Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

تجميد الخلايا البشرية ES

doi: 10.3791/50 Published: October 12, 2006

Summary

نحن هنا لشرح كيفية مختبرنا يتجمد الأشكال الجذعية الجنينية خطوط الخلايا البشرية.

Abstract

نحن هنا لشرح كيفية مختبرنا يتجمد الأشكال الجذعية الجنينية خطوط الخلايا البشرية. يتم غسلها وصحية ، والثقافة ، بشكل كبير ، مع التوسع في برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا وسائل الاعلام التي يمكن أن يشفي إلا رد فعل التربسين. ثم يتم إضافة تحسنت 0.05 ٪ التربسين - EDTA لتغطية الخلايا ، وسمح لوحة لاحتضان لمدة تصل إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ويمكن خلال هذا الوقت لوحظ أن الخلايا التقريب ، ومستعمرات رفع قبالة سطح اللوحة. وسوف تتكرر لطيف pipetting إزالة الخلايا والمستعمرات من سطح اللوحة. وتوضع الخلايا في Trypsinized أنبوب مخروطي القياسية التي تتضمن وسائل الاعلام قبل تحسنت الخلية HES لإرواء التربسين المتبقية ، ونسج ذلك الحين. معلق الخلايا هي وسائط النمو في تركيز حوالي مليون الخلايا في واحد مل من وسائل الإعلام ، والتركيز مثل أن أحد قسامة المجمدة تكفي لإحياء ثقافة على طبق من 10cm. بعد بشكل كاف معلق الخلايا ، يتم إضافة وسائل الاعلام الجليد تجميد الباردة في حجم متساوية. تختلط الايقاف الخلية بدقة ، aliquoted الى تجميد قارورة ، وسمح لتجميد ببطء إلى 80C على مدى 24 ساعة. يمكن تجميد الخلايا ثم انتقلت إلى مرحلة بخار النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل ، أو البقاء في -80 لنحو ستة أشهر.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
  1. يتم غسلها وصحية ، والثقافة ، بشكل كبير ، مع التوسع في برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا وسائل الاعلام التي يمكن أن يشفي إلا رد فعل التربسين.
  2. ثم يتم إضافة تحسنت 0.05 ٪ التربسين - EDTA لتغطية الخلايا ، وسمح لوحة لاحتضان لمدة تصل إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ويمكن خلال هذا الوقت لوحظ أن الخلايا التقريب ، ومستعمرات رفع قبالة سطح اللوحة.
  3. وسوف تتكرر لطيف pipetting إزالة الخلايا والمستعمرات من سطح اللوحة.
  4. وتوضع الخلايا في Trypsinized أنبوب مخروطي القياسية التي تتضمن وسائل الاعلام قبل تحسنت الخلية HES لإرواء التربسين المتبقية ، ونسج ذلك الحين.
  5. معلق الخلايا هي وسائط النمو في تركيز حوالي مليون الخلايا في واحد مل من وسائل الإعلام.
  6. بعد بشكل كاف معلق الخلايا ، يتم إضافة وسائل الإعلام تجمد الجليد الباردة في حجم متساوية.
  7. تختلط الايقاف الخلية بدقة ، aliquoted الى تجميد قارورة ، وسمح لتجميد ببطء إلى 80C على مدى 24 ساعة.
  8. يمكن تجميد الخلايا ثم انتقلت إلى مرحلة بخار النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل ، أو البقاء في -80 لنحو ستة أشهر.

ملاحظة : هذه قسامة المجمدة عند تركيز من 106 خلية / مل يكفي لإحياء ثقافة على طبق من 10cm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تقنية وصفنا لتجميد خطوط الخلايا الأشكال يعمل بشكل جيد لتخزين بكفاءة وإحياء خطوط الخلايا الأشكال وأيضا أي خلايا الثدييات في المصالح. تجميد نسبة صغيرة من الخلايا في كل مرور اعتبار مهم عند العمل مع خطوط الخلايا HES ، وشذوذ النمط النووي يمكن أن تنشأ خلايا غير طبيعية ويمكن أن تتخذ بسرعة أكثر من خط. وهكذا ، بعد أن جمدت انشقاقات في كل مرور بالإضافة إلى المصارف الكبيرة في بعض المقاطع غير مرغوب فيه للغاية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
HuES Medium medium For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium medium 80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.
تجميد الخلايا البشرية ES
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).More

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter