklusjon i en Muse Model of Spinal Cord iskemi-reperfusjon

doi: 10.3791/50910 Published: March 3, 2014

Summary

Mangelen på mekanistisk forståelse av ryggmargen iskemi-reperfusjon skade har hindret ytterligere tilleggsbehandling for å hindre paraplegi følgende høyrisiko aorta operasjoner. Dermed er utviklingen av dyremodeller avgjørende. Dette manuskriptet demonstrerer reproduserbar underekstremitetene lammelse etter torakal aorta okklusjon i en murine modell.

Abstract

Bakgrunn
Underekstremitetene lammelse fortsetter å komplisere aorta intervensjoner. Mangelen på forståelse av den underliggende patologi har hindret fremskritt for å redusere forekomsten denne skaden. Den nåværende modellen demonstrerer reproduserbar underekstremitetene lammelse etter torakal aorta okklusjon.

Metoder
Voksne mannlige C57BL6 mus ble bedøvet med isofluran. Gjennom et innsnitt cervicosternal aorta ble eksponert. Den synkende thorax aorta og venstre subclavia arterier ble identifisert uten inngang til pleural plass. Skeletonization av disse arterier, etterfulgt av umiddelbar lukning (Sham) eller okklusjon i 4 minutter (moderat iskemi) eller 8 min (forlenget ischemia). Den sternotomi og huden ble stengt og musen ble overført til oppvarming seng for utvinning. Etter utvinning, ble funksjonsanalyse innhentet ved 12 timers intervaller til 48 hr.

Resultater
Mus som gjennomgikk humbug kirurgi viste ingen observerbar hind lem underskudd. Mus som er utsatt for moderat iskemi for 4 min hadde minimal funksjonell underskudd på 12 hr fulgt av progresjon til fullstendig lammelse på 48 hr. Mus som utsettes for langvarig iskemi hadde en umiddelbar lammelse uten observerbar hind-lem bevegelse på noe punkt i den postoperative perioden. Det var ingen observert intraoperativ eller postoperativ mortalitet.

Konklusjon
Reproduserbar underekstremitetene lammelse enten umiddelbart eller forsinket kan oppnås i en murine modell. I tillegg, ved bruk av en midtlinje sternotomi og forsiktig disseksjon, høye overlevelsesrater og reproduserbarhet kan oppnås.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Underekstremitetene lammelse fortsetter å komplisere thoracoabdominal intervensjoner. Skaden, kjent som ryggmarg iskemi-reperfusjonsskade (SCIR), fører til paralyse hos opptil 20% av høyrisikopasienter en. Kirurgiske adjuncts som venstre hjerte bypass, lumbale cerbrospinal væske renner, hypothermic sirkulasjonsstans og interkostalrom arterie reimplantation har redusert forekomsten av denne komplikasjonen to, men altfor mange pasienter fortsetter å bli påvirket.

Klinisk, ryggmarg iskemi og reperfusjon skade er sett på som enten umiddelbar eller forsinket lammelse etter intervensjon tre. Men vår forståelse av denne skaden blitt kvalt av mangel på mekanistisk detalj. Som et resultat av noen alternativer er tilgjengelige for å dempe skade når det har forekommet.

Vi har derfor engasjert et lite dyr, murine, modell av ryggmarg iskemi, og reperfusjonssykdommer tilbedre karakterisere sin patogenesen. De fleste studiene hittil har brukt større dyremodeller for å karakterisere denne skaden, nemlig rotte 4, kanin fem, og gris seks modeller. Imidlertid er disse begrenset av sine kostnader, kompleksitet, variabel reproduserbarhet, og, viktigst av alt, mangel på tilgjengelige teknikker for genetisk manipulasjon. Den mest pålitelige av disse publiserte dyremodeller innebærer infrarenale kors klemming av abdominal aorta i kaniner. Men menneskelig fremre spinal nevroner oftest henter sin vaskulær forsyning fra flere proksimale grener 7. Variabel vaskulær anatomi i ryggmargen på disse modellene legger til problemer i overgangen sine resultater i klinisk bruk.

Dette manuskriptet presenterer en modell for umiddelbar eller forsinket paraplegi etter torakal aorta okklusjon som er klinisk relevant og lett å bruke. Eksponering av aortabuen via mini sternotomin er mindre invasiv og kan lokke fram svært reproduserbare resultater med minimal sykelighet og dødelighet. Mens denne modellen på ikke uten tekniske utfordringer og nyanser, disse kan bli overvunnet med forsiktig disseksjon og vev håndtering for å produsere en modell for hind lem lammelse som lett kan implementeres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Preoperativ Forberedelse og anestesi

  1. Sørg for å observere steril teknikk gjennom hele prosedyren. Legg ut alle instrumenter.
  2. Slå på temperaturkontrollen sengen før bedøvelse induksjon, slik at den kan oppvarmes til en passende temperatur (36,5 ° C). Slå på laser Doppler perfusjon skjermen slik at den kan starte opp i løpet av induksjon.
  3. Plasser musen i induksjonskammeret.
    1. Overvåke nøye respirasjonsfrekvens på musen under induksjon.
    2. Så snart åndedrettsfrekvensen er visuelt avtatt, fjerner musen fra induksjonskammeret.
    3. Utfør tå klype for å vurdere tilstrekkeligheten av bedøvelse.
  4. Med musen ordentlig bedøvet, sted mus i liggende stilling.
  5. Sett ansikt i nesen membran og sikre alle ekstremiteter til varmebord.
    1. Vær spesielt oppmerksom på at ekstremiteter er sikret i anatomisk stilling, uten deviatipå den ene siden. Hvis musen er feil plassert, er det vanskelig å unngå intern thorax arterie tran under sternotomi.
  6. Bruke clippers eller kommersielt tilgjengelig hårfjerning krem, fjerne hår fra midtlinjen thorax og venstre nedre ekstremitet ventral overflaten.
    1. Hvis du bruker hårfjerning krem, unngå å forlate krem ​​i stedet for mer enn 30 sek, kan så alkalisk forbrenning oppstå.
  7. Titrer flyktige bedøvelse vaporizer konsentrasjon for å opprettholde tilstrekkelig anestesi.
    1. Forventet vaporizer fraksjoner er mellom 1-5% ved hjelp av isofluran med høy flyt O 2.
    2. Volatile bedøvelse vaporizer konsentrasjon bør titreres for å opprettholde anestesi under kirurgisk stimulering og samtidig opprettholde spontane respirasjon.

2. Endetarms Probe Laser Doppler Placement

  1. Sett smurt rektal probe inn i musens rektum. Sikre på plass om betjeningkende seng.
  2. Justere varme sengen for et mål rektal temperatur på 36,5 ° C.
  3. Gjør lite snitt i løpet lårarterie av mus og dissekere huden vekk fra subcutaneous vev.
  4. Sett laser Doppler sonden over lårarterie.
  5. Juster probe stillinger inntil perfusjon monitor registrerer større enn 800 perfusjon enheter.
    1. Fast sikker sonden på plass. Dårlig sikret prober kan ha falskt lav perfusjon målinger.

Tre. Disseksjon av Aorta Arch / subclavia

  1. Lag en 2 cm hud innsnitt over sternal hakk og forsiktig dissekere huden vekk fra subcutaneous vev.
  2. Dissekere submandibular kjertel gratis.
    1. Hvis blødningen oppstår, kan lett trykk påføres med en bomullspinne.
    2. Fordel submandibular kjertel gjennom midtlinjen i avascular flyet.
  3. Løft forsiktig sternum med pinsett og bruke scissORS gjør en cm midtlinjen sternotomi gjennom midtlinjen av sternum. Eventuelle avvik fra midtlinjen kan føre til intern mammary arterie blødning som vil være vanskelig å kontrollere.
  4. Plasser 5-0 heve sting på hver side på kanten av brystbeinet og trekke sternum lateralt sikre suturer til drift seng. Unngå å plassere heve sting for sideveis for å hindre pneumothoraces.
  5. Ved hjelp av stump disseksjon gratis stroppen muskler langs luftrøret. Den venstre stroppen muskelen kan deles med saks for å forbedre eksponeringen.
  6. Dissekere frigjøre thymus fra omkringliggende vev. Fortsett stump disseksjon til de store fartøyene er visualisert. Bruk ekstrem forsiktighet for å hindre inngangen til pleurahulen.
  7. Plasser vaskulære klemmer på aortabuen og venstre subclavia.
  8. Kontroller distal flyt har riktig forstyrret. Dette vil bli sett på som en> 90% reduksjon i perfusjon enheter.
    1. Fortsett okklusjon for desirød for 4-8 min.
  9. Fjern vaskulær klemme og verifisere hemostase før nedleggelse av brystet.

4. Nedleggelse av sternotomy og Hud

  1. Fjern tilbaketrekkings sutur på venstre side av musen.
  2. Lukk sternotomi med riktig tilbaketrekkings sutur.
    1. En enkelt sternum sutur (ved hjelp av tidligere plassert tilbaketrekking sting) er tilstrekkelig for sternal nedleggelse. Plassere en annen søm er unødvendig og øker risikoen for pneumothorax og blødning.
  3. Lukk huden med rennende 5-0 sting.

5. Recovery og Postoperativ Assessment

  1. Overfør musen til utvinning bur. Cage skal plasseres på en varmepute for å øke omgivelsestemperaturen til utvinning kammeret og redusere varmetapet til omgivelsene.
  2. Følge nøye med musen for tegn åndenød eller anfall aktivitet. Administrer analgesi per retningslinjer institusjon. EuthaNIZE mus umiddelbart hvis beslag eller åndenød er observert.
    1. CO 2 kammer dødshjelp er vår foretrukne metode. Livmorhals forvridning er et annet alternativ hvis CO 2 er ikke tilgjengelig.
    2. Fullstendig gjenvinning kan forventes i løpet av 1-2 timer, avhengig av lengden av flyktige anestesi og konsentrasjon som brukes.
  3. Returner musen til vanlig bur. Plasser mat og vann plass på gulvet i buret.
  4. Vurdere nevrologisk status ved 12 timers intervaller bruker Basso Mouse Scale for Locomotion åtte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mus gikk sham kirurgi (n = 3) eller aortisk okklusjon for 4 (n = 3) i 8 min (n = 3). Postoperativt mus ble sensureres av Basso Mouse Resultat (Figur 1). Mus som gjennomgikk humbug kirurgi hadde ingen observer funksjonelle underskudd på noe punkt postoperativt. Mus utsatt for moderat iskemi (4 min) hadde nær normal hind-og leddfunksjon på 12 timers med progressiv funksjonell nedgang til fullstendig lammelse av 48 hr. Mus i langvarig iskemi gruppe (8min) hadde fullstendig lammelse etter operasjonen uten utvinnbar funksjon (Figur 2).

Figur 1
Figur 1. Basso Poeng for Hind Limb Motor Function åtte. Scoring system for hind lem nevrologisk dysfunksjon gradert fra 0 (ingen funksjon) til 9 (normal funksjonellepå). Klikk her for å se større bilde.

Fig. 2
Figur 2. Postoperativ Hind-og leddfunksjon. Alvorlighetsgraden av nevrologisk underskudd ble gradert bruker Basso Mouse Scale på 12 timers intervaller postoperativt inntil 48 timer. Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Paraplegi sekundært til ryggmargen iskemi reperfusjon er et resultat av et kompleks av dårlig forstått patologier 9. Selv om dette er mest sett etter thoracoabdominal aorta kirurgi, kan en rekke andre fornærmelser som aorta disseksjoner, traumer, emboliske fenomener, vaskulitt, og systemisk hypotensjon 10 resultere i paraplegi. For å få ytterligere forståelse av denne skaden og gi fremtidige mål å eliminere denne skaden, har dyremodeller blitt en nødvendighet.

Pasienter plaget med denne komplika utstillingen enten en umiddelbar eller forsinket lammelser. Denne modellen og andre tilstrekkelig parallelle 11 den bimodal fordeling av lammelse sett klinisk. Selv moderat iskemi (4 min) ga en forsinket lammelse, langvarig iskemi (8 min) resulterte i en umiddelbar og permanent lammelse.

Den presenterte modellen har fordeler sammenlignet med de som krever alateral Thoracotomi 12,13. Median sternotomi eksponering forlater pleurahulen intakt og eliminerer behovet for tracheal intubasjoner eller reetablere undertrykk i pleurahulen. Klinisk er det sternotomi forbundet med mye mindre postoperativ smerte enn den laterale torakotomi, og kan redusere postoperative smertestillende kravene.

Denne modellen er ikke uten begrensninger. Som med andre modeller, har murine kirurgi en læringskurve og god kirurgisk teknikk er viktig. Mus kan raskt bukke hvis disseksjon ikke gjøres med forsiktighet. De vanligste årsakene til intraoperativ mortalitet er blødning eller pneumothorax. For å unngå potensielt dødelig blødning den sternotomi må gjøres midtlinjen. Dersom sternotomi er gjort for sideveis en transaksjon av interne mammary arterier og påfølgende blødning kan oppstå. I tillegg kan grovt disseksjon av synkende aorta og arteria subclavia resultere i blødning den vil være vanskelighetert eller umulig å kontrollere. Pneumothoraces er et annet potensielt dødelig komplikasjon. Disse vanligvis forekommer under plassering av heve suturer eller disseksjon av aorta. Dersom tilbaketrekkingen sting er stedet også sideveis eller aortabuen er ikke dissekert forsiktig en pneumothorax kan forekomme og er alltid dødelig.

Ytterligere tiltak må brukes for å sikre reproduserbarhet. Normothermia er kritisk. Under operasjonen mus blir holdt så nær 36,5 ° C som mulig. Selv mild hypotermi har vært vist i å ha betydelige nervecellene effekter i ryggmargen og takts modellene 14,15. Videre bør laser Doppler målinger overvåkes nøye og mus med bare 90% reduksjon i distal flyt bør inkluderes for sammenligning. Ufullstendig okklusjon av aorta eller subclavia arterier kan resulterer i høyere distal strømmer og resultater som er svært variabel.

Konklusjonen er at den murine modellen av lower ekstremitet lammelse present kan lett vedtatt, noe som gir svært reproduserbare resultater. Søknader av denne modellen kan gitt etterforskeren med et middel for å studere umiddelbar og forsinket lammelser. Videre kan vedtakelsen av denne modellen være gunstig i bekjempelsen av denne ødeleggende komplikasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Thoracic Surgery Foundation for forskning og utdanning for sin økonomiske støtte til dette prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VMS Anesthesia Machine MDS Matrx
Isoflurane Vet One 13985-528-60 2.0% through nose cone 
Induction Chamber Vet Equip 941444
Heating Bed Vestavia Scientific
Lazer Doppler Monitor Moor Instruments VMS-LDF1
5-0 Suture, Polyester Surgidac VD-551 Taper Needle
Microdissecting Clips Biomedical Research Instruments 14-1030, 14-1060
Surgical Instruments Fine Surgical Instruments Forceps, needle holder

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J. Vasc. Surg. 48, 47-53 (2008).
  2. Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen. Thorac. Cardiovasc. Surg. 59, 79-90 (2011).
  3. Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann. Thorac. Surg. 83, 1345-1355 (2007).
  4. Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27, 1850-1858 (1996).
  5. Naslund, T. C., Hollier, L. H., Money, S. R., Facundus, E. C., Skenderis, B. S. Protecting the ischemic spinal cord during aortic clamping. The influence of anesthetics and hypothermia. Ann. Surg. 409-515 (1992).
  6. Qayumi, A. K., Janusz, M. T., Lyster, D. M., Gillespie, K. D. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J. Invest. Surg. 10, 47-52 (1997).
  7. Lang-Lazdunski, L., Matsushita, K., Hirt, L., Waeber, C., Vonsattel, J. P., Moskowitz, M. A., Dietrich, W. D. Spinal Cord Ischemia: Development of a model in the mouse. Stroke. 31, 208-213 (2000).
  8. Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J. Neurotrauma. 23, 635-659 (2006).
  9. Kwon, B. K., Tetzlaff, W., Grauer, J. N., Beiner, J., Vaccaro, A. R. Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury. Spine. J. 4, 451-464 (2004).
  10. Cheshire, W. P., Santos, C. C., Massey, E. W., Howard, J. F. Spinal cord infarction: etiology and outcome. Neurology. 47, 321-330 (1996).
  11. Kakinohana, M., et al. Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires caspase-3 activation in mice. Stroke. 42, (8), 2302-2307 (2011).
  12. Wang, Z., Yang, W., Britz, G. W., Lombard, F. W., Warner, D. S., Sheng, H. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J. Neurosci. Methods. 189, 246-251 (2010).
  13. model of ischemic spinal cord injury with delayed paralysis caused by aortic cross-clamping. Anesthesiology. 113, 880-891 (2010).
  14. Kang, J., et al. The effects of systemic hypothermia on a murine model of thoracic aortic ischemia reperfusion. J. Vasc. Surg. 52, 435-443 (2010).
  15. Li, J., Benashski, S., McCullough, L. D. Post-stroke hypothermia provides neuroprotection through inhibition of AMP-activated protein kinase. J. Neurotrauma. 28, (7), 1281-1288 (2011).
Reproduserbar Paraplegi av Thoracic Aorta Okklusjon i en Muse Model of Spinal Cord iskemi-reperfusjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).More

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter