Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

doi: 10.3791/51119 Published: February 27, 2014

Summary

ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך.

Abstract

מיקרוסקופיה גיליון אור היא טכניקת הדמיה האידיאלית ללמוד התפתחות עוברית דג הזברה. בשל צילום רעילות והלבנה מינימליות, הוא מתאים במיוחד לזמן לשגות הדמיה לטווח ארוך על פני שעות רבות עד מספר ימים. עם זאת, יש צורך במדגם אסטרטגית הרכבה מתאימה, אשר מציעה גם כליאה והתפתחות תקינה של המדגם. רב שכבתי וההרכבה, טכניקת הטבעה חדשה באמצעות agarose ריכוז נמוך בצינורות ברורים אופטי, החברה מתגברת על מגבלה זו ומשחררת את מלוא הפוטנציאל של מיקרוסקופיה גיליון אור לביולוגיה התפתחותית בזמן אמת.

Introduction

כדי להבין את האירועים המורכבים ויחסי גומלין בעובר, במחקר בביולוגיה התפתחותית הוא יותר ויותר עוברים ממיקרוסקופי של תאים ואיברים בודדים להדמית vivo של כל האורגניזמים. שיטות מיקרוסקופיה מסורתיות בדרך כלל לא מצליחות להציע פתרון מרחב ובזמן לעקוב אחר אירועים מהירים על פני תקופה ארוכה של זמן ולעתים קרובות גורמות להלבנה או תופעות phototoxic במדגם 1. אנחנו ואחרים מצאו מיקרוסקופיה גיליון אור (איור 1) להיות הטכניקה האידיאלית עבור ההדמיה vivo של דג הזברה 2-4. התאורה של המדגם עם סדין דק של אור הלייזר, מאונך לציר זיהוי, מציעה חתך אופטי מהיר עם רזולוציה מרחבית גבוהה, כמו גם למזער צילום רעילות 5. במקביל, בשל הסדר אופטי ייחודי זה, טכניקות הרכבת מדגם מסורתיות באמצעות צלחות פטרי או תאי תרבות אינן מתאימות. באור טיפוסישלושה מנועים translational מיקרוסקופ הגיליון ומנוע סיבובי להחזיק את המדגם, כך שזה יכול להיות ממוקם בדיוק, הסתובב ומבט מכל כיוון. בדגימות האחרונות למיקרוסקופיה גיליון אור יש לעתים קרובות היה משובץ ב1-2% agarose בתוך נימי זכוכית 6,7. במקרה זה הצילינדר agarose הקרושה עם הדגימה מוטבעת הנמתח מנימי הזכוכית לתוך תא המדגם מלא בינוני כמו מים להדמיה. יש agarose מקדמת שבירה קרובה למים, ולכן הוא מתאים באופן מושלם למיקרוסקופיה גיליון אור in vivo המאפשרת אופטיקה תאורה וזיהוי תיקן מים. המדגם מוגבל בagarose הנוקשה וניתן הדמיה גם לתקופה קצרה של זמן, אבל שינויים וצמיחה של העובר morphogenetic הם מאוד לקויים כאשר הדמיה במשך כמה שעות 7,8. למרות שפתרונות עבור יישומים אחרים פותחו 9, דג הזברה הזמן לשגות לטווח ארוך לא פולשנית יכולת צילום במיקרוסקופ אור גיליון לא ניתן לנצל באמצעות הטבעת agarose 1.5% הקונבנציונלית.

לפיכך, אנו פיתחנו אסטרטגית הרכבה חדשה למיקרוסקופיה גיליון אור vivo של עוברי דג הזברה 10. המדגם הוא רכוב ב0.1% agarose עם Tricaine 200 מ"ג / ליטר בתוך צינור עשוי מפולימר אתילן Fluorinated ברור אופטי פרופילן (FEP). העובר המוטבע מתפתח בדרך כלל עקב צמיגות נמוכה של המדיום. במקביל, צינור FEP מגביל את המדיום ואת המדגם עבור משך הניסוי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט של הטכניקה החדשה ההרכבה ומציג נתונים המשקפת את היתרונות שלה על פני הפרוטוקול הקונבנציונלי. אנו מראים כי עם התפתחות דג הזברה השיטה שלנו ניתן הדמיה ברציפות עם רזולוציה מרחבית ובזמן גבוה על פני תקופה של יותר מיומיים.

5in "עבור: src =" "/> /" = src "/ files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg
איור 1. העיקרון של מיקרוסקופיה גיליון אור. דג הזברה רכוב בצינור עשוי אתילן Fluorinated פרופילן (FEP) יכול להיות מתורגמת ומסובב דרך מישור המוקד של מטרת זיהוי. סדין דק של אור הלייזר (גיליון אור) צפוי על ידי מטרת התאורה למישור המוקד של מטרת האיתור ומאיר סעיף אופטי דק בלבד של הדגימה. אות הקרינה הנפלטת נאסף על ידי מטרת האיתור ונרשמה על שבב מצלמה.

Protocol

1. הכנת חומר

  1. הכנה של צינורות FEP
    1. נקה את צינור FEP (איור 2 א) על ידי שטיפת נוזלים (בצעדים האמורים להלן) דרך הצינור ובאמצעות מזרק מצורף עם צינורית קצה קהה (איור 2) באור 1:.. להשתמש בכפפות בכל הליך הערה 2: אנו ממליצים חיתוך הצינור בחתיכות של CA. 1 מ 'אורך וניקוי אלה במקביל.
      1. ראשית לשטוף את הצינור עם 1 M NaOH שוב ושוב. ואז להעביר את הצינור לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר מלא 0.5 M NaOH וultrasonicate זה ל10 דקות.
      2. העבר את צינור הפולימר לאגן קטן עם DDH 2 O. שטוף את הצינור ראשון עם DDH 2 O ולאחר מכן עם EtOH 70%.
      3. בהמשך לכך להעביר את צינור FEP לצינור צנטריפוגות טרי עם EtOH 70%. שוב ultrasonicate צינור צנטריפוגות זה ל10 דקות.
    2. חותכים את צינור FEP ניקה לחתיכותשל כ 3 סנטימטר (אורך אופייני לשימוש בהרכבה והדמיה דג הזברה) ויישר אותם במידת צורך. אחסן את צינורות FEP ניקו בצינור צנטריפוגות טרי 50 מיליליטר מלא DDH 2 O (איור 2 ג).
  2. הכנת פתרון מניות Tricaine
    1. הכן 0.4% מניות פתרון Tricaine ידי המסת Tricaine 400 מ"ג (MS-222) ב97.9 DDH מיליליטר 2 O. לאחר האבקה נמסה לגמרי, להתאים את ה-pH 7.0 באמצעות 2.1 מיליליטר 1M טריס (pH 9.0). הגן על הפתרון מן האור. aliquots חנות ב -20 ° C.
  3. הכנת methylcellulose 3%
    1. הכן 3% פתרון methylcellulose לציפוי הפנימי של צינורות FEP כמתואר להלן. לחמם 11 E3 בבקבוק זכוכית של כ 60-70 מעלות צלזיוס ולהוסיף את הכמות המתאימה של אבקת methylcellulose. להוסיף סרגל ערבוב ומערבבים ב 4 ° C. ברגע שהפתרון הוא התקרר אל מתחת 30 מעלות צלזיוס, להוסיף פתרון Tricaine לג סופיoncentration של 100 מ"ג / ל ' שמור ערבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. הכנה של .1.5% וagarose 0.1% בE3
    1. ממיסים את הכמות המתאימה של אבקת agarose נקודת התכה נמוכה בנפח מוגדר של E3 בבקבוק זכוכית. לחמם את התערובת במיקרוגל ולנער אותו פעם בכמה זמן, עד לפתרון agarose מופיע הומוגנית, ללא כל גבישים שנותרו.
    2. הכן 1 מיליליטר aliquots של .0.1% פתרון agarose ב1.5 מיליליטר צינורות תגובה. ניתן לאחסן aliquots ב 4 ° C.
    3. השתמש בפתרון 1.5% למעייל צלחת פטרי פלסטיק. עובי שכבת agarose צריך להיות CA. 2 מ"מ. לאחר agarose הוא התגבש, להוסיף בינוני E3 על גבי השכבה, כדי למנוע אותו מהתייבשות. הצלחת המצופה ניתן לאחסן ב 4 ° C.
  5. הכנה של דג הזברה
    1. שמור על דג הזברה מבוגר (Danio rerio) ועוברים על 28.5 מעלות צלזיוס ולטפל בהם בהתאם לפרוטוקולים שהוקמו 11,12.
    2. הגדר את דגי זכר ונקבה בשעתי אחר הצהריים ולהפריד ביניהם באמצעות מחיצה. הסר את המחיצה בבוקר שלמחרת לעת ההזדווגות של הדגים.
    3. לאסוף את העוברים בצלחת מלאה בE3 ולבחון אותם באמצעות סטראו.
    4. ב24 hpf (או שלב התפתחותי העניין שלך), בחר בעובר דג הזברה לביטוי הקרינה ולהעביר את החיוביות לצלחת חדשה עם E3 הטרי.
    5. dechorionate את העוברים בזהירות תוך שימוש בשני מלקחיים חדים (2D דמויות ו2E). השתמש במלקחיים הראשונים כדי לתפוס ולהחזיק את סיסי ומלקחיים שני לקרוע אותו פתוח ולמשוך אותה באור 1:. בצע את הצעד הזה עם העזרה של סטראו.

2. הרכבה רב שכבתית

  1. ציפוי צינור FEP
    1. צרף צינורית קצה קהה למזרק. הכנס את הצינורית בזהירות במשך כ 3 מ"מ לתוך קצה אחד של ניקה וחתך חתיכה. צינור FEP (2F דמויות ו2G) הערה 1: כפפות ולהימנע מכל שימוש או סחיט כיפוף של הצינור.
    2. טובלים את הקצה החופשי של צינור FEP לmethylcellulose 3% ולמלא את הצינור עם הפתרון.
    3. לאט לאט לשחרר את methylcellulose על ידי לחיצה על המזרק. מחק את הפתרון.
    4. חזור על השלבים 2.1.2 ו 2.1.3 באמצעות E3 הערה 1:. הצינורות מצופים צריכים לשמש להרכבה באופן מיידי.
  2. העברת דג הזברה לagarose
    1. לחמם aliquot אחד agarose 0.1% ל70 מעלות צלזיוס בגוש חום. ורטקס בקצרה צינור התגובה ולהעביר אותו לגוש חום מוגדר 38 ° C (איור 2H).
    2. קח את צינור התגובה מ הגוש החום ולתת לו להתקרר לזמן קצר. הוספת Tricaine לריכוז סופי של 133-200 מ"ג / ליטר ומערבולת שוב (איור 2 ט).
    3. בחר באחד מעוברי דג הזברה dechorionated וtransfe. R אותו לצינור התגובה עם agarose 0.1% שחומם מראש באמצעות פיפטה פסטר זכוכית (י 2 דמויות ו2K) הערה 1: נסה להעביר E3 נוסף קטן ככל האפשר.
  3. הרכבה דג הזברה
    1. קח את העובר עם צינור FEP מצורף מזרק (איור 2L). . הצינור צריך להיות מלא לחלוטין עם agarose 0.1%, עם העובר ממוקם קרוב לקצה אחד של הצינור ועם הראש והצביע לעבר הפתח של צינור הערה 1: הקפד לקחת כמה agarose לפני תופס את הדגים. הערה 2: משוך בעדינות על המזרק כדי למנוע בועות באור 3:. שמור את הצינור בכיוון אופקי, כדי למנוע דליפה של התוכן שלה (איורים 2M ו2N).
  4. חיבור הצינור
    איור 2
    איור 2. רב שכבתי וגובר לעוברי דג הזברה.) אתילן Fluorinated פרופילן (צינורות FEP) על תוף כבל לפני הכנה. B) מזרק עם צינורית קצה קהה המצורפת. C) ניקה וחתך צינור FEP. D, E) dechorionation של 24 hpf עוברי דג הזברה. F) חיבור הצינור לצינורית הקצה הקהה. G) המזרק עם צינורית וצינור מחובר. H) aliquot של 0.1% agarose בתוך צינור תגובה בעת העברתו לגוש חום. אני) vortexing של נמס העברת agarose. J) ספיגה של עובר dechorionated באמצעות פיפטה זכוכית. K) של העובר לagarose נמס. L) צריך של העובר עם סובבי agarose לתוך צינור FEP. M, N) עובר דג הזברה בתוך צינור FEP . P) לחבר את הצינור על ידי השימוש בצלחת מצופה agarose. ש) העובר בתוך הצינור המחובר. הכנת המדגם הסופית במחזיק מתכת R). לחץ כאן כדי צפייה בתמונה גדולה יותר.
    1. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הצינור מהצינורית (איור 2 טו ').
    2. לאט לאט להיצמד סוף הצינור המכיל את הדגים דרך כל השכבה של agarose 1.5% בצלחת הפלסטיק לחבר את הצינור (איור 2P) הערה 1:. למנוע היווצרות של בועות ולנסות לקבל משטח ישר תקע על ידי ההחזקה . צינור בדיוק בניצב לפני השטח agarose הערה 2: סובב את הצינור מעט כדי להשיג התוספת נחמדה.
    3. שמור את הדגימה רכוב בצינור תגובה 1.5 מיליליטר עם E3, כדי למנוע התייבשות. המדגם הוא now מוכן להיות צילם. לפני ההדמיה, לבדוק אם הדגים יושבים ממש על גבי התקע (2Q דמויות ו2R). ודא גם להוסיף Tricaine למדיום בתוך חדר ההדמיה באותו הריכוז כמו בהרכבה בינונית.

Representative Results

ההדמיה multiday של דג הזברה כלי דם פיתוח

אנו משתמשים ב1 DPF Tg (kdrl: GFP) 13 דג הזברה כדי להדגים את היתרונות של אסטרטגית הרכבה רב שכבתית למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך. המטרה היא תמונת ההתפתחות של כלי הדם בכל דג הזברה על קורס של 2 ימים. עובר דג הזברה היה רכוב ב0.1% agarose בתוך צינור פולימר methylcellulose מצופה. הנה, דג הזברה אינה מוגבל על ידי ההרכבה בינונית ויכולה להתפתח באופן נורמלי. ראשו מעלה, הזנב מרחיב כלי דם וההנבטה מופיעה באין מפריעה (איור 3).

איור 3
איור 3. הדמיה multiday של פיתוח כלי הדם דג הזברה. כלי הדם של multilayer רכוב 1 DPF Tg (kdrl: GFP) 13 דג הזברה מתפתחת באין מפריע במיקרוסקופ גיליון אור במשך יומיים. גיליון אור הלייזר 488 ננומטר הלהיב את הקרינה ואת האות זוהתה באמצעות 10X/0.3 אובייקטיבי W ומצלמה EMCCD. Z-ערימות נרכשו על ארבעה עמדות סמוכות כל 10 דקות ולאחר מכן תפרו עם 15 פיג'י. תחזיות בעוצמה מקסימלית של קבוצת משנה של נקודות זמן מוצגות. בר סולם:. 500 מיקרומטר לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

הדמיה של דג הזברה מוקדם עובר

הנה, אנחנו מדגימים את היכולת של צינורות FEP כתמיכה גוברת למיקרוסקופיה גיליון אור של עובר דג הזברה מוקדם ביום הראשון לאחר הפריה. Hpf Tg 8 (H2A: GFP) 14 עובר דג הזברה היה רכוב עם סיסי בשלמותה בתוך צינור מלא-E3 עם iקוטר nner של 1 מ"מ. כי תוצאות בהידוק קל של סיסית. כל התהליכים התפתחותיים בעובר אינם מושפעים על ידי ההרכבה וניתן דמיינו בצורה אופטימלית באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור. בדוגמא זו, אנו צילמו את הדגימה מעל במהלך שעות 12 (איור 4). אופייני צורת שינויים בעובר מוקדם, כגון התארכות הגוברת של החלמון והעיבוי של רקמות לאורך קו האמצע, יהיו מדוכאים בעת שימוש בהרכבה המסורתית ללא סיסי בagarose 1.5%.

איור 4
. איור 4 הדמיה של עובר דג הזברה המוקדם Tg (H2A: GFP). דג הזברה 14 עוברת עובר מוקדם. GFP נרגש גיליון אור הלייזר 488 ננומטר ואות הקרינה זוהועם מטרת W 10X/0.3 ומצלמה EMCCD. Z-ערימות משתי זוויות נרכשו כל 3 דקות במהלך של שעות 12. תחזיות בעוצמה מקסימלית מנורמלות של קבוצת משנה של הזמן לשגות מוצגות. טשטוש גלוי תנועה ב19 תוצאות hpf מהרעד העובר במהלך רכישה, שכן אין הרדמה היו בשימוש. בר סולם:. 150 מיקרומטר לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

שיטות מיקרוסקופיה מתקדמות כגון מיקרוסקופיה גיליון אור תאפשר לנו להקליט את נתוני תמונה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה במשך כמה ימים, אבל גם דורשות מדגם טכניקות הרכבה כדי לשפר. אנו מציגים פרוטוקול מפורט של multilayer הרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור של פיתוח דג הזברה. השיטה היא פשוטה ליישום ואנו משתמשים בו במעבדה שלנו על בסיס יומי.

צינורות FEP

רכיבים מרכזיים באסטרטגיית ההרכבה שלנו הם צינורות עשויים אתילן Fluorinated פולימר פרופילן (FEP). החלטנו להשתמש FEP בעיקר בשל מדדה השבירה של 1.338, שהוא דומה למים ולכן מתאים באופן אידיאלי למיקרוסקופיה גיליון אור עם מטרות מים טבילה ודגימה הדורשת תקשורת מימית. הצינורות עם 0.8 מ"מ קוטר פנימי ו0.4 עובי דופן מ"מ יתאים לדג הזברה מתפתח יפה מאוד, ניתן להשתמש בם עם מחזיקי מדגם טיפוסיים המתאימים ל1.6 מ"מ נימים והם הבחירה הראשונה שלנו לשיטת ההרכבה הציגה. בדקנו אותם ביסודיות בהגדרות בבנייה העצמית שלנו, כמו גם במערכת המסחרית "Lightsheet Z.1" על ידי Carl Zeiss מיקרוסקופית ומצאנו כי צינורות FEP מציעים יציבות לטווח ארוך, יש השפעה מינימאלית בלבד על ביצועים אופטיים ו10 nonfluorescent. הם, לעומת זאת, אינם מתאימים ליישומים עם דגימות שדורשות מקדם שבירה שונה, למשל פינה דגימה.

צינורות, כמו גם שקפים עשויים FEP זמינים במגוון רחב של קטרים ​​ועוביים. בנוסף, ניתן להמס FEP ב 260 ° C ובכך מציע אפשרויות אינסופיות כמעט למדגם תומך הרכבה בהזמנה אישית. צינורות הפולימר נוטים להיות מסופקים לא סטרילי, ולכן פרוטוקול הניקוי משלב מספר צעדים על מנת להבטיח האיכות אופטית הטובה ביותר. הציפוי עם methylcellulose מבטיח ששום חלק של עובר דג הזברה גדל מקלות לפולימר.

התחת => ההרכבה בינונית "jove_step"

ההחלטה לagarose 0.1% מבוססת על בדיקות מקיפות של שיעור צמיחה וחוסר תנועה בריכוזים שונים של agarose וmethylcellulose 10. ריכוזי agarose מעל 0.1% כבר הראו השפעה חמורה על קצב הצמיחה של 24 דג הזברה hpf. בנוסף אנו משתמשים במינונים נמוכים של תרופות ההרדמה Tricaine. פוטנציאל פעולה בלוקים Tricaine, ובכך מעכב את העברת האותות בין המוח ושרירים ומדכא התכווצויות שרירים 16. ריכוז של 133-200 מ"ג / ליטר מבטיח חוסר תנועה מספקת של דג הזברה בין 24-72 hpf. עם זאת, Tricaine וסמים הרדמה אחרים שבדקו מינון מופע תופעות לוואי תלוי כגון בצקת לב. בנוסף המינון הנדרש של Tricaine משתנה עם השלב ההתפתחותי של העובר. לכן אנו ממליצים להקטין את ריכוז Tricaine לסכום הדרוש לשלבי ההתפתחות שהם צילמו. כדי להבטיח performan הטוב ביותרce ולמנוע היווצרות של תוצרי לוואי רעיל, יש להשתמש בפתרון מניות Tricaine מוכן או מופשר טריים, מוגן מפני אור ולא מחומם מעל 30 ° C.

ההטבעה בצינורות FEP גם מאפשרת שינוי קל של ההרכבה בינונית לתת דין וחשבון לצרכי ספציפיים. עבור זמן לשגות הדמיה של הלב, מומלץ להשתמש methylcellulose 3% ו100 מ"ג / ליטר Tricaine במקום agarose 0.1% ו200 מ"ג / ליטר להרכבה. Methylcellulose הוא צמיג יותר מ -0.1% agarose ובכך לספק חוסר תנועה גבוהה יותר בעצמה ופחות Tricaine צריך לשמש כדי להבטיח כליאה של העובר.

Tricaine רגיש לטמפרטורות מעל 30 מעלות צלזיוס, ויכול גם להיות מדולל על ידי הבינוני בחדר ההדמיה, מה שמוביל לירידה בביצועים ומתעוות האפשרית של העובר. לפיכך, הקפד גם להשתמש Tricaine במדיום ההדמיה שבדגימה רכוב היא שקועה. אם הניסויים שלך דורשים שימוש גבוה יותרטמפרטורות, אנו ממליצים להחליף את המדיום בחדר ההדמיה או כל הזמן על ידי שימוש במערכת זלוף או ידני עם צינור ומזרק בין שתי נקודות זמן.

שלבים קריטיים

השלבים הקריטיים בתהליך של הרכבת מדגם הם הצריכה של הדגימה לתוך הצינור וההחדרה של תקע agarose. הצריכה מגדירה את עמדתו הראשונית של העובר, שהוא מסורבל לשנות לאחר מכן. דגימות מרובות צריכה להיות זמינות לעלות וצריכה להיות במעקב באיכות ההרכבה עם סטראו. אם כיוון המדגם אינו משביע רצון, לשנות את המהירות של ציור את הדגימה והימנעות התנועות הבאות של הבוכנה עשוי לעזור כמו זה לעתים קרובות מסובב את העובר. 1.5% תקע agarose הוא הכרחי כדי למנוע דליפה של agarose .0.1%. פני השטח של התקע בתוך הצינור צריך להיות שטוחים לא להשפיע על הנטייה המדגם במהלך פיתוח. כדי להשיג גלישה טובהאס, בעוביים שונים של שכבות agarose צריכים להיבדק והצינור צריך להיות הכניס לתוך agarose הרגיל אל פני השטח. מסתובב הצינור קצת ומוציא את הצינור משחרר בזהירות את התקע מהצלחת. איכות ההרכבה יש לבדוק עם סטראו לפני ההדמיה.

הדמיה Multiview

אחד יתרונות גדולים של מיקרוסקופיה גיליון אור הוא ההדמיה Multiview, היכולת לסובב את הדגימה, לרכוש Z-ערימות מזוויות מרובות ולאחר מכן להירשם ולמזג אותם. שיטה הוקמה לרשום Z-הערימות בחלל 3D היא רישום מבוסס חרוז באמצעות חרוזי ניאון המקיפים את המדגם כסמני אמונים 17. שיטה זו אך מסתמכת על הרכבה בינונית מוצקה כגון agarose 1.5% ונראה אפוא להיות בקנה אחד עם multilayer הרכבה שהוצג כאן. אבל כמה פתרונות חלופיים לעבוד בהתאם ליישום. ראשית, חרוזי הניאון יכוליםישולב בתקע agarose, שצריך להיות בשדה הראייה במהלך הרכישה. שנית, יכולות להיות מכוילים עמדות השלב שלפני הניסויים בפועל באמצעות טור agarose 1.5% עם חרוזי ניאון. שלישית, ניתן להשתמש בם סמנים חלופיים כגון גרעיני ניאון כדי לזהות את המיקום של Z-הערימות יחסית זה לזה.

התאדות

setups מיקרוסקופיה גיליון האור אופייני להשתמש מדגם חדר פתוח, מה שמוביל לאידוי הבלתי נמנע של המדיום. מאז המדיום הוא חיוני להישרדותה של הדגימה, כדי להגביל את האידוי של מדיום ההרכבה ולמקדם השבירה הנכונה בין אופטיקה ומדגם, אנו ממליצים לקחת אחד או יותר מהאמצעים הבאים כדי למנוע אידוי. ראשית, בינוני בתא ניתן להחליף כל הזמן על ידי מערכת זלוף. שנית, המדיום יכול להיות ומילא באופן ידני. שלישית, התא יכול להיות מכוסה במכסה או בנייר כסף גמיש.

FEP הפולימר פותח כדי לעמוד במגוון רחב של חומרים כימיים ולכן הוא חזק, אינרטי מבחינה כימית וnonpermeable לגז. במקרה של חמצן רב שכבתי הרכבה יכולה רק לחדור דרך תקע agarose וממשק agarose באוויר, אבל זה עדיין לא הראה אם ​​אספקת החמצן בהרכבה רב שכבתית היא בחומרה נמוכה יותר בהשוואה להתקנה ב1.5% agarose מבלי לתמוך בצינור פולימר. עם זאת, כמו בהרכבת agarose 1.5% יכולים לשמש רק כשעתיים לפני מורפולוגיה דג הזברה מושפעת הרכבה רב שכבתית נראה שיש הפתרון מעולה הכולל הדמיה לטווח ארוך.

הדמיה בשלבים מוקדמים יותר של פיתוח

רב שכבתי והרכבה הפכה כעת טכניקת ההטבעה סטנדרטית שלנו למיקרוסקופיה גיליון אור הזמן לשגות של hpf מבוגרת מ24 דג הזברה. חוץ מזה, אנחנו גם להשתמש בצינורות הפולימר להדמיה של עוברי שלב מוקדם יותר. הדוארmbryos להישאר בchorions והם רכובים בצינור FEP עם קוטר פנימי של 1 מ"מ ומלא E3. דג הזברה יכולה לפתח בחופשיות בתוך סיסית ועדיין יכולה להיות צילמה גם באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור.

השקפה

הרכבת המדגם רב שכבתי הציגה משחררת את מלוא הפוטנציאל של מיקרוסקופיה גיליון אור לביולוגיה התפתחותית בזמן אמת עם דג הזברה. זה יכול בקלות להיות מאומץ על שיטות מיקרוסקופיה אחרות כגון טומוגרפיה אופטית הקרנה (OPT) ואורגניזמים אחרים. אנו מאמינים כי צינורות FEP בגודל הסטנדרטי הם רק הצעדים הראשונים לקראת מדגם טכניקות הרכבה המותאמת לצרכי ספציפיים.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לאגודת מקס פלנק, תכנית Frontier אדם המדע (HFSP) וBoehringer Ingelheim Fonds למימון ותמיכה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes Bola S 1815-04 0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe B. Braun Melsungen AG 9161406 V
Sterican Single-Use Cannula, blunt B. Braun Melsungen AG 9180109 0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH 
70% EtOH
Methylcellulose Sigma M0387 supplied as powder
E3 medium (for zebrafish embryos)
1.5 ml Reaction Tube Eppendorf 3810X
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414 supplied as powder
Petri Dish Greiner 633180 plastic, 94 mm x 16 mm
Tricaine Sigma E10521 synonyms:  Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate 
10X/0.3 W Microscope Objective Lens Leica HCX APO L
EMCCD Camera Andor Technology iXon 885 EMCCD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136, (12), 1963-1975 (2009).
  2. Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nat. Methods. 10, (5), 413-420 (2013).
  3. Swoger, J., Muzzopappa, M., López-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J. Biophoton. 4, (1-2), 122-134 (2011).
  4. Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J. Biophoton. 1-11 (2012).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, (5), 566-572 (2011).
  6. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, (5686), 1007-1009 (2004).
  7. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Prot. 2010, (5), (2010).
  8. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 18, (6), 624-632 (2008).
  9. Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. A versatile sample holder for single plane illumination microscopy. J. Microsc. 10, (2013).
  10. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, (17), 3242-3247 (2012).
  11. Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. Oxford University Press. (2002).
  12. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  13. Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. R. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, (23), 5199-5209 (2005).
  14. Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development. Dev. Genes Evol. 211, (12), 603-610 (2001).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  16. Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33, (2), 313-317 (1975).
  17. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).More

Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter