Развитие рыбок данио может следовать в течение нескольких дней с легкой листовой микроскопии, когда эмбрионы встроенных в оптически прозрачных полимерных труб с низкой концентрации агарозы.
Свет лист микроскопия является идеальным методом визуализации для изучения данио эмбрионального развития. Благодаря минимальной фото-токсичности и отбеливания, это особенно подходит для долгосрочного покадровой обработки изображений в течение многих часов до нескольких дней. Тем не менее, соответствующая стратегия монтаж образец необходим, который предлагает как удержание и нормальное развитие образца. Многослойные монтажа, новая техника вложение с помощью низкой концентрацией агарозы в оптически прозрачных трубок, теперь преодолевает это ограничение и раскрывает весь потенциал света листового микроскопии в режиме реального времени биологии развития.
Чтобы понять сложные события и взаимодействия во время эмбриогенеза, исследования в биологии развития все больше и больше переходят от микроскопии отдельных клеток и органов, чтобы в естественных изображений целых организмов. Традиционные методы микроскопии, как правило, не могут предложить пространственное и временное разрешение, чтобы следовать быстрые события в течение длительного периода времени, и часто вызывают обесцвечивание или фототоксические эффекты в образце 1. Мы и другие обнаружили, свет лист микроскопии (рис. 1), чтобы быть идеальным методом для в естественных изображений рыбок данио 2-4. Облучение образца с тонким листом лазерного света, ортогональную к оси обнаружения, обеспечивает быструю оптического секционирования с высоким пространственным разрешением, а также свести к минимуму фото-5 токсичности. В то же время, в связи с этой уникальной оптической схеме, традиционные методы монтажа примера с использованием чашки Петри или культуры камеры не подходят. В типичной светалист микроскопа три поступательные двигатели и вращения двигателя держать образец, таким образом, что он может быть точно позиционирован, повернулся и смотреть с любого направления. В последние образцов для легкой листовой микроскопии часто вкладывается в 1-2% агарозном внутри стеклянного капилляра 6,7. В этом случае затвердевший агарозном цилиндр с встроенными образца экструдируют из стеклянного капилляра в отборную камеру, заполненную водой как средство для визуализации. Агарозном имеет показатель преломления, близкий к воде и, следовательно, идеально подходит для света в естественных листа микроскопии, что облегчает воды с коррекцией подсветки и обнаружения оптики. Образец заключен в жесткую агарозы и могут быть отображены также в течение короткого периода времени, но морфогенетические изменения и рост эмбриона сильно ухудшается при визуализации в течение нескольких часов 7,8. Хотя решения для других приложений были разработаны 9, неинвазивного долгосрочных покадровой рыбок данио изображений потенциал света листового микроскопии не может быть использована с использованием обычного 1,5% агарозном вложение.
Поэтому мы разработали новую стратегию по монтажу в естественных света листового микроскопии эмбрионов рыбок данио 10. Образец устанавливают в 0,1% агарозном с 200 мг / л Tricaine внутри трубы, изготовленной из оптически прозрачного полимерного фторированный сополимер этилена пропилена (FEP). Встроенный эмбрион развивается нормально из-за низкой вязкости среды. В то же время, FEP трубка ограничивает среду и образец в течение всего срока эксперимента. Здесь мы предоставляем подробный протокол новой техники монтажа и настоящих данных, отражающих его преимущества по сравнению с обычным протоколом. Показано, что с помощью нашего метода развития данио можно непрерывно полученную с высоким пространственным и временным разрешением в течение более двух дней.
5 дюймов "FO: Пребывание" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Принцип света листового микроскопии. Данио установленный в трубе, изготовленной из фторированного этилен-пропилен (ФЭП) могут быть переведены и вращается с помощью фокальной плоскости объектива обнаружения. Тонкий лист лазерного света (свет лист) проецируется освещения цели в фокальной плоскости объектива обнаружения и освещает только тонкий оптический участок образца. Излучаемый сигнал флуоресценции собирают целью обнаружения и записаны на чипе камеры.
Расширенный методы микроскопии, такие как легкие листовые микроскопии позволяют записывать данные изображения с высоким временным и пространственным разрешением в течение нескольких дней, но и требуют образцы монтажных методами повышения. Мы представляем подробный протокол многослойных монтажа для легкой листовой микроскопии данио развития. Метод прост в реализации, и мы используем его в нашей лаборатории на ежедневной основе.
Трубки FEP
Ключевые компоненты нашей стратегии по монтажу является трубки из полимерного Фторсодержащая этилен-пропилен (FEP). Мы решили использовать FEP первую очередь из-за его преломления 1,338, который похож на воду и, следовательно, идеально подходит для легкой листовой микроскопии с водой для окунания целей и образца, требующих водной среде. Пробирки с 0,8 мм и внутренним диаметром 0,4 мм толщиной стенки соответствовать развивающийся данио очень хорошо, может быть использован с типичными держателей образцов, пригодных для 1,6 ммкапилляры и являются нашим первым выбором для представленной способ монтажа. Мы протестировали их полностью в наших самодельных установок, а также в коммерческой системы "Lightsheet Z.1" Карл Цейсс микроскопии и обнаружили, что FEP трубки предложить долгосрочную стабильность, есть только минимальное влияние на оптические характеристики и нефлуоресцентный 10. Они, однако, не подходит для приложений с образцами, которые требуют другой показатель преломления, например очищенную образца.
Трубы, а также пленки из FEP доступны в различных диаметров и толщин. Кроме того, ФЭП можно расплавить при 260 ° С и таким образом предлагает практически безграничные возможности для заказных образцов монтажных опорах. Полимерные трубы, как правило, поставляется нестерильного, поэтому протокол очистки включает в себя несколько шагов, чтобы обеспечить наилучшую оптическое качество. Покрытие с метилцеллюлозы гарантирует, что ни одна часть растущей эмбрионов рыбок данио не прилипает к полимеру.
<p clзадницу = "jove_step"> гистологическая средаРешение для 0,1% агарозы основана на обширных испытаний скорости роста и неподвижности в различных концентрациях агарозы и метилцеллюлоза 10. Агарозные концентрации выше 0,1% уже показали серьезное влияние на темпы роста 24 HPF рыбок данио. Кроме того мы используем низкие дозы обезболивающего препарата Tricaine. Потенциалы Tricaine блоки действий, тем самым тормозит передачу сигнала между мозгом и мышцами и подавляет мышечных сокращений 16. Концентрация 133-200 мг / л обеспечивает достаточную иммобилизацию рыбок данио между 24-72 часов после оплодотворения. Тем не менее, Tricaine и другие обезболивающие препараты мы тестировали шоу дозы зависит побочные эффекты, такие как отек сердечной. Кроме того требуется доза Tricaine меняется в зависимости от стадии развития эмбриона. Поэтому мы рекомендуем снижения концентрации Tricaine в количестве, необходимом для стадии развития, которые изображаются. Для обеспечения наилучшего езультатысе и предотвратить образование токсичных побочных продуктов, свежеприготовленный или размораживать раствор Tricaine следует использовать, защищенном от света месте, а не нагревается выше 30 ° С.
Вложение в FEP труб также позволяет легко модификации монтажную среду для учета конкретных потребностей. Для покадровой визуализации сердца, мы рекомендуем использовать 3% метилцеллюлозы и 100 мг / л Tricaine вместо 0,1% агарозы и 200 мг / л для монтажа. Метилцеллюлозы является более вязкой, чем 0,1% агарозном обеспечивая тем самым более высокую неподвижность по себе и менее Tricaine необходимо использовать для обеспечения удержание эмбриона.
Tricaine чувствительна к температуре выше 30 ° С, а также может быть разбавлен среды в камере формирования изображения, что приводит к снижению производительности и, возможно, подергивание эмбриона. Поэтому убедитесь, что используете Tricaine также в среде визуализации, в котором установлен образец погружен. Если ваши эксперименты требуют использования болееТемпературы, мы рекомендуем обмена среды в камере изображений или постоянно с помощью системы перфузии или вручную с помощью трубки и шприца между двумя временных точках.
Критические шаги
Критические шаги в процессе монтажа образца являются потребление образца в пробирку и вставка из агарозного вилки. Потребление определяет начальное положение эмбриона, который является громоздким, чтобы изменить впоследствии. Несколько образцов должны быть доступны для установки и монтажа качества должны быть проверены с помощью стереомикроскопа. Если ориентация образец не является удовлетворительным, изменяя скорость составления образца и избежать последующих движений поршня может помочь, так как это часто крутит эмбрион. 1,5% агарозном плагин необходимо, чтобы избежать утечки 0,1% агарозы. Поверхность плунжера внутри трубки должна быть плоской, чтобы не влиять на ориентацию образца в процессе разработки. Для достижения хорошего серфингатуз, разные толщины геле слоев должны быть проверены и трубка должна быть введена в агарозы нормали к поверхности. Поворот трубы немного и вытаскивая трубку тщательно релизы вилку из тарелки. Качество монтажа должны быть проверены с помощью стереомикроскопа до визуализации.
Томография Multiview
Одно из главных преимуществ легкой листовой микроскопии является MultiView изображений, возможность поворота образца, приобрести Z-стеки с разных углов, а затем зарегистрироваться и слить их. Создан метод для регистрации Z-стеки в 3D-пространстве является шарик на основе регистрации с помощью флуоресцентных бусы окружающие образец в тайне маркеров 17. Этот метод, однако, опирается на твердой монтажной среде, такой как 1,5% агарозы и, таким образом, кажется, несовместимые с многослойной монтажа представлены здесь. Но несколько альтернативных решения работают в зависимости от приложения. Во-первых, люминесцентные бусины можнобыть включены в агарозном штекера, который должен быть в поле зрения во время сбора. Во-вторых, этап позиции может быть откалиброван до фактических экспериментов с использованием 1,5% колонку агарозы с люминесцентными бисером. В-третьих, альтернативные маркеры, такие как люминесцентные ядер может быть использован для идентификации положение Z-стеки относительно друг друга.
Испарение
Типичные установок свет лист микроскопия использовать открытое образец камеры, что неизбежные приводит к испарению среды. Поскольку среда имеет важное значение для выживания образца, чтобы ограничить испарение монтажную среду и для правильного преломления между оптикой и образца, мы рекомендуем принимать одно или несколько из следующих мер по предотвращению испарения. Во-первых, среда в камере может быть постоянно обмениваются с помощью системы перфузии. Во-вторых, среда может быть пополнен вручную. В-третьих, камера может быть покрыта крышкой или гибкой фольги.
<pкласс = "jove_step"> Подача кислородаПолимер ФЭП был разработан, чтобы выдерживать большое разнообразие химических веществ и, следовательно, надежные, химически инертны и nonpermeable на газ. В случае многослойной монтажа кислорода могут проникать только через агарозном вилки и интерфейсом агарозы небом, но это еще предстоит в меню, если подача кислорода в многослойных монтажа является строго ниже по сравнению с установки в 1,5% агарозном без поддержки полимерную трубку. Однако, как установки в 1,5% агарозы можно использовать только в течение примерно двух часов, прежде чем данио морфология влияют многослойную монтаж, кажется, в целом превосходное решение для долгосрочного изображений.
Визуализация ранних стадиях развития
Многослойные монтажа стала наша стандартная техника вложение для покадровой свет листовой микроскопии данио старше 24 оплодотворения. Кроме того, мы также используем полимерные трубы для визуализации ранних эмбрионов на стадии. Еmbryos остаются на своих хорионов и установлены в FEP трубки с внутренним диаметром 1 мм и заполненный E3. Данио могут свободно развиваться внутри хориона и все еще может быть отображены также с помощью светового листа микроскопии.
Прогноз
Представленный образец многослойного монтажа раскрывает весь потенциал света листового микроскопии в режиме реального времени биологии развития с данио. Она может быть легко приняты для других методов микроскопии, такие как оптической проекционной томографии (OPT) и других организмов. Мы считаем, что стандартные размера FEP трубки лишь первые шаги на пути к выборочных монтажных методов с учетом конкретных потребностей.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Общества Макса Планка, программы по населенным Frontier Science (HFSP) и Boehringer Ingelheim Fonds для финансирования и поддержки.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |