Summary
Een qPCR assay is ontwikkeld voor detectie van Escherichia coli O157: H7 gericht op een unieke genetische merker, Z3276. De qPCR werd gecombineerd met propidium monoazide (PMA) behandeling voor live cell detectie. Dit protocol is gewijzigd en aangepast om een 96-well plaat formaat voor eenvoudige en consistente behandeling van talrijke monsters
Abstract
Een uniek open leesraam (ORF) Z3276 werd geïdentificeerd als een specifieke genetische merker voor E. coli O157: H7. Een qPCR assay ontwikkeld voor de detectie van E. coli O157: H7 door zich te richten ORF Z3276. Met deze assay kunnen we detecteren vanaf een paar kopieën van het genoom DNA van E. coli O157: H7. De gevoeligheid en specificiteit van de assay werd bevestigd door intensieve validatietests met een groot aantal E. coli O157: H7 stammen (n = 369) en niet-O157 stammen (n = 112). Verder hebben we propidium monoazide (PMA) procedure gecombineerd met de nieuw ontwikkelde qPCR protocol voor selectieve detectie van levende cellen van dode cellen. Amplificatie van DNA van PMA behandelde dode cellen werd bijna volledig geremd in tegenstelling tot vrijwel onaangetast amplificatie van DNA van PMA behandelde levende cellen. Daarnaast is het protocol gewijzigd en aangepast om een 96-well plaat formaat voor een eenvoudige en consistente behandeling van een groot aantal monsters. Tzijn methode zal naar verwachting een impact op nauwkeurige microbiologische en epidemiologische bewaking van voedselveiligheid en milieu-bron hebben.
Introduction
PCR is een gebruikelijke techniek voor de detectie van E. coli O157: H7 van voedsel en milieu monsters. Het identificeren van specifieke biomarkers voor E. coli O157: H7 is een van de belangrijkste factoren voor een succesvolle detectie in PCR-tests. De biomarkers gebruikt in PCR testen voor de detectie van E. coli O157: H7 Shiga toxine (stx 1 en stx 2) 1,2, 3,4 uidA, eaeA 5,6, rfbE 7 en Flic genen 8,9. Deze biomarkers kunnen variabele efficiëntie identificatie, maar de meeste van de biomarkers kan worden gebruikt als een unieke biomarker voor de detectie van E. coli O157: H7. Deze gebrekkige differentiatie kracht van target genen vraagt om meer specifieke en sterkere biomarker (s) voor de identificatie van E. coli O157: H7 10.
Talrijke probes voor genen of hypothetische open leesramen (ORFs) in E. coliO157: H7 11 zijn ontworpen voor qPCR assay gebaseerd op de aanwijzingen van genotypering DNA microarrays in ons laboratorium en zoeken binnen de GenBank database van het National Center for Biotechnology Information. De sequentie van ORF Z3276, een fimbria gen 11 werd geselecteerd voor qPCR assay. Vervolgens werd een qPCR assay ontwikkeld door talrijke proeven met PCR parameters zoals de concentratie van primers en probes, en annealing en extensie temperaturen (gegevens niet getoond). Na incentive inclusiviteit en exclusiviteit proeven op referentie stammen zoals E. coli O157: H7, non-O157 en Shigella stammen in de qPCR, de ORF Z3276 werd geïdentificeerd als een specifieke en sterke genetische merker voor de identificatie van E. coli O157: H7. Dan is een nieuwe qPCR methode met behulp van deze unieke biomarker voor de identificatie van E. ontwikkelen we coli O157: H7.
Een andere uitdaging bij detectie van E. coli O157: H7 in verontreinigde foods en milieu is nauwkeurige bepaling van levende cellen uit monsters. De verlengde aanwezigheid van DNA van dode cellen en het onvermogen om de levensvatbaarheid differentiëren PCR veroorzaken vals-positieve aflezingen, waardoor overschatting levende cel aantallen in detectie. Bijgevolg beperkt dit de PCR-gebruik in nauwkeurige detectie van pathogenen 12. Een nieuwe benadering voor het DNA van de dode cellen te onderscheiden is genomen door het combineren van propidium monoazide (PMA) behandeling met PCR-procedure in de laatste paar jaren 13-15. PMA is naar binnen van dode cellen en intercaleren in het DNA bij blootstelling aan licht kunnen, maar kan niet binnen levende cellen reageren met het DNA van de levende cellen. Dus in PMA-behandelde mengsels van levende en dode cellen, het DNA van dode cellen niet worden geamplificeerd in PCR 13. We combinatie PMA behandeling met de nieuw ontwikkelde qPCR assay selectief detecteren levende E. coli O157: H7 cellen. Daarnaast hebben we PMA qPCR een madessay mogelijk voor high throughput detectie.
Protocol
1. Bacteriestammen en DNA Template Voorbereiding
- Grow bacteriële stammen van E. coli O157: H7, non-O157 en andere pathogene soorten, zoals Salmonella en Shigella, bij 37 ° C geïncubeerd onder schudden.
- Uittreksel DNA uit bacterieculturen behulp van de juiste kit (zie tabel van materialen) en volgens de instructies van de fabrikant.
- Meet de optische dichtheid (OD 260) om DNA concentraties te bepalen met behulp van een spectrofotometer.
2. Primer en probe-ontwerp voor de qPCR Assay
- E. coli O157: H7 sequenties zijn van GenBank AE00517411. Ontwerp primers en probe met behulp van geschikte software voor primer en probe ontwerp voor real-time PCR (zie materialen tabel voor details).
De sequenties van de primers en probe als volgt: Z3276-Forward (F) 5'-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 '
Z3276-Reverse (R) 5'-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 '
Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ - Reconstitueren de primer poeder met water, waardoor een concentratie van 10 uM als primer werk oplossing.
- Verdun de sondes tot 10 uM als probe werk oplossingen. Gemerkte probes verschillen in potentie met batches. Daarom Titreer elke partij gelabelde probes voordat u voor een optimale qPCR prestaties.
3. Instellen van de qPCR Bepalingsomstandigheden
- Bereid reactiemengsel, dat bestaat uit 25,0 gl 2x real-time PCR master mix, 200 nM voorwaartse primer, 200 nM reverse primer, en 100 nM probe.
- Voeg 5 pl monster DNA (100 pg) en een geschikt volume water tot een eindvolume van 50 pl te bereiken.
- Voor nontemplate controle, gebruik 5 ul van water om DNA-monster te vervangen.
- Stel de qPCR voorwaarden als volgt: 95 ° C gedurende 10 minuten voor het activeren van TaqMan, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 10 seconden voor denaturatie en 60 en# 176, C gedurende 1 min voor annealing / extensie.
4. qPCR Gevoeligheid Test
- Maak een seriële 10 verdunning uit een kweek mid-exponentiele fase (OD 600 = 0.5; ongeveer 1,5 x 10 8 KVE / ml met plating).
- Voeg 100 ml cel verdunningen op een 96-wells plaat in drievoud.
- Centrifugeer de plaat bij 2500 xg gedurende 10 minuten.
- Voeg 50 ml DNA-extractie oplossing in elk putje.
- Resuspendeer cel pellets met een multi-channel pipet.
- Sluit de plaat met een film, kook de plaat in een waterbad gedurende 10 minuten en centrifugeer bij 2500 xg gedurende 2 minuten.
5. Voorbereiden van levende en dode celmengsels voor PMA behandeling
- Grow 10 ml van E. coli O157: H7 bij 37 ° C tot midden-exponentiële fase en verdeel de cultuur in twee porties.
- Kook een monster van cellen gedurende 10 min in een waterbad dode cellen terwijl de overige hoeveelheid voor levende cellen.
- Controleer dere niet levende cellen van de warmte gedood aliquot door uitplaten van de cellen op LB agarplaten.
- Neem 2 ml van de levende en hitte gedode cellen en de concentratie aan te passen aan 8 x 10 6 CFU / ml van LB-medium. Maak vier sets van cellen verdunningen variërend van 8 x 10 0 tot 8 x 10 6 CFU / ml.
- Met de eerste twee sets cellen verdunningen levende cellen behandeld met PMA of onbehandeld.
- De derde en vierde reeksen verdunningen cellen, voeg 8 x 10 6 dode cellen elke cel verdunning (8 x 10 0-8 x 10 6) om levende en dode cellen mengsels maken.
- Behandel de derde set van verdunning met PMA en gebruik de vierde set van verwatering voor controle.
6. Het behandelen van cellen met PMA
- Los PMA in dimethylsulfoxide (of water) tot 10 mM voorraadoplossing en bewaard bij -20 ° C in het donker maken.
- Aliquot 400 ul van de levende cellen, dode cellen, en het mengsel van levende en dode cellen indrie afzonderlijke microtubes.
- Voeg 2,0 ml 10 mM PMA elke cel monster tot een eindconcentratie van 50 uM.
- Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 min in het donker, zacht schudden een paar keer, 3 sec per keer.
- Voeg 100 ul van de monsters op een 96-wells plaat.
- Dicht de plaat met een optische film en zet de plaat op ijs.
- Zet de plaat 20 cm van een 650 W halogeen lichtbron en bloot voor 2 minuten voor blootstelling aan licht.
- Centrifugeer de plaat bij 2500 xg gedurende 10 minuten, voorzichtig de bovenstaande vloeistof en zorgvuldig uitlekken de plaat op een stuk absorberend papier.
- Resuspendeer celpellets in 50 pl DNA-extractie oplossing en neer te pipetteren twintig keer met een multikanaals Pipetman.
- Dicht de plaat met een film, koken gedurende 10 minuten in een waterbad, en centrifugeer bij 2500 xg gedurende 2 minuten. Het supernatant in de plaat is het DNA uit cellen behandeld met PMA en klaar voor qPCR.
- Voer qPCR als described onder toepassing van 5 pl DNA.
Representative Results
Detectie van E. coli O157: H7 door qPCR gebruik ORF Z3276
Een van de belangrijkste factoren van deze test is de gevoeligheid en specificiteit van de Z3276 sonde gebruikt in de qPCR. Het kan detecteren zo laag als een paar exemplaren van het genoom van DNA van E. coli O157: H7 zoals weergegeven in figuur 1A. Van de 120 niet-O157 stammen onderzocht, waaronder de zes grote niet-O157 STEC stammen, O104: H4 stammen Salmonella en Shigella stammen werd geen kruisreactiviteit gevonden, zoals weergegeven in Tabel 1.
Combinatie van de PMA behandeling met qPCR
Incubatie E. coli O157: H7 cellen met PMA (50 mM) gedurende 5 min in het donker en het blootstellen aan licht gedurende 2 minuten werden geselecteerd voor PMA behandelingsomstandigheden. Daarnaast hebben we PMA behandeling procedure gewijzigd. Vergeleken met verschillende transparante microbuisjes in de verknopende stap werd een 96-putjesplaat gevonden efficiënter tebereikt de optimale verknopende effect en handiger dan behandeling van een groot aantal monsterbuizen in het licht belichtingsproces.
Amplificatie van DNA van PMA-behandelde levende en dode cellen in qPCR
Het effect van PMA-gemedieerde remming van de amplificatie van DNA van dode cellen op deze qPCR assay werden getoond in figuur 1 met DNA afkomstig van twee seriële 10-voudige levende of dode cel verdunningen. De resultaten tonen dat het gegenereerd uit de levende cellen behandeld met PMA (rode curve) en zonder PMA (blauwe curve) krommen lijken lineaire en bijna gelijk aan elkaar. Geringe CT waardeverschillen werden tussen de levende cellen behandeld met PMA en zonder PMA (figuur 1A), suggereert dat PMA behandeling had weinig effect op amplificatie van DNA van de levende cellen in de qPCR. Maar een 15 - CT waarde verschil (32.000 maal) werd aangetoond tussen de dode cellen behandeld met PMA en zonder PMA, demonstrating dat PMA behandeling effectief onderdrukt versterking van DNA van de dode cellen (Figuur 1B).
Detectie van levende cellen van levende en dode celmengsels in qPCR
Twee sets van levende cellen verdunningen (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU) werden behandeld met PMA of zonder PMA levende cellen te detecteren van levende / dode cellen mengsels. De qPCR resultaten (Figuur 2A) toonde een parallelle inverse geleidelijke ontwikkeling van CT waarden gerelateerd aan het aantal behandelde levende cellen (paarse balken) voor onbehandelde monsters (blauwe staven). De behandelde levende cellen leverde een iets hogere CT waarden dan onbehandelde levende cellen. Een soortgelijke inverse progressieve trend in CT waarden werd waargenomen met de echte aantal levende cellen in het live / dead celmengsels behandeld met PMA (groene balken) en in figuur 2B. Daarnaast is deze neerwaartse trend van CT waarden waswaargenomen met het aantal levende cellen in de mengsels ondanks de aanwezigheid van 106 dode cellen. Deze resultaten toonden aan dat de CT waarden van de levende / dode cellen mengsels vertegenwoordigde het DNA van de levende cellen alleen, terwijl de DNA amplificatie van de dode cellen efficiënt werd onderdrukt door PMA behandeling. Maar, de CT-waarden van levende / dode celmengsels behandeld met PMA werden schommelde en niet aan de levende cellen getallen in de mengsels in figuur 2B (gele balken) weerspiegeld.
Figuur 1. Levende en dode cellen behandeld met PMA of zonder PMA in qPCR assay. (A) Een serie van 10-voudig verdunde levend E. coli O157: H7 cell verdunningen (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU) zijn behandeld PMA dan niet PMA.De CT-waarden geven het gemiddelde CT-waarden van de drie exemplaren in de qPCR assay. (B) Vergelijking van DNA-amplificatie van levende cellen en dode cellen behandeld met PMA en zonder PMA in de q vergelijking qPCR assay. ΔRn verwijst naar een wijziging in intensiteit fluorescentie. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Differentiatie van levende cellen van levende / dode celmengsels door PMA-qPCR Vier sets van 10-voudige verdunningen van celculturen (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU). Werden gemaakt zoals aangegeven. (A) Eerste set celverdunning werd behandeld met PMA, terwijl de tweede celverdunning was of onbehandelde voor DNA-extractie.(B) 8 x 10 6 dode cellen werden gemengd met de derde en vierde reeksen verdunningen cel twee sets van levende / dode cellen mengsels maken aangegeven. Een set van de cel mengsels werd behandeld met PMA en de andere set werd behandeld zonder PMA voor DNA-extractie. Elke staaf stelt de gemiddelde CT waarden van een drievoud experiment ± SD.
| Organisme | Serotype | Aantal geteste stammen |
| E. coli | 2006 spinazie O157: H7 uitbraak isolaten | 186 |
| 2006 Taco Bell O157: H7 isolaten | 58 | |
| 2006 Taco John O157: H7 isolaten | 11 | |
| DMB stam collecties van andere O157: H7 uitbraak | 112 | |
| O104: H4 | 3 | |
| O26 | 18 | |
| O103 | 13 | |
| O111 | 24 | |
| Ø121 | 2 | |
| O45 | 5 | |
| O145 | 9 | |
| O113 | 2 | |
| O91 | 1 | |
| O55 | 9 | |
| Ander | 19 | |
| Salmonella | Typhi | 1 |
| Newport | 2 | |
| Shigella dysenteriae | 6 | 2 |
| Shigella sonnei | Onbekend | 2 |
| Shigella flexneri | 4 | 1 |
| Shigella boydii | 1 | 1 |
| Totaal | 481 | |
Tstaat 1. Stammen ter validatie in real-time PCR voor de identificatie van E. coli O157: H7.
Discussion
Een eerste doel van de studie omvat het gebruik van een ORF Z3276, een unieke E. coli O157: H7, als enige biomarker voor qPCR assay. Op dit moment zijn de meeste qPCR assays gericht virulentie genen, zoals stx1, stx2 en eaeA 1,2,5,6 of gedeelde fenotypische genen, zoals uidA 3,4, rfbE en Flic genen 8,9. Soms een soort of stam kan niet definitief worden geïdentificeerd door de virulentie gen (en), zoals stx 1 en 2 stx genen, zoals genen die aanwezig zijn in verschillende soorten of stammen 16 ook zijn. Met rfbE en flic voor doelgenen worden beide genen nodig zijn voor volledige identificatie 17. Met ORF Z3276 als biomarker is deze qPCR assay aangetoond gevoelige en specifieke test (tabel 1) zijn. Deze test is onderworpen aan strenge inclusiviteit en exclusiviteit tests, waaronder O157: H7 stammen (n = 367), meer dan 100 niet-O157 stammen, en andere pathogene soorten, zoals Salmonella en Shigella. Alle O157: H7 stammen onderzocht werden positief gedetecteerd, en er geen cross-reactiviteit werd gevonden van de niet-O157 stammen (Tabel 1), wat aangeeft dat ORF Z3276 is een uniek en sterk biomarker voor de detectie van E. coli O157: H7.
Het andere doel van de studie is om levende cellen selectief detecteren van dode cellen door PMA behandeling voor DNA-extractie. PMA kan doordringen in de dode cellen met verminderde membraan binden aan DNA en remt dus de DNA amplificatie van dode cellen in PCR 13. We hebben de PMA-behandeling procedure gewijzigd en aangepast aan een 96-well plaat formaat voor de procedure. De juiste lichtintensiteit blootstelling essentieel voor de verknoping effect. Eerder hebben microbuisjes gebruikt in deze stap 13-15. Echter, aparte microtubes zijn moeilijk te hanteren in het licht exling ondervinden stap, en deze buizen zijn niet absoluut transparant zijn voor de beste cross-smaak te verkrijgen. Met een 96-well plaat, verbeterden wij de efficiëntie van PMA-behandeling. Deze veranderingen kunnen de test beïnvloeden op verschillende manieren: ze maken het gemakkelijker een grondige en gelijkmatige verknoping effect te verkrijgen, vooral met talrijke monsters, de behandelde monsters kan worden verplaatst van de ene plaat naar de andere om het mogelijk voor de detectie van grote aantallen monsters en zij bieden deze PMA-qPCR assay automatisering potentieel voor het gehele proces. De beperking van deze PMA-qPCR assay is dat PMA behandeling verhoogt de PCR kosten iets en iets verlaagd de gevoeligheid van PCR.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken het Amerikaanse ministerie van Homeland Security om een deel van de financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | ||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 W Halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
References
- Barletta, F., et al. Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).
- Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).
- Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).
- Li, Y., Mustapha, A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR. J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).
- Schmidt, H., et al. Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes. Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).
- Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).
- Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).
- Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM. J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).
- Fricker, M., Messelhäußer, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).
- Li, B., Chen, J. Q. Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker. Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).
- Perna, N. T., et al. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature. 409, 529-533 (2001).
- Wang, S., Levin, R. E. Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR. J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).
- Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).
- Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide. J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).
- Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).
- Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).
