Hypoxic pulmonell vasoconstriction (HPV) är ett viktigt fysiologiskt fenomen genom vilket vid alveolar hypoxi lungperfusion matchas med ventilation. Det stora kärlsegmentet som bidrar till HPV är intraacinär artär. Här beskriver vi vårt protokoll för analys av HPV av murinpulmonellkärl med diametrar på 20-100 μm.
Akut alveolär hypoxi orsakar lungvasokonstriktning (HPV) – även känd som von Euler-Liljestrand-mekanismen – som tjänar till att matcha lungperfusion med ventilation. Hittills har de underliggande mekanismerna inte förståtts fullt ut. Det stora kärlsegmentet som bidrar till HPV är intraacinär artär. Denna kärlsektion är ansvarig för blodtillförseln av en enskild acinus, som definieras som den del av lungdetal till en terminal bronkiol. Intraacinära artärer finns till största delen av den del av lungan som inte selektivt kan uppnås med ett antal vanliga tekniker såsom mätning av lungartärtrycket i isolerade perfunderade lungor eller kraftinspelningar från dissekerade proximala lungartärsegment1,2. Analysen av subpleurala kärl genom konfokal laserskanning i realtid är begränsad till fartyg med upp till 50 μm i diameter3.
Vi tillhandahåller en teknik för att studera HPV av murin intra-pulmonell artärer i intervallet 20-100 μm inre diametrar. Det är baserat på videomorfetrisk analys av tvärsnittsartärer i precisionsskurna lungskivor (PCLS). Denna metod möjliggör kvantitativ mätning av vasoreaktivitet hos små intraacinära artärer med innerdiameter mellan 20-40 μm som är belägna vid grener av alveolar septa bredvid alveolära kanaler och av större preacinära artärer med innerdiametrar mellan 40-100 μm som löper intill bronkier och bronkioler. I motsats till realtidsavbildning av subpleurala kärl hos bedövade och ventilerade möss sker videomorfetrisk analys av PCLS under förhållanden fria från savspänning. I vår experimentella modell uppvisar båda kranskärlens segment en monofasisk HPV när de utsätts för medium gasas med 1% O2 och svaret bleknar efter 30-40 min vid hypoxi.
I de flesta systemiska vaskulär sängar hypoxi inducerar vasodilatation, i jämförelse med vasoconstriction orsakas av hypoxi i pulmonell vaskulatur. Detta lungspecifika svar på sänkt syrespänning kallas hypoxisk lungvasokonstriktions (HPV), insets inom några sekunder och vänder snabbt efter återgång till normoxisk ventilation. Även om HPV är känt i mer än 60 år, diskuteras fortfarande cellulära syresensorer och signalkaskader som resulterar i vasokonstriktions. Det finns en relativt bred konsensus att hypoxi-framkallade redox och ROS förändringar är väsentliga för HPV och utvecklingen av pulmonell hypertoni (ses över i Sylvester et al. 4 och Schumacker et al. 5). Våra egna data stöder en central roll av komplexa II av mitokondriell andningskedja i HPV6,7. Nyligen, Wang et al. presenteras ett helt nytt koncept för syreavkänning och HPV: Baserat på deras data föreslår de att alveolar hypoxi avkäns av angränsande kapillärer orsakar membran depolarization av endotelcellerna. Svaret sprids via connexion 40 gap korsningar av endotelceller som leder till förträngning av glatt muskelceller i uppströms arterioles8.
Artärerna i lungan löper längs luftvägarna, förgrenar sig med dem, minskar kontinuerligt i diameter och levererar slutligen blod till kapillärsystemet som ligger i de alveolära väggarna. Denna kranskärlscirkulation består av anatomiskt och funktionellt distinkta segment. De proximala ledningsartärerna, kännetecknade av ett överflöd av elastiska fibrer i väggarna, följs av helt muskulösa intra-pulmonella artärer som till stor del kontrollerar lungvaskulär resistens. Steg för steg passerar dessa artärer in i segment där muskelskiktet blir ofullständigt, och slutligen är kärlen fria från smidiga muskelaktiva-immunreaktiva celler. Intraacinar gatan matar en individuell pulmonell acinus med blod representerar ett delvis muskulöst segment6. På samma sätt representerar lungartärsystemet inte en enhetlig struktur när det gäller det hypoxiska svaret utan uppvisar markerad regional mångfald9,10. Till exempel, i proximala lungartärer isolerade från råtta lungor hypoxi inducerar ett bifasiskt svar, visar en första snabb sammandragning av kort varaktighet som – efter ofullständig avslappning – följs av en andra långsam men ihållande sammandragning11. I resistens artärer isolerade från råtta lung parenkym som fjärde och femte uppdelningen av pulmonell artärer (yttre diameter <300 μm), hypoxi orsakar monofasisk förträngning9. Redan 1971 avslutade Glazier och Murray mätningar av förändringar i den kapillärröda blodcellskoncentrationen i lungor hos hundar ventilerade med hypoxiska gasblandningar att den hypoxiinducerade ökningen av kärlresistens huvudsakligen inträffade uppströms kapillärerna12. Numera representerar intravital mikroskopi av intakta lungor av sövda och mekaniskt ventilerade möss ett kraftfullt verktyg för analys av lungmikrovaskulaturen13,14. Excision av ett cirkulärt fönster i bröstväggen ger mikroskopisk tillgång till lungytan och möjliggör analys av subpleurala lungkärl med upp till 50 μm i diameter. Genom att kombinera denna teknik med infusionen av FITC-dextran, Tabuchi et al. visat att endast medelstora arterioler med diametrar på 30-50 μm uppvisar ett markant svar på hypoxi som upprätthölls under en period av 60 min med en mindre dämpning efter 30 min. Däremot visade små arterioler med diametrar på 20-30 μm endast ett mindre svar på hypoxi3. Denna teknik tillåter dock inte analys av artärer med en diameter större än 50 μm eftersom dessa kärl ligger för djupt i lungvävnaden.
För att överbrygga klyftan i analysen av stora och mycket små lungartärer (såsom subpleurala kärl) av murin lungor, antog vi en metod som beskrevs av Martin et al. för analys av luftvägarnas reaktivitet15. Baserat på en agarose gel ingjutning teknik, underlättar det beredningen av precisionsskurna lungskivor (PCLS) från detta relativt mjuka och elastiska organ. Inom PCLS vasoreactivity av tvärsnittsartärer med innerdiameter mellan 20-100 μm kan observeras direkt genom videomikroskopi. Applicering av läkemedel under hypoxic inkubation av PCLS gör det möjligt att analysera deras effekter på HPV. Det är särskilt viktigt att denna teknik också kan tillämpas på genetiskt konstruerade musar. Baserat på deras placering i lungan klassificerar vi artärerna som pre- och intraacinära kärl, med innerdiametrar på 20-40 μm respektive 40-100 μm. Under en funktionell vy förser intraacinarartären en individuell lungacinus med blod och preacinarartären är de föregående kärlsektionerna. Inspelning av bilder på en digitalkamera möjliggör efterföljande kvantifiering av vasoreaction. En uppenbar egenskap hos denna PCLS-modell är bristen på savstress som verkar på endotel. I perfunderade kärl leder däremot akut HPV till en ökning av saxstress och leder därmed till sekundära mekanismer som NO release16. Dessutom tillåter användningen av PCLS mätningar av HPV utan extrapulmonell neural eller hormonella influenser. I motsats till cellkultursystem, till exempel beredda från hund pulmonell arteriell glattmuskelceller 17, är den histologiska arkitekturen i kärlväggen nästan helt bevarad.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll en användbar metod för analys av potentiella molekylära syresensorer och/eller cellulära vägar som ansvarar för HPV av intrapulmonella artärer med innerdiametrar mellan 20-100 μm under förhållanden fria från savspänning.
Den isolerade ventilerade och perfunderade muslungan är en utmärkt modell för analys av det fysiologiska svaret från lungvaskulära systemet på förändringar i syretillförseln och tillåter bland annat kontinuerlig mätning av lungartärtrycket1. Denna modell tillåter dock inte identifiering och analys av de kärlsegment som visar det starkaste svaret på hypoxi. Detta är fördelen med vår videomorfometriska analys av PCLS som underlättar mätningen av HPV av enskilda artärer med innerdiametrar på 20-100 μm. PCLS representerar en attraktiv in vitro-modell eftersom de liknar det organ från vilket de är beredda. I motsats till cellkultursystem finns alla celltyper i sin ursprungliga vävnadsmatriskonfiguration. Dessutom är en lunga tillräcklig för beredning av många PCLS, så att åtminstone delvis experiment kan standardiseras med hjälp av avsnitt från samma mus. Enligt 3R-konceptet (minskning, förfining och ersättning av laboratoriedjur i biovetenskaperna) i Russell och Burch23 argumenterar detta faktum också för användningen av PCLS.
Man måste dock komma ihåg att vävnaden skadas genom skärning med en vibratome och longitudinell signalering till exempel via endotelcellerna som postuleras av Kübler et al. 14 är inte längre möjligt.
Ursprungligen tillämpades PCLS främst för biokemiska, farmakologiska och toxikologiska studier, men under tiden används de också för mätning av bronkial kontraktilitet, mucociliary funktion och vaskulär svar (för recensioner se Sanderson20 och Davies21). Hålls et al. har utfört en studie där de jämförde modellerna av isolerad perfused och ventilerad mus lunga och PCLS24. De fann genom analys av svaren från luftvägarna och lungkärl på en mängd endogena medlare att viktiga egenskaper hos hela lungan bibehölls i PCLS.
I PCLS, hypoxic villkor fastställs inte via luftvägarna som i intakta lungan men genom inkubation av lungsektionen i hypoxic-gassed medium. Vi har analyserat syret partiellt tryck (pO2)av medium förgasat med 1% O2,5,3% CO2,93,7% N2 och med 21% O2,5,3% CO2,73,7% N2,respektive med hjälp av en blodgasanalysator. Omedelbart innan du matar in den i perfusionskammaren var pO2 av hypoxic gassed MEM 40 mmHg och den av det normoxiska gasade mediet 160 mmHg6. I den intakta lungan framkallas HPV när alveolar pO2 sjunker under 50 mmHg25, en situation som uppenbarligen kan efterliknas genom applicering av hypoxic-gassed medium. Våra data om omfattningen av HPV matchar väl till resultat som erhållits med ett annat experimentellt tillvägagångssätt. Yamaguchi et al. har applicerat isolerade råttlungor för att undersöka mikrovessuler med diametern 20-30 μm genom konfokal laserskanningsluminglassmikroskopi i realtid i kombination med en högkänslig kamera med en bildförstärkare10. De observerade en genomsnittlig minskning av diametern på 2,7 μm efter exponering av lungorna för hypoxi. Man kan beräkna att en 20% minskning av luminalområdet som vi mäter det i vårt system motsvarar cirka 15% minskning av diametern.
I våra experiment har vi klassificerat artärerna som pre- respektive intraacinära kärl med innerdiametrar på 40-100 μm respektive 20-40 μm. Hos människor sker övergången från muskulösa till ickemuskulära artärer i diameterområdet 70-100 μm. Hos möss finns släta muskelceller ner till en yttre diameter på 20 μm26. Av denna anledning är det inte möjligt att analysera artärer med diametrar under 20 μm eftersom de inte kan identifieras baserat på faskontrastbilden. I andra änden av skalan är kärl med diametrar över 100 μm knappast att hitta i PCLS och ofta avskalade från den omgivande vävnaden.
Egentligen diskuteras ett antal molekylära kandidater som molekylära syresensorer eller som komponent i signalkaskaden vilket resulterar i HPV (för en översyn se Sylvester et al. 4). När lämpliga knockoutmöss finns tillgängliga kan videomorfmetri användas för analys av vasoreaktivitet hos pre- och intraacinära artärer jämfört med vilda djur. PCLS har dock också använts för andra problem: Faro et al. använde dem för att karakterisera utvecklingen av endotelberoende utvidgning i lunganefter födseln 29 och PCLS beredda från marsvin som exponerats för rök eller luft dagligen i 2 veckor användes för att visa cigarettrökens inverkan på vasoreaktivitet via induktion av endoteldysfunktion30.
Kritiska steg i protokollet
I våra experiment klassificerade vi artärerna som preacinar (innerdiametrar på 40-100 μm) och intraacinar (innerdiametrar på 20-40 μm). Speciellt för beredning av lungsektioner som bör användas för analys av större kärl är det viktigt att tillsätta natriumnityr på perfusionsbufferten. Detta läkemedel förhindrar sammandragning av kärlen under provberedningen och därmed deras rip off från den omgivande vävnaden vilket leder till ofullständig vasodilatation. Natriumnityr i perfusionsbufferten är inte så viktigt för beredningen av lungsektionen som bör användas för analys av små artärer eftersom de är starkt förankrade i den alveolära septan.
Alla experiment bör startas med inkubationer där artärernas reaktivitet testas. Sällan fick vi lungpreparat där inget svar från fartyg till entreprenörer eller dilatatorer kunde upptäckas. Vi vet inte orsaken till detta: Kan vara att volymen av agaros som fylldes i lungorna var för stor eller för låg så att skärning av organet i PCLS inte var optimal. Alternativt är det tänkbart att agarosen kyldes ner för snabbt under instillationsproceduren vilket resulterade i skadlig saxstress. Om ingen livskraftig artär kan upptäckas i en enskild PCLS måste avsnittet kasseras och ersättas av en annan.
Beslutet om en artärs livskraft fattades baserat på svaret på U46619. Applicering av U46619 vid en koncentration av 0,1 μM inducerar en vasokonstriktions som – efter viss träning – är synlig direkt i bildsekvensen på skärmen. Eftersom det finns vissa avvikelser i vasoreaktiviteten undersöker vi effekten av ett läkemedel på HPV genom att mäta vasoresponsen i lungsektioner som exponeras för läkemedlet eller enbart för mediet i sin tur.
HPV av en enskild artär är ofta knappast detekterbar i mikroskopet, och i genomsnitt resulterar det i en minskning av luminalområdet på ca 20-30%. Små förändringar i diametern på en artär har dock en distinkt ingång på flödesmotståndet. Enligt ekvationen “R = 1/r4” med R=motstånd och r=radie är flödesmotståndet omvänt proportionellt mot radiens fjärde effekt. Låt mig ge ett exempel: En “idealisk artär” som uppvisar ett cirkulärt tvärsnitt med en diameter på 40 μm (r=20 μm) har en luminal yta på ca 1 260 μm2. När luminalområdet minskas med 20%, kan vi beräkna att kärlets diameter minskas med 10,5% till 35,8 μm (r =17,9 μm). Enligt ekvationen ovan skulle flödesmotståndet för detta fartyg öka från 6,25 x 10-6 till 9,71 x 10-6 som är med cirka 55%. Vid en minskning av luminalområdet med 30% skulle radien minska med cirka 16%, men flödesmotståndet skulle öka med cirka 100%. Även om dessa beräkningar är en överimplementering där ett laminärt blodflöde och en kärlform av ett styvt rör antas det vara suggestivt av effekten av redan mindre förändringar av diametern på flödesbeständigheten.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning sponsras av Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System.
Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
Various scissors and forceps | |||
Sewing cotton | |||
2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |