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Biology

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

doi: 10.3791/51119 Published: February 27, 2014

Summary

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

Abstract

빛 장 현미경은 제브라 피쉬 배아 발달을 연구하는 이상적인 이미징 기술입니다. 때문에 최소한의 사진 독성 및 표백에, 그것은 특히 몇 일까지 많은 시간에 걸쳐 장기적으로 시간 경과 영상에 적합합니다. 그러나, 적절한 샘플 설치 전략은 감금 및 샘플의 정상적인 발달을 모두 제공이 필요합니다. 다층 설치, 광학적으로 명확한 관에서 낮은 농도의 아가로 오스를 사용하여 새 임베딩 기술은 지금이 한계를 극복하고 실시간 발달 생물학에 대한 빛 시트 현미경의 잠재력을 소개하고 있습니다.

Introduction

배아 동안 복잡한 이벤트와 상호 작용을 이해하기 위해, 발달 생물학의 연구는 점점 더 전체 생물의 생체 내 이미징에 하나의 세포와 장기의 현미경에서 움직이고있다. 전통적인 현미경 기술은 일반적으로 장기간에 걸쳐 급속 이벤트를 수행하기 위해 공간 및 시간 해상도를 제공하지 종종 표백 또는 샘플 1에서 광독성 효과를 일으킨다. 우리와 다른 빛 시트 현미경 (그림 1) 제브라 피쉬 2-4의 생체 내 이미징을위한 이상적인 기술로 발견했다. 검출 축에 직교하는 레이저 광의 얇은 시트와 샘플의 조명은 높은 공간 해상도뿐만 아니라 최소화 광 독성 5 빠른 광학 절편을 제공한다. 동시에, 이로 인해 독특한 광학적 배치에, 페트리 접시 나 배양 챔버를 사용하여 기존의 시료 실장 기술은 적합하지 않다. 일반적인 빛시트 현미경 세 번역 모터 및 회전 모터가 정확하게 위치 할 수 있도록 샘플을, 보류, 설정 및 모든 방향에서 볼. 과거 표본 빛 시트 현미경 종종 유리 모세관 6,7 내부 아가로 오스 1 ~ 2 %에 포함되었다. 이 경우 임베디드 시편 고화 아가 실린더는 촬상 물 같은 매체로 채워진 샘플 챔버 내로 유리 모세관 밖으로 압출된다. 아가로 오스는 물에 가까운 굴절률을 가지므로 물 보정 조명 및 광학 검출을 용이하게 생체 빛 시트 현미경 완벽하게 적합합니다. 샘플 경질 아가 로스에 국한되어 짧은 시간 동안 잘 묘화 될 수 있지만, 몇 시간 7,8위한 묘화 형태 발생 때 변경 및 배아의 성장을 강력하게 손상된다. 다른 응용 프로그램에 대한 솔루션은 비 침습적 장기 시간 경과 제브라 피쉬에게 9을 개발되었지만 광 시트 현미경 촬상 전위는 종래의 1.5 % 아가로 오스를 매립하여 악용 할 수 없습니다.

따라서 우리는 zebrafish의 배아 (10)의 생체 빛 시트 현미경을위한 새로운 설치 전략을 개발했다. 샘플을 광학적으로 맑은 중합체 불소화 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 관 안쪽 200 ㎎ / L의 Tricaine으로 0.1 % 아가로 오스에 장착된다. 내장 된 배아 인해 매체의 저점에 일반적으로 개발하고 있습니다. 동시에, FEP 튜브는 실험 기간에 대한 중간 샘플을 한정한다. 여기에서 우리는 기존의 프로토콜을 통해 장점을 반영하는 새로운 설치 기술 및 현재 데이터의 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 우리의 방법 지브라 피쉬 개발하여 연속 이틀 이상에 걸쳐 높은 공간 및 시간 해상도로 묘화 될 수 있음을 보여준다.

5 인치 "FO : SRC ="/ files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "SRC ="/ files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
도 1. 광 시트 현미경의 원리. 불소화 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 튜브 내에 장착 지브라 피쉬는 번역 및 검출 목적의 초점 평면을 통해 회전 될 수있다. 레이저 광 (빛 시트)의 얇은 시트를 검출 목적의 초점면에 조명 목적에 의해 계획 및 시편의 두께가 얇은 광학 부분을 조명한다. 방출 된 형광 신호를 검출 대물 의해 수집하고 카메라 칩에 기록된다.

Protocol

1. 재료 준비

  1. FEP 튜브의 제조
    1. 튜브를 통해 (아래에 언급 된 단계에서) 액체를 세척하고 뭉툭한 끝 정맥 (그림 2B)에 부착 된 주사기를 사용하여 FEP 튜브 (그림 2A)를 청소 주 1 :.. 절차 전반에 걸쳐 사용 장갑을 주 2 : 우리는 추천 캘리포니아의 조각에 튜브를 절단. 1 m 세로 병렬 사람들을 청소.
      1. 첫 번째 반복 1 M NaOH로 튜브를 세척하십시오. 그런 다음 0.5 M NaOH로 가득 50 ML의 원심 분리기 튜브에 튜브를 전송하고 10 분 정도를 초음파 처리.
      2. DDH 2 O와 작은 분지에 폴리머 튜브를 이동 첫 번째 DDH 2 O로하고 70 % EtOH로 튜브를 세척합니다.
      3. 그 후 70 % EtOH로 신선한 원심 분리 관에 FEP 튜브를 전송합니다. 다시 10 분 동안 원심 분리기 튜브를 초음파 처리.
    2. 조각으로 청소 FEP 튜브를 절단필요한 경우의 약 3 센티미터 (제브라 피쉬의 설치 및 이미징에 사용되는 일반적인 길이)와 똑 바르게. DDH 2 O (그림 2C)로 가득 찬 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브의 청소 FEP 튜브를 저장합니다.
  2. Tricaine 원액의 제조
    1. 97.9 밀리리터 DDH 2 O.에서 400 밀리그램의 Tricaine (MS-222)을 용해하여 0.4 % Tricaine 주식 솔루션을 준비합니다 분말이 완전히 용해 후, 2.1 ㎖의 1M 트리스 (pH를 9.0)을 사용하여 7.0의 pH를 조정한다. 빛으로부터 솔루션을 보호합니다. -20 ° C에서 저장 분주
  3. 3 % 메틸 셀룰로오스의 제조
    1. 후술하는 바와 같이 FEP 튜브의 내측 코팅에 대한 3 % 메틸 셀룰로오스 용액을 준비한다. 약 60 ~ 70 ° C의 유리 병에 E3 (11)를 가열하고 메틸 셀룰로오스 분말의 적절한 금액을 추가합니다. 교반 막대를 추가하고 4 ℃에서 교반 즉시 솔루션이 30 ° C 이하로 냉각 될 때, 마지막 C에 Tricaine의 솔루션을 추가oncentration 100 ㎎ / L. 4 ° C에서 밤새 교반하십시오.
  4. 1.5 %의 제조 및 E3에서 0.1 % 아가
    1. 유리 플라스크에서 E3의 정의 된 부피에서 저 융점 아가로 오스 분말의 적당량을 녹인다. 전자 레인지에서 혼합물을 가열하고 아가로 오스 솔루션은 동종 나타날 때까지 남아있는 결정하지 않고, 가끔 흔들어.
    2. 1.5 ml의 반응 튜브에 0.1 % 아가 용액 1 ㎖ 분취 량을 준비한다. 분주 4 ° C.에 저장할 수 있습니다
    3. 코트 플라스틱 배양 접시에 1.5 % 용액을 사용합니다. 아가 로스 층의 두께는 CA이어야한다. 2mm. 아가로 오스가 고형화 된 후 건조를 방지하는 층의 상부에 E3 매체를 추가한다. 코팅 접시는 4 ° C.에 저장할 수 있습니다
  5. 제브라 피쉬의 제조
    1. 기존 프로토콜에 따라 11, 12, 28.5 ° C에서 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 성인과 배아를 유지하고이를 처리 할 수 있습니다.
    2. 오후에 남성과 여성의 물고기를 설정하고 분배기를 사용하여 구분합니다. 물고기의 짝짓기 시간 다음 아침에 디바이더를 제거합니다.
    3. E3 가득 접시에 배아를 수집하고 실체 현미경을 사용하여 검사합니다.
    4. 24 HPF (또는 관심의 발달 단계)에서, 형광 식에 대한 제브라 피쉬 배아를 선택하고 신선한 E3와 함께 새로운 요리에 긍정적 인 사람을 전송합니다.
    5. 조심스럽게 두 개의 날카로운 집게 (그림 2D2E)를 사용하여 배아를 dechorionate. 열린 찢어 그것을 해내 융모막 두 번째 집게를 잡고 개최하는 최초의 집게를 사용하여 주 1 :. 실체 현미경의 도움으로이 단계를 수행합니다.

2. 다층 실장

  1. FEP 튜브 코팅
    1. 주사기에 뭉툭한 끝 정맥을 연결합니다. 청소의 한쪽 끝으로 약 3 mm를 위해 조심스럽게 캐 뉼러를 삽입 한 조각을 잘라. 장갑을 사용하고 관의 굽힘 또는 압착을 방지 : FEP 튜브 (그림 2 층과 2G) 참고 1.
    2. 3 % 메틸 셀룰로오스에 FEP 튜브의 자유 단부 담그고 용액으로 충진 튜브.
    3. 천천히 주사기에 밀어 메틸 셀룰로오스를 놓습니다. 솔루션을 폐기하십시오.
    4. . 반복 E3 주 1을 사용하여 2.1.2와 2.1.3 단계 : 코팅 튜브는 즉시 설치에 사용되어야합니다.
  2. 아가로 오스에 제브라 피쉬 전송
    1. 열 블록에 70 ° C에 0.1 % 아가로 오스의 한 나누어지는을 가열한다. 소용돌이 반응 관 짧게와 38 ° C (그림 2H)으로 설정 열 블록에 전송합니다.
    2. 열 블록으로부터 반응 관을 가지고이 잠시 진정하자. 다시 133-200 ㎎ / L와 소용돌이의 최종 농도 (그림 2I)에 Tricaine을 추가합니다.
    3. dechorionated zebrafish의 배아 중 하나 transfe를 선택. R이 유리 파스퇴르 피펫 (그림 2J2K)를 사용하여 예열 된 0.1 % 아가로 오스와 반응 관에 1 주 : 가능한 한 적은 추가 E3를 전송 해보십시오.
  3. 제브라 피쉬를 장착
    1. 주사기에 연결된 FEP 튜브 (그림 2 L)와 배아를 차지합니다. . 튜브는 튜브의 한쪽 끝 부근에 위치 배아와 헤드가 튜브의 개방를 가리키는, 0.1 % 아가로 오스 완전히 채워 져야 주 1 : 물고기를 복용하기 전에 약간의 아가로 오스를 차지해야합니다. 주 2 : 거품을 방지하기 위해 주사기에 매우 부드럽게 당겨 주 3 :. 콘텐츠 (그림 2M2N)의 누출을 방지하기 위해 수평 방향으로 튜브를 유지.
  4. 튜브를 연결
    그림 2
    그림 2. 다층 제브라 피쉬 배아에 장착.) 플루오르 에틸렌 프로필렌 준비. B 전에 케이블 드럼 (FEP) 튜브) 부착 무딘 끝 정맥 주사기. C) 청소 및 FEP 관. D, 24 HPF의 E) Dechorionation 컷 용융의 반응 관 내부의 아가로 오스 0.1 % 열 블록에 전송하는 동안의 제브라 피쉬 배아. F) 뭉툭한 끝 정맥에 관을 부착. G) 정맥 튜브 부착과 주사기. H) 나누어지는. I) 소용돌이로 FEP 튜브. M, N)에 아가로 오스 주변 용융 아가로 오스의 배아. L) 섭취로 태아의 유리 피펫을 사용하여 dechorionated 배아의 아가로 오스. J) 통풍. K) 전송 FEP 튜브 내부의 제브라 피쉬 배아 . 연결해) 표본과 정맥. P 사이의 튜브를 절단. Q)는 배아 연결 관. R) 금속 홀더의 최종 샘플 준비 내부. 을하려면 여기를 클릭하십시오 큰 이미지를 볼 수 있습니다.
    1. 정맥 (그림 -20) 오프 튜브를 잘라 면도날을 사용합니다.
    2. 천천히 튜브 (그림 2 P)을 연결하는 플라스틱 접시에 1.5 % 아가로 오스의 전체 층을 통해 물고기가 들어있는 튜브의 끝을 붙여 주 1 :. 거품의 형성을 피하고 잡고 똑 바른 마개 표면을 얻으려고 . 관 정확히 수직 아가로 오스 표면에 주 2 : 약간 좋은 플러그를 얻기 위해 튜브를 돌립니다.
    3. 건조를 방지하기 위해 E3와 1.5 ㎖의 반응 튜브에 장착 된 표본을 보관하십시오. 이 샘플은 N입니다이미지가 준비 아야. 이미징 전에 물고기가 플러그 (그림 2 분기2R)의 상단에 바로 앉아 있는지 확인합니다. 또한 설치 매체에서와 같은 농도에서 이미징 챔버 내부의 매체에 Tricaine를 추가해야합니다.

Representative Results

Zebrafish의 혈관 개발 며칠에 걸친 영상

장기 빛 시트 현미경 다층 설치 전략의 장점을 설명하기 위해 13 제브라 피쉬 : 우리는 (GFP kdrl) Tg는 DPF (1)를 사용합니다. 목표는 이미지는 2 일간의 과정을 통해 전체 제브라 피쉬의 혈관의 개발이다. 제브라 피쉬 배아는 메틸 코팅 폴리머 튜브 내부의 아가로 오스 0.1 %에 장착되었다. 여기에, 제브라 피쉬는 설치 매체에 의해 제한되지 않고, 일반적으로 개발할 수 있습니다. 머리 꼬리 (그림 3)을 확장하고 혈관 싹이 방해받지 나타납니다 발생합니다.

그림 3
그림 3. 제브라 피쉬의 혈관 개발 며칠에 걸친 영상. multila의 혈관13 제브라 피쉬 이틀에 걸쳐 빛 시트 현미경에 방해받지 않고 개발 : YER은 (GFP kdrl) Tg는 DPF (1)를 장착. 488 nm의 레이저 광 시트는 여기되어 형광 신호가 10X/0.3 W 및 대물 EMCCD의 카메라를 이용하여 검출 하였다. Z-스택은 인접한 4 개의 위치마다 10 분에 취득 이후 피지 15 스티치되었다. 시간 점의 부분 집합의 최대 강도 예측이 표시됩니다. 스케일 바 :. 500 μm의 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

초기 제브라 피쉬 배아의 영상

여기, 우리는 수정 후 첫날 이른 제브라 피쉬 배아의 빛 시트 현미경 장착 지원으로 FEP 튜브의 기능을 보여줍니다. 8 HPF의 Tg (H2A : GFP)은 14 제브라 피쉬 배아는 I와 E3 채워진 튜브 내부의 손상 융모막 장착 된1mm의 nner 직경. 즉, 융모막의 약간의 체결 결과. 배아 동안 모든 발달 과정은 설치에 영향을받지 최적으로 빛 시트 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 이 예제에서, 우리는 12 시간의 과정 (그림 4)을 통해 표본을 이미지. 1.5 % 아가로 오스의 융모막하지 않고 기존의 설치를 사용하는 경우 등의 노른자와 중간 선을 따라 조직의 비후의 증가 신장 등의 초기 배 발생시 일반적인 형태의 변화는 억압 될 것이다.

그림 4
. 초기 제브라 피쉬 배아의 그림 4 이미징의 Tg (H2A : GFP). 14 제브라 피쉬의 초기 배 발생을 통과한다. 488 nm의 레이저 광 시트 흥분 및 GFP 형광 신호가 검출되었다10X/0.3의 W 목표와 EMCCD 카메라와 함께. 두 개의 각도에서 Z-스택은 12 시간의 과정을 통해 매 3 분을 인수했다. 시간 경과의 부분 집합의 정규화 된 최대 강도 예측이 표시됩니다. 아직 마취가 사용되지 않았다으로 취득하는 동안 배아 꿈틀 19 HPF 결과에서 눈에 보이는 모션 블러,. 스케일 바 :. 150 μm의 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이러한 빛 시트 현미경 같은 고급 현미경 기술은 몇 일의 과정을 통해 높은 공간적 해상도로 이미지 데이터를 기록 할 수있게뿐만 아니라 개선하기 위해 샘플 장착 기술이 필요합니다. 우리는 지브라​​ 피쉬 개발의 빛 시트 현미경에 장착 다층의 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 구현이 간단하고 우리는 매일 우리의 실험실에서 사용합니다.

FEP 튜브

우리 실장 전략의 주요 구성 요소는 플루오르 중합체 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 튜브이다. 우리는 주로하기 때문에 물과 비슷하기 때문에 이상적으로 물 침지 목표와 수성 매체를 필요로하는 표본 빛 시트 현미경 적합 1.338의 굴절률,의 FEP를 사용하기로 결정했다. 0.8 mm, 내경 0.4 mm의 벽 두께를 매우 잘 개발 제브라 피트와 튜브는, 1.6 mm에 적합한 전형적인 샘플 홀더로 사용될 수있다모세 혈관 제시 설치 방법을위한 우리의 첫번째 선택이다. 우리는 우리의 가정 기본 설정뿐만 아니라 상용 시스템 칼 자이스 현미경으로 "Lightsheet Z.1"에서 철저히 테스트 및 FEP 튜브, 장기적인 안정성을 제공하는 광학 성능에 최소한의 영향을 미칠 및 비 형광 10 것으로 나타났습니다. 그러나, 이들은 예를 들어,이 시험편을 맑게 다른 굴절률을 필요 샘플 애플리케이션에 적합하지 않다.

튜브뿐만 아니라 FEP 만들어진 포일은 직경과 두께의 다양한 사용할 수 있습니다. 또한, FEP는 260 ° C에서 용융하여 맞춤 샘플 설치 지원을위한 거의 무한한 가능성을 제공 할 수 있습니다. 중합체 튜브 클리닝 프로토콜 유용한 광학 품질을 보장​​하기 위해 몇 가지 단계를 포함 이유있는, 비 멸균 공급되는 경향이있다. 메틸 셀룰로오스와 코팅은 성장하는 제브라 피쉬 배아의 어떠한 부분이 폴리머 붙어 있는지 확인합니다.

0.1 % 아가로 오스에 대한 결정은, 아가 로스 및 메틸 셀룰로오스 (10)의 다른 농도의 증가율 및 부동성의 광범위한 검사에 기초한다. 0.1 % 이상의 아가 로스 농도는 이미 24 HPF의 지브라 피쉬의 성장 속도에 심각한 영향을 보였다. 또한 우리는 마취 약물 Tricaine의 낮은 복용량을 사용합니다. Tricaine 블록의 활동 전위, 따라서 뇌와 근육 사이의 신호 전달을 억제하고 근육의 수축 16를 표시하지 않습니다. 133-200 ㎎ / L의 농도는 24 ~ 72 HPF 사이에 제브라 피쉬의 충분한 고정을 보장합니다. 그러나 Tricaine 및 기타 마취 약물 우리는 심장 부종 등의 표시 농도 의존적​​ 부작용을 테스트했다. 또한 Tricaine 필요한 용량은 배아의 발달 단계에 따라 달라집니다. 따라서 우리는 이미지를 만들 발달 단계에 필요한 금액에 Tricaine 농도를 줄이는 것이 좋습니다. 최고의 performan을 보장하기 위해CE 및 부산물 독성의 형성을 방지, 새로 제조 또는 해동 Tricaine 원액이 사용하는 빛으로부터 보호하고 30 ℃ 이상으로 가열해야하는지

FEP 튜브에 임베딩은 특정 요구를 고려하여 설치 매체의 쉽게 수정 할 수 있습니다. 마음의 시간 경과 영상을 위해, 우리는 3 % 메틸 셀룰로오스 100 ㎎ / L Tricaine 대신 0.1 % 아가로 오스 및 설치 200 ㎎ / L를 사용하는 것이 좋습니다. 메틸 셀룰로오스 0.1 % 아가로 오스 따라서 자체적 높은 부동성을 제공하고 더 적은 Tricaine는 배아의 협착을 보장하기 위해 사용될 필요가보다 점성이다.

Tricaine는 30 ° C 이상의 온도에 민감하고 또한 성능과 배아의 수의 경련 감소로 이어지는, 영상 실에서 매체에 의해 희석 될 수있다. 따라서, 장착 표본이 잠겨있는 영상 매체도 Tricaine을 사용해야합니다. 당신의 실험은 높은의 사용을 필요로하는 경우온도는, 우리는 관류 시스템을 사용하여 수동으로 또는 두 시간 점 사이 관과 주사기 하나 촬상 챔버에서 매체를 교환 권장합니다.

중요한 단계

샘플의 실장 공정 중에 중요한 단계는 튜브에 시료의 흡기 및 아가 플러그의 삽입이다. 섭취 후 변경 성가신 배아의 초기 위치를 정의한다. 다수의 시료를 탑재 할 수 있어야하고 설치 품질은 실체 현미경으로 관찰해야한다. 샘플 방향이 만족스럽지 않은 경우이 종종 배아를 왜곡으로, 시료를 그림과 플런저의 후속 움직임을 피할 수있는 속도를 변경하는 데 도움이 될 수 있습니다. 1.5 % 아가 플러그는 0.1 % 아가로의 누설을 방지 할 필요가있다. 튜브 내부의 플러그의 표면은 개발 중에 샘플 방향에 영향을주지 할 평평해야합니다. 좋은 서핑을 달성하기 위해ACE, 아가 로스 층의 상이한 두께를 테스트해야하고 튜브의 표면에 수직 인 아가로 끼워 넣을 필요가있다. 관을 조금 회전 튜브를 당기는 조심스럽게 접시에서 플러그를 해제합니다. 장착의 품질은 영상 전에 실체 현미경으로 확인해야합니다.

멀티 뷰 영상

빛 시트 현미경의 하나의 주요 장점은 멀티 뷰 영상, 시편을 회전 여러 각도에서 Z-스택을 획득하고 이후에 등록을 융합 할 수있는 기능입니다. 3D 공간에서 Z-스택을 등록하는 방법은 확립 신탁 마커 (17)로 샘플을 둘러싼 형광 비드를 사용하여 비드 기반 등록이다. 그러나이 방법은 같은 1.5 % 아가로 오스 등의 고체 설치 매체에 의존하기 때문에 다층가 여기에 제시된 실장 호환되지 않는 것 같습니다. 그러나 여러 다른 솔루션은 애플리케이션에 따라 작동한다. 첫째, 형광 구슬은 수획득 동안 시야에 있 아가 플러그에 통합 될 수있다. 둘째, 스테이지 위치는 형광 비드와 함께 1.5 % 아가로 오스 컬럼을 사용하여 실제 실험 이전에 보정 될 수있다. 셋째, 이러한 형광 핵으로서 대체 마커는 서로에 대해 Z-스택의 위치를​​ 식별하기 위해 사용될 수있다.

증발

일반적인 광 시트 현미경 설정은 매체의 증발에 오픈 샘플 챔버, 피할 수없는 리드를 사용합니다. 매체가 설치 매체의 증발을 제한하는 표본의 생존과 광학 및 샘플 사이의 올바른 굴절률을 위해 필수적이기 때문에, 우리는 증발을 방지하기 위해 다음 방법 중 한 가지 이상을 복용하는 것이 좋습니다. 우선, 챔버 내의 매체는 끊임없이 관류 시스템에 의해 교환 될 수있다. 둘째, 매체 수동 리필 할 수있다. 셋째, 챔버 덮개 또는가요 성 호일로 커버 될 수있다.

중합체는 FEP 화학 큰 다양성을 견딜 수 있도록 개발하고, 따라서 강력한 화학적으로 불활성 가스에 nonpermeable이다 하였다. 다층 실장 산소의 경우에만 아가 플러그 및 아가 - 공기 계면을 관통하지만, 중합체 튜브를지지 않고 아가 1.5 % 마운팅에 비해 다층 실장에 산소 공급이 심각하게 낮은 경우에는 표시 될 남아있다. 제브라 피쉬 모폴로지가 다층 실장 영향 전에 그러나, 1.5 % 아가로 장착으로 약 두 시간 동안 사용될 수있다 장기 이미징 뛰어난 전체적인 솔루션이 될 것으로 보인다.

개발의 초기 단계 이미징

설치 다층 지금 제브라 피쉬 세 이상 24 HPF의 시간 경과 빛 시트 현미경에 대한 우리의 표준 임베딩 기술이되고있다. 그 외에, 우리는 또한 초기 단계의 배아의 이미징 폴리머 튜브를 사용합니다. 전자mbryos 그들의 chorions에 남아 1mm의 내경 FEP 관에 장착 및 E3로 채워진다. 제브라 피쉬는 자유롭게 융모막 안에 개발할 수 있습니다 여전히 잘 빛 시트 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다.

시야

제시 다층 샘플 설치는 제브라 피쉬의 실시간 발달 생물학에 대한 빛 시트 현미경의 잠재력을 소개하고 있습니다. 그것은 쉽게 광 투영 단층 촬영 (OPT) 및 다른 생물과 같은 다른 현미경 기술에 채용 될 수있다. 우리는 표준 크기 FEP 튜브가 특정 요구에 맞게 샘플 장착 기법으로 단지 첫 번째 단계입니다 있다고 생각합니다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 자금 지원을 위해 막스 플랑크 사회, 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP)과 베링거 인 겔 하임 드퐁 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes Bola S 1815-04 0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe B. Braun Melsungen AG 9161406 V
Sterican Single-Use Cannula, blunt B. Braun Melsungen AG 9180109 0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH 
70% EtOH
Methylcellulose Sigma M0387 supplied as powder
E3 medium (for zebrafish embryos)
1.5 ml Reaction Tube Eppendorf 3810X
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414 supplied as powder
Petri Dish Greiner 633180 plastic, 94 mm x 16 mm
Tricaine Sigma E10521 synonyms:  Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate 
10X/0.3 W Microscope Objective Lens Leica HCX APO L
EMCCD Camera Andor Technology iXon 885 EMCCD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착
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Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).More

Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).

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