Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Замораживание клеток человека ES

doi: 10.3791/50 Published: October 12, 2006

Summary

Здесь показано, как в нашей лаборатории замерзает оттенки человеческих линий стволовых эмбриональных клеток.

Abstract

Здесь показано, как в нашей лаборатории замерзает оттенки человеческих линий стволовых эмбриональных клеток. Здоровый, экспоненциально расширяется культуры промывают PBS для удаления остатков средств массовой информации, которые могли бы утолить Трипсин реакции. Утепленные 0,05% трипсина-EDTA затем добавляется для покрытия клетки, и пластины инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. За это время клетки можно наблюдать округления, и колонии отрывая поверхности пластины. Нежный повторяется пипетирования удалит клеток и колоний от поверхности пластины. Трипсином клетки помещаются в стандартные коническую трубку с подогретого СМИ ЭСК ячейки погасить оставшиеся трипсина, а затем нити. Клетки ресуспендировали питательной среды в концентрации примерно один миллион клеток в одном мл среды, концентрации, что один замороженный аликвоту достаточно возродить культуру на 10 см тарелку. После клетки адекватно ресуспендировали, ледяной СМИ замораживания добавляют в равном объеме. Сотовые суспензии тщательно перемешать, аликвоты в замораживании флаконы, и позволили, чтобы медленно заморозить до-80С в течение 24 часов. Замороженные клетки могут затем переехал в паровой фазе жидкого азота для длительного хранения, или остаться при -80 в течение примерно шести месяцев.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
  1. Здоровый, экспоненциально расширяется культуры промывают PBS для удаления остатков средств массовой информации, которые могли бы утолить Трипсин реакции.
  2. Утепленные 0,05% трипсина-EDTA затем добавляется для покрытия клетки, и пластины инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. За это время клетки можно наблюдать округления, и колонии отрывая поверхности пластины.
  3. Нежный повторяется пипетирования удалит клеток и колоний от поверхности пластины.
  4. Трипсином клетки помещаются в стандартные коническую трубку с подогретого СМИ ЭСК ячейки погасить оставшиеся трипсина, а затем нити.
  5. Клетки ресуспендировали питательной среды в концентрации примерно один миллион клеток в одном мл среды.
  6. После клетки адекватно ресуспендировали, ледяной СМИ Замораживание добавляют в равном объеме.
  7. Сотовые суспензии тщательно перемешать, аликвоты в замораживании флаконы, и позволили, чтобы медленно заморозить до-80С в течение 24 часов.
  8. Замороженные клетки могут затем переехал в паровой фазе жидкого азота для длительного хранения, или остаться при -80 в течение примерно шести месяцев.

Примечание: такие замороженные аликвоты в концентрации 106 клеток / мл достаточно, чтобы возродить культуру на 10 см тарелку.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Техника мы описываем для замораживания ячейки оттенков линий хорошо работает для эффективного хранения и воскрешения оттенков клеточных линий, а также любые клетка млекопитающего интересов. Замораживание небольшая часть клеток при каждом прохождении является важным фактором при работе с линии ЭСК клетки, как нарушения кариотипа могут возникнуть и аномальных клеток может быстро взять на линии. Таким образом, заморозив расщепляется в каждый отрывок, в дополнение к крупным банкам на некоторые места в высшей степени желательно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
HuES Medium medium For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium medium 80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.
Замораживание клеток человека ES
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).More

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter