Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

बहुपरत Zebrafish की लंबे समय तक लाइट शीट माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते

doi: 10.3791/51119 Published: February 27, 2014

Summary

zebrafish के विकास भ्रूण कम एकाग्रता agarose के साथ ऑप्टिकली स्पष्ट बहुलक ट्यूब में एम्बेडेड रहे हैं जब प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के साथ दिन भर में पीछा किया जा सकता.

Abstract

हल्की चादर माइक्रोस्कोपी zebrafish भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए आदर्श इमेजिंग तकनीक है. कारण न्यूनतम फोटो विषाक्तता और विरंजन के लिए, यह विशेष रूप से कई दिनों तक कई घंटे से अधिक लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग के लिए अनुकूल है. हालांकि, एक उपयुक्त नमूना बढ़ते रणनीति कारावास और नमूना के सामान्य विकास दोनों प्रदान करता है कि जरूरत है. बहुपरत बढ़ते, ऑप्टिकली स्पष्ट ट्यूबों में कम एकाग्रता agarose का उपयोग कर एक नया एम्बेडिंग तकनीक, अब इस सीमा को पार करता है और वास्तविक समय विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी की पूरी क्षमता unleashes.

Introduction

Embryogenesis दौरान जटिल घटनाओं और समझने की बातचीत, विकास जीव विज्ञान में अनुसंधान को अधिक से अधिक संपूर्ण जीवों के vivo इमेजिंग के लिए एकल कोशिकाओं और अंगों के माइक्रोस्कोपी से बढ़ रहा है. पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तकनीक आमतौर पर समय की एक लंबी अवधि में तेजी की घटनाओं का पालन करने के लिए स्थानिक और अस्थायी समाधान की पेशकश करने में विफल रहता है और अक्सर विरंजन या नमूना 1 में phototoxic प्रभाव के कारण. हम और दूसरों को प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) zebrafish 2-4 के vivo इमेजिंग के लिए आदर्श तकनीक हो पाया. पता लगाने के अक्ष के orthogonal लेज़र प्रकाश की एक पतली शीट, नमूने के साथ रोशनी उच्च स्थानिक संकल्प के साथ ही कम से कम फोटो विषाक्तता 5 के साथ तेजी से ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्रदान करता है. इसी समय, इस वजह से यह अद्वितीय ऑप्टिकल व्यवस्था करने, पेट्री डिश या संस्कृति कक्षों का उपयोग पारंपरिक नमूना बढ़ते तकनीक उपयुक्त नहीं हैं. एक ठेठ प्रकाश मेंचादर माइक्रोस्कोप तीन translational मोटर्स और एक घूर्णी मोटर यह ठीक तैनात किया जा सकता है कि इस तरह नमूना, पकड़, बदल दिया और किसी भी दिशा से देखा. पिछले नमूनों में प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए अक्सर एक गिलास केशिका 6,7 अंदर agarose 1-2% में एम्बेडेड किया गया है. इस मामले में एम्बेडेड नमूना के साथ जम agarose सिलेंडर इमेजिंग के लिए पानी की तरह मध्यम से भरा नमूना कक्ष में गिलास केशिका से बाहर चली जाती है. Agarose पानी के करीब एक अपवर्तनांक है और इसलिए पानी को सही रोशनी और पहचान प्रकाशिकी कि सुविधा में विवो प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए पूरी तरह से अनुकूल है. नमूना कठोर agarose में ही सीमित है और समय की एक छोटी अवधि के लिए अच्छी तरह से imaged किया जा सकता है, लेकिन कई घंटे 7,8 के लिए जब इमेजिंग morphogenetic परिवर्तन और भ्रूण के विकास को दृढ़ता से प्रभावित कर रहे हैं. अन्य अनुप्रयोगों के लिए समाधान noninvasive लंबी अवधि के समय चूक zebrafish, 9 विकसित किया गया है प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग क्षमता पारंपरिक 1.5% agarose एम्बेडिंग का उपयोग शोषण नहीं किया जा सकता.

इसलिए हम zebrafish भ्रूण 10 के vivo प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए एक नई बढ़ते रणनीति विकसित की है. नमूना ऑप्टिकली स्पष्ट बहुलक fluorinated ईथीलीन Propylene (FEP) से बना एक ट्यूब के अंदर 200 मिलीग्राम / एल Tricaine साथ agarose 0.1% से बढ़ गया है. एम्बेडेड भ्रूण की वजह से मध्यम की चिपचिपाहट कम करने के लिए सामान्य रूप से विकसित करता है. इसी समय, FEP ट्यूब प्रयोग की अवधि के लिए मध्यम और नमूना किनारा. यहाँ हम पारंपरिक प्रोटोकॉल पर अपने फायदे को दर्शाती नई बढ़ते तकनीक और वर्तमान डेटा की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. हम हमारे विधि zebrafish विकास के साथ लगातार दो दिन से ज्यादा की अवधि में उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान के साथ imaged किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है.

5in "के लिए: src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
चित्रा 1. प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का सिद्धांत. Fluorinated ईथीलीन Propylene (FEP) से बना एक ट्यूब में रखा एक zebrafish अनुवादित और पहचान उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ के माध्यम से घुमाया जा सकता है. लेजर प्रकाश (प्रकाश शीट) की एक पतली शीट का पता लगाने के उद्देश्य से केन्द्र विमान में रोशनी उद्देश्य से पेश किया है और नमूना की केवल एक पतली ऑप्टिकल अनुभाग illuminates है. उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने उद्देश्य से एकत्र की है और एक कैमरा चिप पर दर्ज की गई है.

Protocol

1. माल की तैयारी

  1. FEP ट्यूब की तैयारी
    1. ट्यूब के माध्यम से (नीचे नोट चरणों में) तरल पदार्थ निस्तब्धता और एक कुंद अंत प्रवेशनी (चित्रा 2 बी) के साथ जुड़ी एक सिरिंज का उपयोग करके FEP ट्यूब (2A चित्रा) स्वच्छ नोट 1:.. प्रक्रिया में उपयोग दस्ताने 2 नोट: हम अनुशंसा करते हैं सीए के टुकड़ों में काटने ट्यूब. 1 लंबाई में मीटर और समानांतर में उन सफाई.
      1. प्रथम बार बार 1 एम NaOH के साथ ट्यूब फ्लश. फिर 0.5 एम NaOH से भरा एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब ट्यूब हस्तांतरण और 10 मिनट के लिए यह ultrasonicate.
      2. DDH 2 ओ के साथ एक छोटा सा बेसिन के लिए बहुलक ट्यूब स्थानांतरण पहले DDH 2 हे के साथ और फिर 70% EtOH के साथ ट्यूब फ्लश.
      3. इसके बाद 70% EtOH के साथ एक ताजा अपकेंद्रित्र ट्यूब FEP ट्यूब हस्तांतरण. फिर 10 मिनट के लिए इस अपकेंद्रित्र ट्यूब ultrasonicate.
    2. टुकड़ों में साफ FEP ट्यूब कटयदि आवश्यक हो के बारे में 3 सेमी (zebrafish बढ़ते और इमेजिंग में उपयोग के लिए एक विशिष्ट लंबाई) और उन्हें सीधा. DDH 2(चित्रा -2) से भरा एक ताजा 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में साफ FEP ट्यूब स्टोर.
  2. Tricaine स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. 97.9 मिलीलीटर DDH 2 ओ में 400 मिलीग्राम Tricaine (एमएस-222) भंग करके 0.4% tricaine शेयर समाधान तैयार पाउडर पूरी तरह से भंग कर दिया है के बाद, 2.1 मिलीलीटर 1M Tris (पीएच 9.0) का उपयोग कर 7.0 पीएच को समायोजित. प्रकाश से समाधान को सुरक्षित रखें. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots
  3. 3% methylcellulose की तैयारी
    1. जैसा कि नीचे वर्णित FEP ट्यूब के भीतरी कोटिंग के लिए 3% methylcellulose समाधान तैयार करें. लगभग 60-70 डिग्री सेल्सियस के लिए एक कांच की बोतल में E3 11 तक गर्मी और methylcellulose पाउडर की उचित मात्रा में जोड़ें. एक भावप्रवण पट्टी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर हलचल जैसे ही समाधान 30 डिग्री सेल्सियस से नीचे करने के लिए नीचे ठंडा किया जाता है, के रूप में एक अंतिम करने के लिए ग Tricaine समाधान जोड़नेoncentration 100 मिलीग्राम / एल 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर सरगर्मी रखें.
  4. 1.5% की तैयारी और E3 में 0.1% agarose
    1. एक ग्लास कुप्पी में E3 का एक निर्धारित मात्रा में कम पिघलने बिंदु agarose पाउडर की उचित मात्रा में भंग. एक माइक्रोवेव में मिश्रण गर्मी और agarose समाधान सजातीय प्रकट होता है जब तक किसी भी शेष क्रिस्टल के बिना, एक समय में एक बार इसे हिला.
    2. 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में 0.1% agarose समाधान के 1 मिलीलीटर aliquots तैयार करें. aliquots 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता
    3. कोट एक प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए 1.5% समाधान का प्रयोग करें. agarose परत की मोटाई सीए होना चाहिए. 2 मिमी. Agarose जम जाने के बाद, सुखाने से रोकने के लिए परत के ऊपर E3 के माध्यम जोड़ें. लेपित पकवान 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता
  5. Zebrafish की तैयारी
    1. स्थापित प्रोटोकॉल 11,12 के अनुसार 28.5 डिग्री सेल्सियस पर Zebrafish (Danio rerio) वयस्क और भ्रूण रखें और उन्हें संभाल.
    2. दोपहर में पुरुष और महिला मछली की स्थापना की और एक विभक्त का उपयोग कर उन्हें अलग. मछली के संभोग के समय की अगली सुबह विभक्त निकालें.
    3. E3 से भरा एक थाली में भ्रूण लीजिए और एक stereomicroscope का उपयोग कर उन्हें जांच.
    4. 24 HPF (या अपने हित के विकास के चरण) में, प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति के लिए zebrafish भ्रूण का चयन करें और ताजा E3 के साथ एक नई डिश के लिए सकारात्मक लोगों के हस्तांतरण.
    5. ध्यान से दो तेज संदंश (आंकड़े 2 डी और 2 ई) का उपयोग भ्रूण dechorionate. इसे खोलने के आंसू और इसे हटा जरायु और दूसरा संदंश हड़पने और धारण करने वाले पहले संदंश का प्रयोग करें 1 नोट:. एक stereomicroscope की मदद से इस चरण को पूरा.

2. बहुपरत बढ़ते

  1. FEP ट्यूब कोटिंग
    1. एक सिरिंज एक कुंद अंत प्रवेशनी देते हैं. एक साफ के एक छोर में के बारे में 3 मिमी के लिए ध्यान से प्रवेशनी डालें और का टुकड़ा काट. में इस्तेमाल दस्ताने और ट्यूब के किसी भी झुकने या निचोड़ से बचने: FEP ट्यूब (आंकड़े 2 एफ और 2 जी) नोट 1.
    2. 3% methylcellulose में FEP ट्यूब के मुक्त अंत डुबकी और समाधान के साथ ट्यूब भरना.
    3. धीरे धीरे सिरिंज पर धकेलने के द्वारा methylcellulose जारी. समाधान त्यागें.
    4. . दोहराएँ E3 नोट 1 का उपयोग कर 2.1.2 और 2.1.3 चरण: लेपित ट्यूब तुरंत बढ़ते के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  2. Agarose को zebrafish स्थानांतरित कर रहा है
    1. एक गर्मी ब्लॉक में 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 0.1% agarose के एक विभाज्य गर्मी. भंवर प्रतिक्रिया ट्यूब संक्षिप्त और 38 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2H) करने के लिए सेट एक गर्मी ब्लॉक को हस्तांतरण.
    2. गर्मी ब्लॉक से बाहर प्रतिक्रिया ट्यूब ले लो और यह संक्षिप्त शांत हो जाओ. फिर 133-200 मिलीग्राम / एल और भंवर के अंतिम एकाग्रता (चित्रा 2I) को Tricaine जोड़ें.
    3. Dechorionated zebrafish भ्रूण में से एक है और transfe का चयन करें. आर यह एक गिलास पाश्चर पिपेट (आंकड़े 2j और 2k) का उपयोग तीखा 0.1% agarose के साथ प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए 1 नोट: जितना संभव हो कम अतिरिक्त E3 स्थानांतरित करने के लिए प्रयास करें.
  3. Zebrafish बढ़ते
    1. सिरिंज संलग्न FEP ट्यूब (चित्रा 2L) के साथ भ्रूण को ले लो. . ट्यूब ट्यूब के दोनों छोर के करीब तैनात भ्रूण के साथ और सिर ट्यूब के उद्घाटन की ओर इशारा करते हुए के साथ, 0.1% agarose के साथ पूरी तरह से भरा होना चाहिए 1 नोट: मछली लेने से पहले कुछ agarose लेने के लिए सुनिश्चित करें. नोट 2: बुलबुले से बचने के लिए सिरिंज पर बहुत धीरे से खींच नोट 3:. उसकी सामग्री (आंकड़े 2M और 2n) के रिसाव से बचने के लिए एक क्षैतिज अभिविन्यास में ट्यूब रखें.
  4. ट्यूब Plugging
    चित्रा 2
    चित्रा 2. बहुपरत zebrafish भ्रूण के लिए बढ़ते. ए) Fluorinated ईथीलीन Propylene तैयारी. बी से पहले एक केबल ड्रम पर (FEP) ट्यूब) संलग्न एक कुंद अंत प्रवेशनी के साथ एक सिरिंज. ग) एक साफ और FEP ट्यूब. डी, 24 HPF की ई) dechorionation कटौती पिघल की एक प्रतिक्रिया ट्यूब के अंदर agarose 0.1% एक गर्मी ब्लॉक को स्थानांतरित करते हुए की zebrafish भ्रूण. एफ) कुंद अंत प्रवेशनी ट्यूब संलग्न. जी) प्रवेशनी और ट्यूब जुड़ी साथ सिरिंज. एच) एक विभाज्य. मैं) vortexing FEP ट्यूब. एम, एन) में agarose आसपास के साथ पिघल agarose भ्रूण की. एल) का सेवन में भ्रूण का एक गिलास पिपेट का उपयोग कर एक dechorionated भ्रूण की agarose. जे) तेज. कश्मीर) स्थानांतरण FEP ट्यूब के अंदर zebrafish भ्रूण . Plugging) नमूना और प्रवेशनी. पी के बीच ट्यूब काटना. क्यू) भ्रूण खामियों को दूर ट्यूब. आर) के एक धातु धारक में अंतिम नमूना तैयारी के अंदर. के लिए क्लिक करें बड़ी छवि को देखने.
    1. प्रवेशनी (चित्रा 2O) बंद ट्यूब कटौती करने के लिए एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करें.
    2. धीरे ट्यूब (चित्रा 2P) प्लग करने के लिए प्लास्टिक पकवान में 1.5% agarose की पूरी परत के माध्यम से मछली युक्त ट्यूब के अंत छड़ी नोट 1:. बुलबुले के गठन से बचने और पकड़ कर एक सीधे प्लग सतह प्राप्त करने की कोशिश . ट्यूब बिल्कुल सीधा agarose सतह के लिए नोट 2: थोड़ा एक अच्छा प्लग प्राप्त करने के लिए ट्यूब घुमाएँ.
    3. सुखाने से बचने के लिए E3 के साथ एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में घुड़सवार नमूना रखें. नमूना n हैimaged होने के लिए तैयार ओ. इमेजिंग से पहले, मछली प्लग (आंकड़े 2Q और 2R) के शीर्ष पर सही बैठा है या नहीं. भी बढ़ते मध्यम के रूप में ही एकाग्रता में इमेजिंग कक्ष के अंदर मध्यम करने Tricaine जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें.

Representative Results

Zebrafish vasculature विकास की multiday इमेजिंग

लंबे समय तक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए बहुपरत बढ़ते रणनीति के फायदे प्रदर्शित करने के लिए 13 zebrafish: हम (GFP kdrl) टीजी DPF 1 का उपयोग करें. उद्देश्य छवि के लिए 2 दिनों के पाठ्यक्रम पर पूरे zebrafish में वाहिका संरचना के विकास है. zebrafish भ्रूण एक methylcellulose लेपित बहुलक ट्यूब के अंदर agarose 0.1% में रखा गया था. इधर, zebrafish बढ़ते मध्यम द्वारा ही सीमित नहीं है और सामान्य रूप से विकसित कर सकते हैं. इसका प्रधान पूंछ (चित्रा 3) फैली हुई है और नाड़ी अंकुरण निर्बाध दिखाई देता है, उठाती है.

चित्रा 3
चित्रा 3. Zebrafish वाहिका संरचना के विकास की multiday इमेजिंग. एक multila की vasculature13 zebrafish दो दिनों के पाठ्यक्रम पर एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप में निर्बाध विकसित: yer (GFP kdrl) टीजी DPF 1 घुड़सवार. एक 488 एनएम लेजर प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति उत्साहित और संकेत 10X/0.3 डब्ल्यू उद्देश्य और एक EMCCD कैमरे का उपयोग कर पाया गया. Z-ढेर चार आसन्न स्थितियों को हर 10 मिनट पर हासिल कर लिया और बाद में फिजी 15 के साथ सिले थे. समय अंक की एक सबसेट की अधिकतम तीव्रता के अनुमानों से पता चला रहे हैं. स्केल बार:. 500 माइक्रोन बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

प्रारंभिक Zebrafish embryogenesis की इमेजिंग

यहाँ, हम निषेचन के बाद पहले दिन के दौरान जल्दी zebrafish embryogenesis के प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए एक बढ़ते समर्थन के रूप में FEP ट्यूब की क्षमता प्रदर्शित करता है. 8 HPF टीजी (H2A: GFP) के 14 zebrafish भ्रूण एक मैं के साथ एक E3 से भरे ट्यूब के अंदर इसकी बरकरार जरायु के साथ रखा गया था1 मिमी की nner व्यास. यही जरायु की एक छोटी सी clamping में यह परिणाम है. Embryogenesis दौरान सभी विकास की प्रक्रिया बढ़ते से अप्रभावित रहे हैं और बेहतर प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना की जा सकती है. इस उदाहरण में, हम 12 घंटे की एक पाठ्यक्रम (चित्रा 4) से अधिक नमूना imaged. 1.5% agarose में जरायु बिना पारंपरिक बढ़ते उपयोग करते समय इस तरह की जर्दी और midline साथ ऊतक का उमड़ना की बढ़ती बढ़ाव के रूप में जल्दी embryogenesis दौरान विशिष्ट आकार में परिवर्तन, अत्याचार किया जाएगा.

चित्रा 4
. जल्दी zebrafish embryogenesis के चित्रा 4 इमेजिंग टीजी (H2A: GFP). 14 zebrafish जल्दी embryogenesis से होकर गुजरता है. एक 488 एनएम लेजर प्रकाश चादर उत्साहित GFP और प्रतिदीप्ति संकेत का पता चला थाएक 10X/0.3 डब्ल्यू उद्देश्य और एक EMCCD कैमरे के साथ. दो कोणों से Z-ढेर 12 घंटा के एक कोर्स पर हर 3 मिनट हासिल किया गया. समय चूक की एक सबसेट की सामान्यीकृत अधिकतम तीव्रता के अनुमानों से पता चला रहे हैं. कोई संवेदनाहारी इस्तेमाल किया गया के रूप में अधिग्रहण के दौरान भ्रूण हिल से 19 HPF परिणामों पर दिखाई गति धब्बा,. स्केल बार:. 150 माइक्रोन बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

जैसे प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के रूप में विकसित माइक्रोस्कोपी तकनीक कई दिनों के पाठ्यक्रम पर उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ छवि डेटा रिकॉर्ड करने के लिए सक्षम है, लेकिन यह भी बेहतर बनाने के लिए नमूना बढ़ते तकनीक की आवश्यकता होती है. हम zebrafish विकास का प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते बहुपरत की एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे. विधि को लागू करने के लिए सरल है और हम एक दैनिक आधार पर हमारी प्रयोगशाला में इसका इस्तेमाल करते हैं.

FEP ट्यूब

हमारे बढ़ते रणनीति के प्रमुख घटक बहुलक Fluorinated ईथीलीन Propylene (FEP) से बना ट्यूब हैं. हम इसका मुख्य कारण पानी के समान हैं और इसलिए आदर्श पानी की सूई उद्देश्यों और जलीय मीडिया की आवश्यकता होती है नमूना के साथ प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए अनुकूल है जो 1.338 के अपने अपवर्तनांक, के FEP का उपयोग करने का फैसला किया. 0.8 मिमी भीतरी व्यास और 0.4 मिमी दीवार मोटाई बहुत अच्छी तरह से विकसित zebrafish फिट साथ ट्यूब, 1.6 मिमी के लिए अनुकूल ठेठ नमूना धारकों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैकेशिकाओं और प्रस्तुत बढ़ते विधि के लिए हमारी पहली पसंद हैं. हम अपने घर में निर्मित setups में के रूप में अच्छी तरह से व्यावसायिक प्रणाली कार्ल जीस माइक्रोस्कोपी द्वारा "Lightsheet Z.1" में उन्हें अच्छी तरह से परीक्षण किया और FEP ट्यूब, दीर्घकालिक स्थिरता की पेशकश ऑप्टिकल प्रदर्शन पर केवल न्यूनतम प्रभाव पड़ता है और nonfluorescent 10 हो पाया. उन्होंने, हालांकि, जैसे नमूना मंजूरी दे दी एक अलग अपवर्तनांक, आवश्यकता है कि नमूनों के साथ अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हैं.

ट्यूब के साथ ही FEP से बना foils व्यास और मोटाई की एक किस्म में उपलब्ध हैं. इसके अलावा, FEP 260 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाया जाता है और इस प्रकार कस्टम बनाया नमूना बढ़ते समर्थन के लिए लगभग अंतहीन संभावनाएं प्रदान किया जा सकता है. बहुलक ट्यूब सफाई प्रोटोकॉल सबसे अच्छा ऑप्टिकल गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए कई कदम शामिल है, जिसके कारण nonsterile आपूर्ति हो जाते हैं. methylcellulose साथ कोटिंग से बढ़ zebrafish भ्रूण का कोई हिस्सा बहुलक से चिपक सुनिश्चित करता है.

0.1% agarose के लिए निर्णय agarose और methylcellulose 10 के विभिन्न सांद्रता में वृद्धि दर और गतिहीनता की व्यापक परीक्षण पर आधारित है. 0.1% ऊपर agarose सांद्रता पहले से ही 24 HPF zebrafish की विकास दर पर एक गंभीर प्रभाव दिखाया. इसके अलावा हम anesthetizing दवा Tricaine की कम खुराक का उपयोग करें. Tricaine ब्लॉक कार्रवाई क्षमता है, इस प्रकार मस्तिष्क और मांसपेशियों के बीच संकेत संचरण को रोकता है और मांसपेशियों के संकुचन 16 दबा. 133-200 मिलीग्राम / एल के एक एकाग्रता 24-72 HPF के बीच zebrafish के पर्याप्त स्थिरीकरण सुनिश्चित करता है. हालांकि, Tricaine और अन्य anesthetizing दवाओं हम इस तरह के हृदय शोफ के रूप में दिखाने खुराक निर्भर पक्ष प्रभाव का परीक्षण किया. इसके अतिरिक्त Tricaine की खुराक भ्रूण के विकास के चरण के साथ बदलता रहता है. इसलिए हम imaged हैं कि विकास के चरणों के लिए आवश्यक राशि को Tricaine एकाग्रता को कम करने की सलाह देते हैं. सर्वश्रेष्ठ performan सुनिश्चित करने के लिएCE और द्वारा उत्पादों विषाक्त के गठन को रोकने, हौसले से तैयार या defrosted Tricaine शेयर समाधान, प्रयोग प्रकाश से सुरक्षित है और 30 डिग्री सेल्सियस के ऊपर गर्म नहीं होना चाहिए

FEP ट्यूब में एम्बेड भी विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए खाते में बढ़ते मध्यम के लिए आसान संशोधन के लिए अनुमति देता है. दिल का समय चूक इमेजिंग के लिए, हम 3% methylcellulose और 100 मिलीग्राम / एल Tricaine के बजाय 0.1% agarose और बढ़ते के लिए 200 मिलीग्राम / एल का उपयोग करना चाहिये. Methylcellulose 0.1% agarose इस प्रकार अपने दम पर उच्च गतिहीनता उपलब्ध कराने और कम Tricaine भ्रूण के कारावास सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा जरूरत से ज्यादा चिपचिपा है.

Tricaine 30 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान के प्रति संवेदनशील है और भी प्रदर्शन और भ्रूण के संभावित दुर्घटना की कमी हुई करने के लिए अग्रणी इमेजिंग कक्ष में मध्यम से पतला किया जा सकता है. इसलिए, घुड़सवार नमूना डूब जाता है जिसमें इमेजिंग मध्यम में भी Tricaine उपयोग सुनिश्चित करें. अपने प्रयोगों उच्च के उपयोग की आवश्यकता होती हैतापमान, हम लगातार एक छिड़काव प्रणाली का उपयोग करके या मैन्युअल दो समय अंक के बीच एक ट्यूब और एक सिरिंज के साथ या तो इमेजिंग कक्ष में मध्यम आदान प्रदान की सलाह देते हैं.

महत्वपूर्ण कदम

नमूना बढ़ते की प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण कदम ट्यूब में नमूना के सेवन और agarose प्लग की प्रविष्टि कर रहे हैं. सेवन बाद में परिवर्तित करने के लिए बोझिल है, जो भ्रूण की आरंभिक स्थिति को परिभाषित करता है. एकाधिक नमूनों माउंट करने के लिए उपलब्ध होना चाहिए और बढ़ते गुणवत्ता एक stereomicroscope साथ निगरानी की जानी चाहिए. नमूना अभिविन्यास संतोषजनक नहीं है, तो इस बार भ्रूण twists के रूप में, नमूना तैयार करने और सवार के बाद आंदोलनों से बचने की गति फेरबदल मदद मिल सकती है. 1.5% agarose प्लग 0.1% agarose के रिसाव से बचने के लिए आवश्यक है. ट्यूब के अंदर प्लग की सतह के विकास के दौरान नमूना उन्मुखीकरण को प्रभावित नहीं करने के लिए फ्लैट होना चाहिए. एक अच्छा सर्फ प्राप्त करने के लिएइक्का, agarose परतों के विभिन्न मोटाई का परीक्षण करने की आवश्यकता है और ट्यूब सतह के लिए सामान्य agarose में रखा जाना चाहिए. ट्यूब थोड़ा सा घुमाना और ट्यूब बाहर खींच ध्यान से पकवान से प्लग विज्ञप्ति. बढ़ते की गुणवत्ता इमेजिंग से पहले एक stereomicroscope साथ जाँच की जानी चाहिए.

Multiview इमेजिंग

प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का एक प्रमुख लाभ MultiView इमेजिंग,, नमूना बारी बारी से कई कोणों से Z-ढेर अधिग्रहण और बाद में रजिस्टर और उन्हें फ्यूज करने की क्षमता है. 3 डी अंतरिक्ष में Z-ढेर रजिस्टर करने के लिए एक स्थापित विधि प्रत्ययी मार्कर के रूप में 17 नमूना आसपास के फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग मनका आधारित पंजीकरण है. इस विधि हालांकि ऐसे 1.5% agarose के रूप में एक ठोस बढ़ते मध्यम पर निर्भर करता है और इस प्रकार बहुपरत यहाँ प्रस्तुत बढ़ते के साथ असंगत प्रतीत हो रहा है. लेकिन कई वैकल्पिक समाधान आवेदन के आधार पर काम करते हैं. सबसे पहले, फ्लोरोसेंट मोती कर सकते हैंअधिग्रहण के दौरान देखने के क्षेत्र में हो गया है जो agarose प्लग, में शामिल किया. दूसरा, मंच पदों फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एक 1.5% agarose स्तंभ का उपयोग वास्तविक प्रयोगों से पहले calibrated किया जा सकता है. तीसरा, जैसे फ्लोरोसेंट नाभिक के रूप में वैकल्पिक मार्कर एक दूसरे के सापेक्ष Z-ढेर की स्थिति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

वाष्पीकरण

ठेठ प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी setups के माध्यम के वाष्पीकरण के लिए एक खुला नमूना कक्ष, जो अपरिहार्य सुराग का उपयोग करें. मध्यम बढ़ते मध्यम के वाष्पीकरण को प्रतिबंधित करने के लिए नमूना के अस्तित्व के लिए और प्रकाशिकी और नमूने के बीच सही अपवर्तनांक के लिए आवश्यक है, हम वाष्पीकरण को रोकने के लिए निम्न उपायों में से एक या एक से अधिक लेने की सलाह देते हैं. सबसे पहले, चैम्बर में मध्यम लगातार एक छिड़काव प्रणाली से विमर्श किया जा सकता है. दूसरा, मध्यम मैन्युअल रूप refilled किया जा सकता है. तीसरा, चैम्बर एक ढक्कन या एक लचीला पन्नी के साथ कवर किया जा सकता है.

बहुलक FEP रसायनों का एक बड़ा विभिन्न प्रकार का सामना करने के लिए विकसित और, इसलिए मजबूत रासायनिक निष्क्रिय और गैस के लिए nonpermeable हो गया है. बहुपरत बढ़ते ऑक्सीजन के मामले में केवल agarose प्लग और agarose हवा अंतरफलक के माध्यम से प्रवेश, लेकिन बहुलक ट्यूब समर्थन के बिना agarose 1.5% में बढ़ते की तुलना में जब बहुपरत बढ़ते में ऑक्सीजन की आपूर्ति गंभीर रूप से कम है, तो यह दिखाया जाना बना रहता है सकते हैं. Zebrafish आकारिकी बहुपरत बढ़ते प्रभावित है हालांकि, इससे पहले 1.5% agarose में बढ़ते के रूप में के बारे में केवल दो घंटे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लंबे समय तक इमेजिंग के लिए समग्र बेहतर समाधान हो रहा है.

विकास के पहले चरण इमेजिंग

बढ़ते बहुपरत अब zebrafish से अधिक उम्र के 24 HPF के समय चूक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए हमारे मानक एम्बेडिंग तकनीक बन गया है. इसके अलावा, हम भी पहले चरण भ्रूण की इमेजिंग के लिए बहुलक ट्यूब का उपयोग करें. ईmbryos उनके chorions में रहते हैं और 1 मिमी की एक आंतरिक व्यास के साथ एक FEP ट्यूब में घुड़सवार और E3 से भर रहे हैं. zebrafish आज़ादी से जरायु के अंदर विकसित कर सकते हैं और अभी भी अच्छी तरह से प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged किया जा सकता है.

दृष्टिकोण

प्रस्तुत बहुपरत नमूना बढ़ते zebrafish साथ वास्तविक समय विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी की पूरी क्षमता unleashes. यह आसानी से इस तरह के ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी (ऑप्ट) और अन्य जीवों के रूप में अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए अपनाया जा सकता है. हम मानक आकार FEP ट्यूब विशिष्ट जरूरतों के लिए सिलवाया नमूना बढ़ते तकनीक की दिशा में सिर्फ पहला कदम है कि विश्वास करते हैं.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम धन और समर्थन के लिए मैक्स प्लैंक सोसायटी, मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (HFSP) और Boehringer Ingelheim Fonds धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes Bola S 1815-04 0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe B. Braun Melsungen AG 9161406 V
Sterican Single-Use Cannula, blunt B. Braun Melsungen AG 9180109 0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH 
70% EtOH
Methylcellulose Sigma M0387 supplied as powder
E3 medium (for zebrafish embryos)
1.5 ml Reaction Tube Eppendorf 3810X
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414 supplied as powder
Petri Dish Greiner 633180 plastic, 94 mm x 16 mm
Tricaine Sigma E10521 synonyms:  Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate 
10X/0.3 W Microscope Objective Lens Leica HCX APO L
EMCCD Camera Andor Technology iXon 885 EMCCD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136, (12), 1963-1975 (2009).
  2. Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nat. Methods. 10, (5), 413-420 (2013).
  3. Swoger, J., Muzzopappa, M., López-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J. Biophoton. 4, (1-2), 122-134 (2011).
  4. Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J. Biophoton. 1-11 (2012).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, (5), 566-572 (2011).
  6. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, (5686), 1007-1009 (2004).
  7. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Prot. 2010, (5), (2010).
  8. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 18, (6), 624-632 (2008).
  9. Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. A versatile sample holder for single plane illumination microscopy. J. Microsc. 10, (2013).
  10. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, (17), 3242-3247 (2012).
  11. Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. Oxford University Press. (2002).
  12. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  13. Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. R. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, (23), 5199-5209 (2005).
  14. Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development. Dev. Genes Evol. 211, (12), 603-610 (2001).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  16. Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33, (2), 313-317 (1975).
  17. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
बहुपरत Zebrafish की लंबे समय तक लाइट शीट माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).More

Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter