De ontwikkeling van de zebravis kan over dagen met licht blad microscopie wanneer embryo's zijn ingebed in optisch heldere polymeer buizen met een lage concentratie agarose worden gevolgd.
Licht blad microscopie is het ideale beeldvormingstechniek om zebravis embryonale ontwikkeling te bestuderen. Vanwege minimale foto-toxiciteit en bleken, is het bijzonder geschikt voor langdurige time-lapse imaging gedurende vele uren tot enkele dagen. Echter, een geschikt monster montage strategie vereist dat zowel opsluiting en normale ontwikkeling van het monster biedt. Multilayer montage, een nieuwe inbedding techniek met behulp van lage-concentratie agarose in optisch heldere buizen, overwint nu deze beperking en ontketent het volledige potentieel van licht plaat microscopie voor real-time ontwikkelingsbiologie.
Om de complexe gebeurtenissen en interacties tijdens de embryogenese begrijpen, onderzoek in de ontwikkelingsbiologie is meer en meer het verplaatsen van microscopie van enkele cellen en organen in vivo beeldvorming van hele organismen. Traditionele microscopische technieken meestal niet de ruimtelijke en temporele resolutie over een lange periode van tijd te volgen snelle gebeurtenissen hebben vaak bleken of fototoxische effecten in het monster 1 te veroorzaken. Wij en anderen hebben gevonden lichtwaaier microscopie (figuur 1) om de ideale techniek voor in vivo beeldvorming van zebravis 2-4 zijn. De verlichting van het monster met een dun vel van laserlicht, loodrecht op de detectie as, biedt een snelle optische sectie met een hoge ruimtelijke resolutie en geminimaliseerd foto-toxiciteit 5. Tegelijkertijd, als gevolg van deze unieke optische opstelling traditionele monster montagetechnieken middels Petrischalen of cultuur kamers zijn niet geschikt. In een typisch lichtsheet microscoop drie translationeel motoren en een roterende motor houdt het monster, zodat het teken nauwkeurig kan worden gepositioneerd, draaide zich om en vanuit elke richting. In het verleden exemplaren voor lichte plaat microscopie zijn vaak ingebed in 1-2% agarose in een glazen capillair 6,7. In dit geval de gestolde agarose cilinder met de ingebedde monster wordt geëxtrudeerd uit het glas capillair in de monsterkamer gevuld met water-achtige medium voor beeldvorming. Agarose heeft een brekingsindex dicht bij water en is daarom perfect geschikt voor in vivo licht blad microscopie dat water gecorrigeerde belichting-en detectie optiek vergemakkelijkt. Het monster wordt opgesloten in de stijve agarose en kan goed worden afgebeeld gedurende een korte periode, maar morfogenetische veranderingen en groei van het embryo sterk verstoord wanneer beeldvorming enkele uren 7,8. Hoewel oplossingen voor andere toepassingen zijn ontwikkeld 9, de niet-invasieve langdurige time-lapse zebravis beeldvormende mogelijkheden van licht plaat microscopie kan niet worden misbruikt via het conventionele 1,5% agarose inbedding.
We ontwikkelden daarom een nieuwe montage strategie voor in vivo licht vel microscopie van zebravis embryo's 10. Het monster wordt in 0,1% agarose gemonteerd met 200 mg / L tricaïne in een buis van de optisch heldere polymeer gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP). De embedded embryo ontwikkelt gewoonlijk het gevolg van lage viscositeit van het medium. Tegelijkertijd, de FEP buis begrenst het medium en het monster gedurende de duur van het experiment. Hier geven we een gedetailleerd protocol van de nieuwe montage techniek en presenteren van gegevens als gevolg van de voordelen ten opzichte van de conventionele protocol. We zien dat onze werkwijze zebravis ontwikkeling continu kan worden afgebeeld met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie gedurende meer dan twee dagen.
5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
Figuur 1. Het beginsel van lichtwaaier microscopie. Zebravis gemonteerd in een buis van Gefluoreerde Ethyleen Propyleen (FEP) op vertaling en gedraaid het brandvlak van het objectief detectie. Een dunne plaat van laserlicht (licht vel) wordt geprojecteerd door de belichting doelstelling in het brandvlak van de objectieve detectie en verlicht slechts een dunne optische gedeelte van het monster. De geëmitteerde fluorescentiesignaal wordt door het doel detectie en opgenomen op een camera chip.
Geavanceerde microscopische technieken zoals licht vel microscopie ons toelaten om de beelddata met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in de loop van enkele dagen, maar vereisen ook monster montagetechnieken te verbeteren. We presenteren een gedetailleerd protocol van meerlaagse montage voor lichte plaat microscopie van ontwikkeling van de zebravis. De methode is eenvoudig te implementeren en we gebruiken het in ons lab op een dagelijkse basis.
De FEP buizen
Belangrijkste componenten van onze strategie montage buizen van het polymeer Gefluoreerde Ethyleen Propyleen (FEP). We besloten om FEP gebruiken voornamelijk vanwege de brekingsindex van 1,338, die vergelijkbaar is met water en daarom ideaal voor lichte plaat microscopie met water dompelen doelstellingen en voorbeelden die waterige media. De buizen met 0,8 mm binnendiameter en 0,4 mm wanddikte passen bij de ontwikkeling van de zebravis heel goed, kan gebruikt worden met typische monster houders geschikt voor 1.6 mmhaarvaten en zijn onze eerste keuze voor de gepresenteerde montage methode. We testten deze grondig in ons zelfgebouwde opstellingen als in het commerciële systeem "Lightsheet Z.1" door Carl Zeiss Microscopie en vonden dat FEP tubes langdurige stabiliteit, slechts een minimale impact op de optische prestaties en zijn niet-fluorescerende 10. Zij zijn echter niet geschikt voor toepassingen met monsters die een andere brekingsindex, bijv. gewist monster nodig.
Buizen en folies gemaakt van FEP zijn beschikbaar in verschillende diameters en dikten. Daarnaast kunnen FEP worden gesmolten bij 260 ° C en biedt daarmee vrijwel eindeloze mogelijkheden voor op maat gemaakte monster montagebeugels. Het polymeer buizen worden vaak geleverd steriel en daarom het reinigingsprotocol omvat verschillende stappen om beste optische kwaliteit. De coating met methylcellulose zorgt ervoor dat geen enkel deel van het groeiende zebravis embryo kleeft aan het polymeer.
<p class = "jove_step"> De montage mediumDe beslissing voor 0,1% agarose is gebaseerd op uitgebreide testen van de groeisnelheid en immobiliteit in verschillende concentraties van agarose en methylcellulose 10. Agarose concentraties boven 0,1% al toonde een grote invloed op de groei van 24 HPF zebravis. Daarnaast maken we gebruik van lage doses van de verlamming drug tricaïne. Tricaïne blokken actiepotentialen, remt dus de signaaloverdracht tussen hersenen en spieren en onderdrukt spiercontracties 16. Een concentratie van 133-200 mg / L zorgt voor voldoende immobilisatie van de zebravis tussen 24-72 HPF. Echter, tricaïne en andere verlamming medicijnen die we tonen dosis-afhankelijke bijwerkingen, zoals hart-oedeem getest. Daarnaast kan de vereiste dosis tricaïne varieert met het ontwikkelingsstadium van het embryo. Wij adviseren daarom het verminderen van de tricaïne concentratie tot het bedrag dat nodig is voor de ontwikkelingsstadia die worden afgebeeld. Om beste-optreden te verzekerence en voorkomen de vorming van giftige bijproducten, moet vers bereid of ontdooid tricaïne stamoplossing te worden gebruikt, beschermd tegen licht en niet boven 30 ° C verwarmd
De inbedding in FEP buizen maakt het ook voor eenvoudige wijziging van de montage medium om rekening te houden met specifieke behoeften. Voor time-lapse beeldvorming van het hart, raden wij u 3% methylcellulose en 100 mg / L tricaïne in plaats van 0,1% agarose en 200 mg / L voor de montage. Methylcellulose is meer viskeus dan 0,1% agarose aldus verschaffen hogere immobiliteit op zichzelf en minder tricaïne moet worden om opsluiting van de embryo waarborgen.
Tricaïne is gevoelig voor temperaturen boven 30 ° C en kan ook worden verdund met het medium in de beeldvorming kamer, waardoor prestaties en mogelijke trillen van de embryo afgenomen. Zorg er daarom voor om tricaïne ook gebruiken in de beeldvorming medium waarin de gemonteerde monster wordt ondergedompeld. Als uw experimenten vereisen het gebruik van hogeretemperaturen raden wij uitwisseling het medium in de beeldvorming kamer hetzij continu door een perfusie systeem of handmatig met een buis en een spuit tussen twee tijdstippen.
Kritische stappen
De kritische stappen tijdens het proces van monster montage zijn de opname van het monster in de buis en het inbrengen van de agarose plug. De inlaat definieert de beginpositie van het embryo, wat omslachtig achteraf veranderen. Meerdere exemplaren beschikbaar moeten te monteren en de montage kwaliteit moet worden gecontroleerd met een stereomicroscoop. Als het monster oriëntatie is niet bevredigend, het veranderen van de snelheid van het opstellen van het model en het vermijden van latere verplaatsingen van de zuiger kan helpen als deze verdraait vaak het embryo. De 1,5% agarose plug noodzakelijk om lekkage van de 0,1% agarose voorkomen. Het oppervlak van de plug in de buis moeten plat om het monster geaardheid geen invloed tijdens de ontwikkeling zijn. Om een goede surf bereikenace, verschillende diktes van de agarose lagen moeten worden getest en buisje in de agarose normaal op het oppervlak worden gebracht. Draaiing van de buis een beetje en het uittrekken van de buis zorgvuldig releases de stekker uit de schotel. De kwaliteit van de montage moet worden gecontroleerd met een stereomicroscoop voor de beeldvorming.
Multiview beeldvorming
Een groot voordeel van licht plaat microscopie is multiview beeldvorming, de mogelijkheid om het model te roteren, te verwerven z-stacks vanuit verschillende hoeken en vervolgens registreren en zekering ze. Een gevestigde methode om de z-stacks te registreren in 3D-ruimte is-kraal registratie op basis van het gebruik van fluorescerende kralen rond het monster, zoals fiduciaire markers 17. Deze methode gaat er echter van een stevige montage medium zoals 1,5% agarose en lijkt derhalve onverenigbaar met de meerlaagse montage hier gepresenteerd. Maar verschillende alternatieve oplossingen werkt, afhankelijk van de toepassing. Ten eerste, de fluorescerende kralen kanin de agarose plug, die moet in het gezichtsveld tijdens de acquisitie worden opgenomen. Ten tweede kan het stadium posities wordt vóór de eigenlijke experimenten met een 1,5% agarose kolom met fluorescerende kralen. Ten derde kunnen alternatieve merkers zoals fluorescente kernen worden gebruikt om de positie van de z-stacks opzichte van elkaar te identificeren.
Verdamping
Typische lichte vel microscopie opstellingen gebruiken een open monsterkamer, wat onvermijdelijk leidt tot de verdamping van het medium. Aangezien het medium is essentieel voor de overleving van het monster, om verdamping van het fixeermiddel te beperken en voor de juiste brekingsindex tussen optische en monster aanbevolen waarbij een of meer van de volgende maatregelen om verdamping te voorkomen. Ten eerste kan het medium in de kamer voortdurend worden uitgewisseld door een perfusie systeem. Ten tweede kan het medium handmatig worden bijgevuld. Ten derde kan de kamer worden afgedekt met een deksel of een flexibele folie.
<pclass = "jove_step"> ZuurstoftoevoerHet polymeer FEP is ontwikkeld om een groot aantal chemicaliën te weerstaan en derhalve robuust, chemisch inert en nonpermeable gas. Bij meerlagige montage zuurstof alleen doordringen door de agarose plug en agarose-luchtinterface, maar moet nog worden aangetoond of de zuurstoftoevoer meerlagige montage ernstig lager dan in de montage in 1,5% agarose zonder ondersteuning polymeerbuis. Zoals montage in 1.5% agarose kunnen alleen worden gebruikt voor ongeveer twee uur voor de zebravis morfologie beïnvloed multilayer montage lijkt de totale superieure oplossing voor lange termijn beeldvorming.
Beeldvorming van eerdere stadia van ontwikkeling
Multilayer montage is nu onze standaard inbedding techniek voor time-lapse licht vel microscopie van zebravis ouder dan 24 HPF. Daarnaast gebruiken we ook het polymeer buizen voor beeldvorming van eerder stadium embryo's. De embryos blijven in hun chorions en worden in een FEP buis gemonteerd met een binnendiameter van 1 mm en gevuld met E3. De zebravis kan vrij ontwikkelen zich in het chorion en nog steeds kan worden afgebeeld en met behulp van licht plaat microscopie.
Vooruitzicht
De gepresenteerde multilayer monster montage ontketent het volledige potentieel van licht plaat microscopie voor real-time ontwikkelingsbiologie met zebravissen. Het kan gemakkelijk voor andere microscopische technieken zoals optische projectie tomografie (OPT) en andere organismen vastgesteld. Wij zijn van mening dat de standaard-en kleinbedrijf FEP buizen zijn slechts de eerste stappen op weg naar monster montage technieken afgestemd op specifieke behoeften.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de Max-Planck-Gesellschaft, het Human Frontier Science Program (HFSP) en Boehringer Ingelheim Fonds voor financiering en ondersteuning.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |