제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.
빛 장 현미경은 제브라 피쉬 배아 발달을 연구하는 이상적인 이미징 기술입니다. 때문에 최소한의 사진 독성 및 표백에, 그것은 특히 몇 일까지 많은 시간에 걸쳐 장기적으로 시간 경과 영상에 적합합니다. 그러나, 적절한 샘플 설치 전략은 감금 및 샘플의 정상적인 발달을 모두 제공이 필요합니다. 다층 설치, 광학적으로 명확한 관에서 낮은 농도의 아가로 오스를 사용하여 새 임베딩 기술은 지금이 한계를 극복하고 실시간 발달 생물학에 대한 빛 시트 현미경의 잠재력을 소개하고 있습니다.
배아 동안 복잡한 이벤트와 상호 작용을 이해하기 위해, 발달 생물학의 연구는 점점 더 전체 생물의 생체 내 이미징에 하나의 세포와 장기의 현미경에서 움직이고있다. 전통적인 현미경 기술은 일반적으로 장기간에 걸쳐 급속 이벤트를 수행하기 위해 공간 및 시간 해상도를 제공하지 종종 표백 또는 샘플 1에서 광독성 효과를 일으킨다. 우리와 다른 빛 시트 현미경 (그림 1) 제브라 피쉬 2-4의 생체 내 이미징을위한 이상적인 기술로 발견했다. 검출 축에 직교하는 레이저 광의 얇은 시트와 샘플의 조명은 높은 공간 해상도뿐만 아니라 최소화 광 독성 5 빠른 광학 절편을 제공한다. 동시에, 이로 인해 독특한 광학적 배치에, 페트리 접시 나 배양 챔버를 사용하여 기존의 시료 실장 기술은 적합하지 않다. 일반적인 빛시트 현미경 세 번역 모터 및 회전 모터가 정확하게 위치 할 수 있도록 샘플을, 보류, 설정 및 모든 방향에서 볼. 과거 표본 빛 시트 현미경 종종 유리 모세관 6,7 내부 아가로 오스 1 ~ 2 %에 포함되었다. 이 경우 임베디드 시편 고화 아가 실린더는 촬상 물 같은 매체로 채워진 샘플 챔버 내로 유리 모세관 밖으로 압출된다. 아가로 오스는 물에 가까운 굴절률을 가지므로 물 보정 조명 및 광학 검출을 용이하게 생체 빛 시트 현미경 완벽하게 적합합니다. 샘플 경질 아가 로스에 국한되어 짧은 시간 동안 잘 묘화 될 수 있지만, 몇 시간 7,8위한 묘화 형태 발생 때 변경 및 배아의 성장을 강력하게 손상된다. 다른 응용 프로그램에 대한 솔루션은 비 침습적 장기 시간 경과 제브라 피쉬에게 9을 개발되었지만 광 시트 현미경 촬상 전위는 종래의 1.5 % 아가로 오스를 매립하여 악용 할 수 없습니다.
따라서 우리는 zebrafish의 배아 (10)의 생체 빛 시트 현미경을위한 새로운 설치 전략을 개발했다. 샘플을 광학적으로 맑은 중합체 불소화 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 관 안쪽 200 ㎎ / L의 Tricaine으로 0.1 % 아가로 오스에 장착된다. 내장 된 배아 인해 매체의 저점에 일반적으로 개발하고 있습니다. 동시에, FEP 튜브는 실험 기간에 대한 중간 샘플을 한정한다. 여기에서 우리는 기존의 프로토콜을 통해 장점을 반영하는 새로운 설치 기술 및 현재 데이터의 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 우리의 방법 지브라 피쉬 개발하여 연속 이틀 이상에 걸쳐 높은 공간 및 시간 해상도로 묘화 될 수 있음을 보여준다.
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도 1. 광 시트 현미경의 원리. 불소화 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 튜브 내에 장착 지브라 피쉬는 번역 및 검출 목적의 초점 평면을 통해 회전 될 수있다. 레이저 광 (빛 시트)의 얇은 시트를 검출 목적의 초점면에 조명 목적에 의해 계획 및 시편의 두께가 얇은 광학 부분을 조명한다. 방출 된 형광 신호를 검출 대물 의해 수집하고 카메라 칩에 기록된다.
이러한 빛 시트 현미경 같은 고급 현미경 기술은 몇 일의 과정을 통해 높은 공간적 해상도로 이미지 데이터를 기록 할 수있게뿐만 아니라 개선하기 위해 샘플 장착 기술이 필요합니다. 우리는 지브라 피쉬 개발의 빛 시트 현미경에 장착 다층의 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 구현이 간단하고 우리는 매일 우리의 실험실에서 사용합니다.
FEP 튜브
우리 실장 전략의 주요 구성 요소는 플루오르 중합체 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 튜브이다. 우리는 주로하기 때문에 물과 비슷하기 때문에 이상적으로 물 침지 목표와 수성 매체를 필요로하는 표본 빛 시트 현미경 적합 1.338의 굴절률,의 FEP를 사용하기로 결정했다. 0.8 mm, 내경 0.4 mm의 벽 두께를 매우 잘 개발 제브라 피트와 튜브는, 1.6 mm에 적합한 전형적인 샘플 홀더로 사용될 수있다모세 혈관 제시 설치 방법을위한 우리의 첫번째 선택이다. 우리는 우리의 가정 기본 설정뿐만 아니라 상용 시스템 칼 자이스 현미경으로 "Lightsheet Z.1"에서 철저히 테스트 및 FEP 튜브, 장기적인 안정성을 제공하는 광학 성능에 최소한의 영향을 미칠 및 비 형광 10 것으로 나타났습니다. 그러나, 이들은 예를 들어,이 시험편을 맑게 다른 굴절률을 필요 샘플 애플리케이션에 적합하지 않다.
튜브뿐만 아니라 FEP 만들어진 포일은 직경과 두께의 다양한 사용할 수 있습니다. 또한, FEP는 260 ° C에서 용융하여 맞춤 샘플 설치 지원을위한 거의 무한한 가능성을 제공 할 수 있습니다. 중합체 튜브 클리닝 프로토콜 유용한 광학 품질을 보장하기 위해 몇 가지 단계를 포함 이유있는, 비 멸균 공급되는 경향이있다. 메틸 셀룰로오스와 코팅은 성장하는 제브라 피쉬 배아의 어떠한 부분이 폴리머 붙어 있는지 확인합니다.
<p cl엉덩이 = "jove_step"> 설치 매체0.1 % 아가로 오스에 대한 결정은, 아가 로스 및 메틸 셀룰로오스 (10)의 다른 농도의 증가율 및 부동성의 광범위한 검사에 기초한다. 0.1 % 이상의 아가 로스 농도는 이미 24 HPF의 지브라 피쉬의 성장 속도에 심각한 영향을 보였다. 또한 우리는 마취 약물 Tricaine의 낮은 복용량을 사용합니다. Tricaine 블록의 활동 전위, 따라서 뇌와 근육 사이의 신호 전달을 억제하고 근육의 수축 16를 표시하지 않습니다. 133-200 ㎎ / L의 농도는 24 ~ 72 HPF 사이에 제브라 피쉬의 충분한 고정을 보장합니다. 그러나 Tricaine 및 기타 마취 약물 우리는 심장 부종 등의 표시 농도 의존적 부작용을 테스트했다. 또한 Tricaine 필요한 용량은 배아의 발달 단계에 따라 달라집니다. 따라서 우리는 이미지를 만들 발달 단계에 필요한 금액에 Tricaine 농도를 줄이는 것이 좋습니다. 최고의 performan을 보장하기 위해CE 및 부산물 독성의 형성을 방지, 새로 제조 또는 해동 Tricaine 원액이 사용하는 빛으로부터 보호하고 30 ℃ 이상으로 가열해야하는지
FEP 튜브에 임베딩은 특정 요구를 고려하여 설치 매체의 쉽게 수정 할 수 있습니다. 마음의 시간 경과 영상을 위해, 우리는 3 % 메틸 셀룰로오스 100 ㎎ / L Tricaine 대신 0.1 % 아가로 오스 및 설치 200 ㎎ / L를 사용하는 것이 좋습니다. 메틸 셀룰로오스 0.1 % 아가로 오스 따라서 자체적 높은 부동성을 제공하고 더 적은 Tricaine는 배아의 협착을 보장하기 위해 사용될 필요가보다 점성이다.
Tricaine는 30 ° C 이상의 온도에 민감하고 또한 성능과 배아의 수의 경련 감소로 이어지는, 영상 실에서 매체에 의해 희석 될 수있다. 따라서, 장착 표본이 잠겨있는 영상 매체도 Tricaine을 사용해야합니다. 당신의 실험은 높은의 사용을 필요로하는 경우온도는, 우리는 관류 시스템을 사용하여 수동으로 또는 두 시간 점 사이 관과 주사기 하나 촬상 챔버에서 매체를 교환 권장합니다.
중요한 단계
샘플의 실장 공정 중에 중요한 단계는 튜브에 시료의 흡기 및 아가 플러그의 삽입이다. 섭취 후 변경 성가신 배아의 초기 위치를 정의한다. 다수의 시료를 탑재 할 수 있어야하고 설치 품질은 실체 현미경으로 관찰해야한다. 샘플 방향이 만족스럽지 않은 경우이 종종 배아를 왜곡으로, 시료를 그림과 플런저의 후속 움직임을 피할 수있는 속도를 변경하는 데 도움이 될 수 있습니다. 1.5 % 아가 플러그는 0.1 % 아가로의 누설을 방지 할 필요가있다. 튜브 내부의 플러그의 표면은 개발 중에 샘플 방향에 영향을주지 할 평평해야합니다. 좋은 서핑을 달성하기 위해ACE, 아가 로스 층의 상이한 두께를 테스트해야하고 튜브의 표면에 수직 인 아가로 끼워 넣을 필요가있다. 관을 조금 회전 튜브를 당기는 조심스럽게 접시에서 플러그를 해제합니다. 장착의 품질은 영상 전에 실체 현미경으로 확인해야합니다.
멀티 뷰 영상
빛 시트 현미경의 하나의 주요 장점은 멀티 뷰 영상, 시편을 회전 여러 각도에서 Z-스택을 획득하고 이후에 등록을 융합 할 수있는 기능입니다. 3D 공간에서 Z-스택을 등록하는 방법은 확립 신탁 마커 (17)로 샘플을 둘러싼 형광 비드를 사용하여 비드 기반 등록이다. 그러나이 방법은 같은 1.5 % 아가로 오스 등의 고체 설치 매체에 의존하기 때문에 다층가 여기에 제시된 실장 호환되지 않는 것 같습니다. 그러나 여러 다른 솔루션은 애플리케이션에 따라 작동한다. 첫째, 형광 구슬은 수획득 동안 시야에 있 아가 플러그에 통합 될 수있다. 둘째, 스테이지 위치는 형광 비드와 함께 1.5 % 아가로 오스 컬럼을 사용하여 실제 실험 이전에 보정 될 수있다. 셋째, 이러한 형광 핵으로서 대체 마커는 서로에 대해 Z-스택의 위치를 식별하기 위해 사용될 수있다.
증발
일반적인 광 시트 현미경 설정은 매체의 증발에 오픈 샘플 챔버, 피할 수없는 리드를 사용합니다. 매체가 설치 매체의 증발을 제한하는 표본의 생존과 광학 및 샘플 사이의 올바른 굴절률을 위해 필수적이기 때문에, 우리는 증발을 방지하기 위해 다음 방법 중 한 가지 이상을 복용하는 것이 좋습니다. 우선, 챔버 내의 매체는 끊임없이 관류 시스템에 의해 교환 될 수있다. 둘째, 매체 수동 리필 할 수있다. 셋째, 챔버 덮개 또는가요 성 호일로 커버 될 수있다.
<p클래스 = "jove_step"> 산소 공급중합체는 FEP 화학 큰 다양성을 견딜 수 있도록 개발하고, 따라서 강력한 화학적으로 불활성 가스에 nonpermeable이다 하였다. 다층 실장 산소의 경우에만 아가 플러그 및 아가 – 공기 계면을 관통하지만, 중합체 튜브를지지 않고 아가 1.5 % 마운팅에 비해 다층 실장에 산소 공급이 심각하게 낮은 경우에는 표시 될 남아있다. 제브라 피쉬 모폴로지가 다층 실장 영향 전에 그러나, 1.5 % 아가로 장착으로 약 두 시간 동안 사용될 수있다 장기 이미징 뛰어난 전체적인 솔루션이 될 것으로 보인다.
개발의 초기 단계 이미징
설치 다층 지금 제브라 피쉬 세 이상 24 HPF의 시간 경과 빛 시트 현미경에 대한 우리의 표준 임베딩 기술이되고있다. 그 외에, 우리는 또한 초기 단계의 배아의 이미징 폴리머 튜브를 사용합니다. 전자mbryos 그들의 chorions에 남아 1mm의 내경 FEP 관에 장착 및 E3로 채워진다. 제브라 피쉬는 자유롭게 융모막 안에 개발할 수 있습니다 여전히 잘 빛 시트 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다.
시야
제시 다층 샘플 설치는 제브라 피쉬의 실시간 발달 생물학에 대한 빛 시트 현미경의 잠재력을 소개하고 있습니다. 그것은 쉽게 광 투영 단층 촬영 (OPT) 및 다른 생물과 같은 다른 현미경 기술에 채용 될 수있다. 우리는 표준 크기 FEP 튜브가 특정 요구에 맞게 샘플 장착 기법으로 단지 첫 번째 단계입니다 있다고 생각합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 자금 지원을 위해 막스 플랑크 사회, 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP)과 베링거 인 겔 하임 드퐁 감사합니다.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |