Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Zamrażanie komórek ES człowieka

doi: 10.3791/50 Published: October 12, 2006

Summary

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium zawiesza barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych.

Abstract

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium zawiesza barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych. Zdrowa, gwałtownie rozwijającej się kulturze jest przemywano PBS w celu usunięcia resztek mediów, które mogłyby zaspokoić Trypsyna reakcji. Ocieplane 0,05% trypsyny-EDTA dodaje się następnie na pokrycie komórek, a płyta pozostawiono do inkubacji przez 5 min w temperaturze pokojowej. W tym czasie komórki można zaobserwować zaokrąglania, i kolonie podnoszenia z powierzchni płyty. Delikatne powtarzane pipetowania usunie komórek i kolonie z powierzchni płyty. Trypsyny komórki są umieszczane w standardowej rury stożkowej zawierającej ogrzana mediów HES komórki, aby ugasić trypsyny pozostałych, a następnie obrócił. Komórki zawieszano mediów wzrost w stężeniu około miliona komórek w jednym ml mediów, takim stężeniu, że zamrożone porcji wystarcza do wskrzeszenia kultury na talerz 10cm. Po komórek są odpowiednio zawiesza, lodem mediów zamrażania dodaje się równą objętością. Zawiesin komórkowych są dokładnie wymieszać, dzielić na równe objętości do zamrożenia fiolki i mogą powoli zamarznąć na-80C w ciągu 24 godzin. Zamrożone komórki można następnie przeniósł się do fazy gazowej ciekłego azotu do długotrwałego przechowywania, lub pozostać w temperaturze -80 do około sześciu miesięcy.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
  1. Zdrowa, gwałtownie rozwijającej się kulturze jest przemywano PBS w celu usunięcia resztek mediów, które mogłyby zaspokoić Trypsyna reakcji.
  2. Ocieplane 0,05% trypsyny-EDTA dodaje się następnie na pokrycie komórek, a płyta pozostawiono do inkubacji przez 5 min w temperaturze pokojowej. W tym czasie komórki można zaobserwować zaokrąglania, i kolonie podnoszenia z powierzchni płyty.
  3. Delikatne powtarzane pipetowania usunie komórek i kolonie z powierzchni płyty.
  4. Trypsyny komórki są umieszczane w standardowej rury stożkowej zawierającej ogrzana mediów HES komórki, aby ugasić trypsyny pozostałych, a następnie obrócił.
  5. Komórki zawieszano mediów wzrost w stężeniu około miliona komórek w jednym ml mediów.
  6. Po komórek są odpowiednio zawiesza, lodem mediów Zamrażanie jest dodana w równej objętości.
  7. Zawiesin komórkowych są dokładnie wymieszać, dzielić na równe objętości do zamrożenia fiolki i mogą powoli zamarznąć na-80C w ciągu 24 godzin.
  8. Zamrożone komórki można następnie przeniósł się do fazy gazowej ciekłego azotu do długotrwałego przechowywania, lub pozostać w temperaturze -80 do około sześciu miesięcy.

Uwaga: takie zamrożone porcji w stężeniu 106 komórek / ml jest wystarczający do wskrzeszenia kultury na talerz 10cm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Technika opiszemy na zamrożenie barwy linii komórkowych działa dobrze dla efektywnego przechowywania i przebudziła barwy linii komórkowych, a także wszelkie komórek ssaków interesów. Zamrażanie niewielki odsetek komórek w każdym fragmencie jest ważnym czynnikiem podczas pracy z linii HES komórek, jak zaburzenia kariotypu może powstać i nieprawidłowych komórek, mogą szybko przejąć linię. Tak więc, zamrożone dzieli na każdym fragmencie Oprócz dużych banków w niektórych fragmentach jest wysoce pożądane.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
HuES Medium medium For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium medium 80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.
Zamrażanie komórek ES człowieka
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).More

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter