La vasoconstricción pulmonar hipóxica (HPV) es un fenómeno fisiológico importante por el cual en la perfusión alveolar del pulmón de la hipoxia es emparejada a la ventilación. El segmento vascular principal que contribuye al HPV es la arteria intra-acinar. Aquí, describimos nuestro protocolo para el análisis del VPH de vasos pulmonares murinos con diámetros de 20-100 μm.
La hipoxia alveolar aguda causa vasoconstricción pulmonar (VPH), también conocida como mecanismo de von Euler-Liljestrand, que sirve para hacer coincidir la perfusión pulmonar con la ventilación. Hasta ahora, los mecanismos subyacentes no se entienden completamente. El segmento vascular principal que contribuye al HPV es la arteria intra-acinar. Esta sección del vaso es responsable de la fuente de sangre de un acinus individual, que se define como la porción del pulmón distal a un bronquiolo terminal. Las arterias intraacinares se localizan principalmente en aquella parte del pulmón que no puede ser alcanzada selectivamente por una serie de técnicas comúnmente utilizadas, como la medición de la presión de la arteria pulmonar en pulmones perfundidos aislados o los registros de fuerza de segmentos disecados de la arteria pulmonar proximal disecada1,2. El análisis de vasos subpleurales mediante microscopía de luminiscencia de barrido confocal con láser en tiempo real se limita a vasos con hasta 50 μm de diámetro3.
Proporcionamos una técnica para estudiar el VPH de las arterias intrapulmonares murinas en el rango de 20-100 μm diámetros internos. Se basa en el análisis videomorfométrico de arterias transversales en cortes pulmonares de precisión (PCLS). Este método permite la medición cuantitativa de la vasoreactividad de pequeñas arterias intraacinares con diámetro interno entre 20-40 μm que se encuentran en chorros de septos alveolares junto a conductos alveolares y de arterias pre-acinares más grandes con diámetros internos entre 40-100 μm que discurren adyacentes a bronquios y bronquiolos. En contraste con la proyección de imagen en tiempo real de recipientes subpleurales en ratones anestesiados y ventilados, el análisis videomorfométrico de PCLS ocurre bajo condiciones libres de la tensión del esquilar. En nuestro modelo experimental ambos segmentos arteriales exhiben un VPH monofásico cuando se exponen al medio gaseado con 1%O2 y la respuesta se desvanece después de 30-40 min en la hipoxia.
En la mayoría de los lechos vasculares sistémicos la hipoxia induce vasodilatación, en comparación con la vasoconstricción causada por la hipoxia en la vasculatura pulmonar. Esta respuesta pulmón-específica a la tensión bajada del oxígeno se llama vasoconstricción pulmonar hipóxica (HPV), inicios en cuestión de segundos y reversa rápidamente después del cambio a la ventilación normóxica. Aunque el VPH se conoce desde hace más de 60 años, los sensores celulares de oxígeno y las cascadas de señalización que resultan en vasoconstricción todavía están bajo debate. Existe un amplio consenso relativo de que los cambios redox y ROS evocados por la hipoxia son esenciales para el VPH y el desarrollo de hipertensión pulmonar (revisado en Sylvester et al. 4 y Schumacker et al. 5).Nuestros propios datos apoyan un papel central del complejo II de la cadena respiratoria mitocondrial en el VPH6,7. Recientemente, Wang et al. presentaron un concepto completamente nuevo para la detección de oxígeno y el VPH: En base a sus datos proponen que la hipoxia alveolar es detectada por los capilares adyacentes causando la despolarización de la membrana de las células endoteliales. La respuesta se propaga a través de la conexión 40 uniones gap de las células endoteliales que conducen a la constricción de las células musculares lisas de las arteriolas aguas arriba8.
Las arterias del pulmón corren junto a las vías respiratorias, se ramifican con ellas, disminuyen continuamente de diámetro y, finalmente, suministran sangre al sistema capilar ubicado en las paredes alveolares. Esta circulación arterial se compone de segmentos anatómica y funcionalmente distintos. Las arterias del conducto próximo, caracterizadas por una abundancia de fibras elásticas en las paredes, son seguidas por las arterias intrapulmonares completamente muscularizadas que controlan en gran parte la resistencia vascular pulmonar. Paso a paso, estas arterias transitan en segmentos donde la capa muscular se vuelve incompleta, y finalmente los vasos están libres de células inmunorreactivas de actina del músculo liso. La arteria intra-acinar que alimenta un acinus pulmonar individual con sangre representa un segmento parcialmente muscular6. Asimismo, el sistema arterial pulmonar no representa una estructura uniforme en cuanto a la respuesta hipóxica, pero exhibe una marcada diversidad regional9,10. Por ejemplo, en las arterias pulmonares proximales aisladas de pulmones de rata la hipoxia induce una respuesta bifásica, mostrando una rápida contracción inicial de corta duración que – después de una relajación incompleta – es seguida por una segunda contracción lenta pero sostenida11. En arterias de resistencia aisladas del parénquima pulmonar de rata como cuarta y quinta división de arterias pulmonares (diámetro externo <300 μm), la hipoxia provoca constricción monofásica9. Ya en 1971 Glazier y Murray concluyeron a partir de las mediciones de cambios en la concentración de glóbulos rojos capilares en pulmones de perros ventilados con mezclas de gases hipóxicos que el aumento de la resistencia vascular inducido por la hipoxia se produjo principalmente aguas arriba de los capilares12. Hoy en día, la microscopía intravital de pulmones intactos de ratones anestesiados y ventilados mecánicamente representa una poderosa herramienta para el análisis de la microvasculatura pulmonar13,14. La escisión de una ventana circular en la pared torácica da acceso microscópico a la superficie del pulmón y permite el análisis de vasos pulmonares subpleurales con hasta 50 μm de diámetro. Combinando esta técnica con la infusión de FITC-dextrano, Tabuchi et al. demostró que sólo las arteriolas de tamaño mediano con diámetros de 30-50 μm exhiben una marcada respuesta a la hipoxia que se mantuvo durante un período de 60 min con una atenuación menor después de 30 min. En cambio, las pequeñas arteriolas con diámetros de 20-30 μm mostraron sólo una respuesta menor a la hipoxia3. Sin embargo, esta técnica no permite el análisis de arterias con diámetro superior a 50 μm ya que estos vasos se localizan demasiado profundos en el tejido pulmonar.
Con el fin de cerrar la brecha en el análisis de arterias pulmonares grandes y muy pequeñas (como los vasos subpleurales) de los pulmones murinos, adoptamos un método que fue descrito por Martin et al. para el análisis de la reactividad de las vías respiratorias15. Basado en una técnica de infundir gel de agarosa, facilita la preparación de rebanadas pulmonares cortadas con precisión (PCLS) de este órgano relativamente suave y elástico. Dentro del PCLS la vasoreactividad de arterias transversales con diámetro interior entre 20-100 μm se puede observar directamente por videomicroscopia. La aplicación de fármacos durante la incubación hipóxica del PCLS permite el análisis de sus efectos sobre el VPH. Es de particular importancia que esta técnica también se pueda aplicar a los ratones modificados genéticamente. En función de su ubicación dentro del pulmón, clasificamos las arterias como vasos pre e intra-acinares, con diámetros internos de 20-40 μm y 40-100 μm, respectivamente. Bajo una visión funcional la arteria intra-acinar suministra sangre a un acinus pulmonar individual y la arteria pre-acinar son las secciones precedentes del vaso. La grabación de imágenes en una cámara digital permite la posterior cuantificación de la vasorreacción. Un atributo obvio de este modelo PCLS es la falta de cizalladura que actúa sobre el endotelio. Por el contrario, en los vasos perfundidos el VPH agudo conduce a un aumento de la cizalladura-estrés, lo que induce mecanismos secundarios como la liberación de NO16. Además, el uso de PCLS permite mediciones del VPH sin influencias neuronales u hormonales extrapulmonares. En contraste con los sistemas de cultivo celular, por ejemplo preparados a partir de células musculares lisas arteriales pulmonares caninas17,la arquitectura histológica de la pared del vaso se conserva casi por completo.
En resumen, este protocolo proporciona un método útil para el análisis de posibles sensores moleculares de oxígeno y/o vías celulares responsables del VPH de arterias intrapulmonares con diámetros internos entre 20-100 μm en condiciones libres de estrés cizallallado.
El pulmón de ratón ventilado y perfundido aislado es un excelente modelo para el análisis de la respuesta fisiológica del sistema vascular pulmonar sobre los cambios en el suministro de oxígeno y entre otros permite la medición continua de la presión arterial pulmonar1. Sin embargo, este modelo no permite la identificación y el análisis de aquellos segmentos vasculares que muestran la respuesta más fuerte a la hipoxia. Esta es la ventaja de nuestro análisis videomorfométrico de PCLS que facilita la medición del VPH de arterias individuales con diámetros internos de 20-100 μm. Los PCLS representan un modelo in vitro atractivo ya que se asemejan mucho al órgano a partir del cual se preparan. En contraste con los sistemas de cultivo celular, todos los tipos de células están presentes en su configuración original de matriz de tejido. Además, un pulmón es suficiente para la preparación de muchos PCLS, de modo que al menos parcialmente los experimentos se puedan estandarizar mediante el uso de secciones del mismo ratón. De acuerdo con el concepto 3R (reducción, refinamiento y reemplazo de animales de laboratorio en las ciencias de la vida) de Russell y Burch23 este hecho también aboga por el uso de PCLS.
Sin embargo, uno tiene que tener en cuenta, que el tejido se daña por el corte con un vibratome y señalización longitudinal, por ejemplo, a través de las células endoteliales según lo postulado por Kübler et al. 14 ya no es posible.
Inicialmente, los PCLS se aplicaron principalmente para estudios bioquímicos, farmacológicos y toxicológicos, pero mientras tanto también se utilizan para la medición de la contractilidad bronquial, la función mucociliar y las respuestas vasculares (para las revisiones, consulte Sanderson20 y Davies21). Held et al. Se ha realizado un estudio en el que se compararon los modelos de pulmón de ratón perfundido y ventilado aislado y de PCLS24. Encontraron mediante el análisis de las respuestas de las vías respiratorias y los vasos pulmonares a una variedad de mediadores endógenos que las características importantes de todo el pulmón se mantuvieron en pcls.
En PCLS, las condiciones hipóxicas no se establecen vía las vías aéreas como en el pulmón intacto sino por la incubación de la sección del pulmón en medio hipóxico-gaseado. Se ha analizado la presión parcial de oxígeno (pO2)del medio pregasado con 1%O2,5,3%CO2,93,7%N2 y con 21%O2,5,3%CO2,73,7%N2,respectivamente, utilizando un analizador de gases en sangre. Inmediatamente antes de alimentarlo en la cámara de perfusión, el pO2 del MEM gaseado hipóxico fue de 40 mmHg y el del medio gaseado normóxico de 160 mmHg6. En el pulmón intacto el VPH se induce cuando el pO alveolar2 cae por debajo de 50 mmHg25,una situación que obviamente puede ser imitada por la aplicación de medio hipóxico-gaseado. Nuestros datos sobre la extensión del VPH coinciden bien con los resultados obtenidos con un enfoque experimental diferente. Yamaguchi et al. se han aplicado pulmones aislados de rata para examinar microvasos con diámetro de 20-30 μm mediante microscopía de luminiscencia de barrido láser confocal en tiempo real acoplada a una cámara de alta sensibilidad con un intensificador de imagen10. Observaron una reducción media del diámetro de 2,7 μm después de la exposición de los pulmones a la hipoxia. Se puede calcular que una reducción del 20% del área luminal tal como la medimos en nuestro sistema corresponde a una disminución de aproximadamente el 15% en el diámetro.
En nuestros experimentos hemos clasificado las arterias como vasos pre- e intra-acinares, respectivamente, con diámetros internos de 40-100 μm y 20-40 μm. En los seres humanos la transición de arterias musculares a nomusculares se produce en el rango de diámetro de 70-100 μm. En ratones, las células musculares lisas están presentes hasta un diámetro externo de 20 μm26. Por esta razón no es posible analizar arterias con diámetros inferiores a 20 μm ya que no pueden ser identificadas de manera confiable en base a la imagen de contraste de fase. En el otro extremo de la escala, los vasos con diámetros superiores a 100 μm difícilmente se encuentran en pcls y comúnmente despojados del tejido circundante.
En realidad, un número de candidatos moleculares se discuten como sensores de oxígeno molecular o como componente de la cascada de señalización que resulta en el VPH (para una revisión ver Sylvester et al. 4). Una vez que los ratones knockout apropiados están disponibles, la videomorfometría se puede utilizar para el análisis de la vasoreactividad de las arterias pre e intra-acinares en comparación con los animales de tipo salvaje. Sin embargo, PCLS también se han utilizado para otros problemas: Faro et al. los empleó para caracterizar el desarrollo de la dilatación dependiente del endotelio en pulmón después del nacimiento29 y pcls preparados de conejillos de Indias expuestos al humo o al aire diariamente por 2 semanas fueron utilizados para demostrar el impacto del humo del cigarrillo en vasoreactivity vía la inducción de la disfunción endotelial30.
Pasos críticos dentro del protocolo
En nuestros experimentos clasificamos las arterias como pre-acinar (diámetros internos de 40-100 μm) e intra-acinar (diámetros internos de 20-40 μm). Especialmente para la preparación de secciones pulmonares que deben utilizarse para el análisis de vasos más grandes, es importante agregar nitroprusiato de sodio al tampón de perfusión. Este medicamento previene la contracción de los vasos durante la preparación de la muestra y, por lo tanto, su estafa del tejido circundante que conduce a la vasodilatación incompleta. El nitroprusiato de sodio en el tampón de perfusión no es tan importante para la preparación de la sección pulmonar que debe utilizarse para el análisis de pequeñas arterias porque están fuertemente ancladas a los septos alveolares.
Todos los experimentos deben iniciarse con incubaciones en las que se pruebe la reactividad de las arterias. Raramente, obtuvimos las preparaciones del pulmón en las cuales no hay respuesta de recipientes a los contratistas o a los dilatadores perceptible. No sabemos la razón de esto: Puede ser que el volumen de la agarosa llenada en los pulmones era demasiado grande o demasiado bajo de modo que el corte del órgano en PCLS no fuera óptimo. Alternativamente, es imaginable que la agarosa se enfriaba demasiado rápido durante el procedimiento de instilación, lo que resultaba en una tensión de cizalladura perjudicial. En caso de que en un PCLS individual ninguna arteria viable sea detectable, la sección tiene que ser desechada y reemplazada por otra.
La decisión sobre la viabilidad de una arteria se tomó en base a la respuesta a U46619. La aplicación de U46619 a una concentración de 0,1 μM induce una vasoconstricción que – después de algún ejercicio – es visible directamente en la secuencia de imágenes en la pantalla. Puesto que hay algunas varianzas en la vasoreactividad investigamos el impacto de una droga en HPV midiendo el vasoresponse en las secciones del pulmón expuestas a la droga o al medio solamente a su vez.
El VPH de una arteria individual a menudo es difícilmente detectable en el microscopio, y en promedio resulta en una reducción del área luminal de aproximadamente 20-30%. Sin embargo, los pequeños cambios en el diámetro de una arteria tienen una entrada distinta en la resistencia al flujo. Según la ecuación “R = 1/r4″con R=resistencia y r=radio, la resistencia del flujo es inversamente proporcional a la cuarta potencia del radio. Permítanme dar un ejemplo: Una “arteria ideal” que exhibe una sección transversal circular con un diámetro de 40 μm (r = 20 μm) tiene un área luminal de aproximadamente 1,260 μm2. Cuando el área luminal se reduce en un 20%, podemos calcular que el diámetro del vaso se reduce en un 10,5% a 35,8 μm (r=17,9 μm). De acuerdo con la ecuación dada anteriormente, la resistencia al flujo de este recipiente aumentaría de 6.25 x 10-6 a 9.71 x 10-6, es decir, en aproximadamente un 55%. En caso de una reducción del área luminal en un 30% el radio disminuiría en aproximadamente un 16%, pero la resistencia al flujo aumentaría en aproximadamente un 100%. Aunque estos cálculos son una simplificación excesiva en la que se supone un flujo sanguíneo laminar y una forma de vaso de una tubería rígida, es sugestivo del impacto de cambios ya menores del diámetro en la resistencia al flujo.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación está patrocinada por el Clúster excelencia del Sistema Cardiopulmonar.
Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
Various scissors and forceps | |||
Sewing cotton | |||
2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |