En qPCR assay blev udviklet til påvisning af Escherichia coli O157: H7 rettet mod en unik genetisk markør, Z3276. QPCR blev kombineret med propidium monoazide (PMA) behandling til påvisning levende celle. Denne protokol er blevet modificeret og tilpasset til en 96-brønds plade format for nem og ensartet håndtering af talrige prøver
En unik åben læseramme (ORF) Z3276 blev identificeret som en specifik genetisk markør for E. coli O157: H7. En qPCR assay blev udviklet til påvisning af E. coli O157: H7 ved at målrette ORF Z3276. Med dette assay kan vi registrerer så lav som nogle få kopier af genom DNA fra E. coli O157: H7. Følsomheden og specificiteten af assayet blev bekræftet ved intensive valideringstests med et stort antal E. coli O157: H7 stammer (n = 369) og ikke-O157 stammer (n = 112). Desuden har vi propidium monoazide (PMA) procedure kombineret med den nyudviklede qPCR protokol til selektiv detektering af levende celler fra døde celler. Amplifikation af DNA fra PMA-behandlede døde celler blev næsten fuldstændig hæmmet i modsætning til stort set upåvirket amplifikation af DNA fra PMA-behandlede levende celler. Derudover er protokollen blevet modificeret og tilpasset til en 96-brønds plade format for en let og ensartet håndtering af et stort antal prøver. Tventes hans metode til at have en indvirkning på nøjagtige mikrobiologiske og epidemiologiske overvågning af fødevaresikkerhed og miljømæssig kilde.
PCR er en almindelig metode til påvisning af E. coli O157: H7 fra fødevarer og miljøprøver. Identificere specifikke biomarkører for E. coli O157: H7 er en af de vigtigste faktorer for en vellykket detektion i PCR-analyser. Biomarkører, der almindeligvis anvendes i PCR-assays til påvisning af E. coli O157: H7 er bl.a. Shiga toksiner (STX 1 og STX 2) 1,2, uidA 3,4, EAEA 5,6, rfbE 7 og FLIC gener 8,9. Disse biomarkører kan give variabel effektivitet til identifikation, men de fleste af de biomarkører, ikke kan anvendes som en enestående biomarkør til påvisning af E. coli O157: H7. Denne utilstrækkelighed i differentiering magt target gener kræver mere specifik og stærkere biomarkør (er) til identifikation af E. coli O157: H7 10.
Talrige prober for gener eller hypotetiske åbne læserammer (ORF'er) i E. coliO157: H7 11 blev designet til qPCR assay baseret på spor fra DNA genotypebestemmelse microarrays fra vores laboratorium, og ved at søge i GenBank af National Center for Biotechnology Information. Sekvensen af Z3276 ORF, som er en fimbrial gen 11 blev udvalgt til qPCR assay. Efterfølgende blev en qPCR assay udviklet gennem talrige forsøg på PCR parametre, såsom koncentration af primere og prober samt annealing og forlængelse temperaturer (data ikke vist). Efter incitament inklusivitet og eksklusivitet test på referencestammer såsom E. coli O157: H7, ikke-O157 og Shigella stammer i qPCR blev ORF Z3276 identificeret som en specifik og stærk genetisk markør til identifikation af E. coli O157: H7. Så udvikler vi en ny qPCR metode at anvende denne unikke biomarkør for identifikation af E. coli O157: H7.
En anden udfordring i påvisning af E. coli O157: H7 i forurenet fometoder og miljø er nøjagtig bestemmelse af levende celler fra prøver. Det forlængede tilstedeværelse af DNA fra døde celler og manglende evne til at skelne levedygtighed i PCR-analyse kan give falsk-positive aflæsninger, hvilket resulterer i overvurdering af levende celletal i afsløring. Derfor er dette begrænser PCR forbrug i nøjagtig påvisning af fødevarebårne patogener 12. En ny tilgang til at skelne DNA af de døde celler er taget ved at kombinere propidium monoazide (PMA) behandling med PCR-metoden i de sidste par år 13-15. PMA er i stand til at gå ind af døde celler, og indskyde ind i DNA, når de udsættes for lys, men det kan ikke gå inde i levende celler til at reagere med DNA i levende celler. Således i PMA behandlet blandinger af levende og døde celler, DNA af døde celler kan ikke amplificeret i PCR 13. Vi kombineret PMA-behandling med den nyudviklede qPCR assay til selektivt at påvise levende E. coli O157: H7-celler. Derudover har vi gjort PMA-qPCR assay muligt for high throughput detektion.
En primære formål med studiet indebærer brug af en ORF Z3276, en unik E. coli O157: H7, som eneste biomarkør for qPCR assay. På nuværende tidspunkt er de fleste qPCR målrettet virulens gener, såsom stx1, stx2 og EAEA 1,2,5,6 eller fælles fænotypiske gener, såsom uidA 3,4, rfbE og FLIC gener 8,9. Lejlighedsvis, en art eller stamme kan ikke endeligt identificeret ved virulens gen (er), såsom stx 1og stx 2 gener, idet disse gener er til stede i forskellige arter eller stammer 16 såvel. Brug rfbE og FLIC for målgener, er der behov for begge gener skal anvendes til fuldstændig identifikation 17. Brug ORF Z3276 som biomarkør, har dette qPCR analyse vist sig at være følsom og specifik analyse (tabel 1). Denne analyse har været udsat for strenge inklusivitet og eksklusivitet tests, herunder O157: H7 stammer (n = 367), over 100 ikke-O157 stammer og andre patogene arter, såsom Salmonella og Shigella. Alle O157: H7 stammer undersøgte var positivt opdaget, og ingen krydsreaktivitet blev fundet af de ikke-O157 stammer (tabel 1), hvilket indikerer, at ORF Z3276 er en unik og stærk biomarkør til detektion af E. coli O157: H7.
Det andet formål med undersøgelsen er at selektivt detektere levende celler fra døde celler ved PMA-behandling før DNA-ekstraktion. PMA kan trænge ind i de døde celler med kompromitteret membran og bindes til DNA, og derved hæmmer DNA-amplifikation af døde celler i PCR 13. Vi har modificeret procedure PMA-behandling og tilpasset den til en 96-brønds plade format for proceduren. Den rette intensitet lyseksponering er vigtigt at opnå den optimale tværbinding virkning. Tidligere har mikrorør blevet anvendt i dette trin 13-15. Det er imidlertid vanskeligt at håndtere separate mikrorør i lyset exponeringen skridt, og disse rør ikke er helt gennemsigtigt til at opnå den bedste cross-smag. Ved hjælp af en 96-brønds plade, vi forbedret effektiviteten af PMA-behandling. Disse ændringer kan påvirke analysen på flere måder: de gør det lettere at opnå en grundig og ensartet tværbinding virkninger, navnlig med talrige prøver de behandlede prøver kan flyttes fra én plade til en anden for at gøre det muligt for påvisning af et stort antal af prøver og de giver denne PMA-qPCR assay med automatisering potentiale for hele processen. Begrænsningen af dette PMA-qPCR assay er, at PMA-behandling øger PCR-assay omkostninger noget og let nedsat følsomhed af PCR-assay.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker det amerikanske Department of Homeland Security til at give en del af finansieringen.
AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
2 x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
Primer Express | ABI | ||
Probes | ABI | Top of Form | |
4316033 Bottom of Form | |||
PMA | Biodium | 40013 | |
Puregen cell and tissue kit | Qiagene | Top of Form | |
158622 | |||
Bottom of Form | |||
DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
650 w halogen light source | Britek | H8061S | |
Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |