Utviklingen av sebrafisk kan følges over dager med lys ark mikros når embryo er innebygd i optisk klare polymer rør med lav konsentrasjon agarose.
Lett ark mikroskopi er det ideelle avbildningsteknikk å studere sebrafisk embryoutvikling. På grunn av minimal fototoksisitet og bleking, er det spesielt egnet for langsiktig time-lapse bildebehandling over mange timer opp til flere dager. Imidlertid er en egnet prøvemontering strategi trengs som tilbyr både innesperring og normal utvikling av prøven. Multilayer montering, en ny embedding teknikk med lav konsentrasjon agarose i optisk klare rør, overvinner nå denne begrensningen, og slipper løs det fulle potensialet av lys ark mikroskopi for sanntids utviklingsbiologi.
For å forstå de komplekse hendelser og interaksjoner under embryogenese, er forskning i utviklingsbiologi mer og mer å flytte fra mikroskopi av enkeltceller og organer til in vivo avbildning av hele organismer. Tradisjonelle mikroskopi teknikker vanligvis ikke klarer å tilby den romlig og tidsmessig oppløsning til å følge raske hendelser over en lengre periode, og ofte føre til bleking eller fototoksiske effekter i utvalget en. Vi og andre funnet lette ark mikroskopi (figur 1) til å være en ideell teknikk for in vivo avbildning av sebrafisk 2-4. Belysningen av prøven med et tynt ark av laserlys, ortogonalt i forhold til deteksjonsaksen, og har fast optisk snitting med høy romlig oppløsning og minimale bilde-5 toksisitet. På samme tid, på grunn av denne unike optiske arrangement, tradisjonelle eksempelmonteringsteknikker ved hjelp av petriskåler eller kulturkamre er ikke egnet. I en typisk lettark mikroskop tre translasjonelle motorer og en rotasjonsmotor holde prøven, slik at det kan bli nøyaktig plassert, vendte og betraktes fra alle retninger. I de siste prøvene for lys ark mikroskopi har ofte vært forankret i 1-2% agarose inne i et glass kapillær 6,7. I dette tilfelle ble den størknede agarose sylinder med de innleirede prøven ekstruderes ut av glasskapillært inn i prøvekammeret fylt med vannlignende medium for avbildning. Agarose har en brytningsindeks i nærheten av vann, og er derfor godt egnet for in vivo lett ark mikroskopi som muliggjør vann korrigert belysning-og deteksjonsoptikken. Prøven innesperret i den stive agarose og kan avbildes godt for en kort periode, men morfogenetiske forandringer og vekst av embryoet blir sterkt svekket når avbildning i flere timer 7,8. Selv om løsninger for andre applikasjoner har blitt utviklet ni, den ikke-invasiv langsiktig time-lapse sebrafisk avbildning potensial av lys mikros arket kan ikke utnyttes ved hjelp av den konvensjonelle 1,5% agarose innebygging.
Vi har derfor utviklet en ny montering strategi for in vivo lys ark mikroskopi av sebrafisk embryo 10. Prøven er montert i 0,1% agarose med 200 mg / L Tricaine inne i et rør laget av optisk klar polymer fluorert etylenpropylen (FEP). Den innebygde embryoet utvikles normalt på grunn av lav viskositet av mediet. På samme tid, begrenser den FEP røret mediet og prøven for varigheten av eksperimentet. Her gir vi en detaljert protokoll av den nye monteringsteknikk og presentere data som gjenspeiler dens fordeler fremfor den konvensjonelle protokollen. Vi viser at med vår metode sebrafisk utvikling kan være kontinuerlig avbildes med høy romlig og tidsmessig oppløsning over en periode på mer enn to dager.
5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
Figur 1. Prinsippet for lys ark mikroskopi. A sebrafisk montert i et rør laget av Fluor etylenpropylen (FEP) kan oversettes og roteres gjennom midtplanet av målet deteksjon. Et tynt ark av laserlys (lys sheet) anslås ved belysning av målet til fokalplanet for det formål deteksjon og lyser bare en tynn optisk seksjon av prøven. Den emitterte fluorescens-signalet blir oppsamlet ved målet deteksjon og tatt opp på en kamerabrikke.
Avanserte mikroskopi teknikker som lys ark mikros gjør oss i stand til å ta opp bildedata med høy tidsmessig og romlig oppløsning i løpet av flere dager, men krever også prøvemonterings teknikker for å forbedre. Vi presenterer en detaljert protokoll for flerlags montering for lys ark mikroskopi av sebrafisk utvikling. Metoden er enkel å implementere og vi bruker den i vår lab på en daglig basis.
FEP-rør
Viktige deler av vår monterings strategi er rør laget av polymer Fluor Ethylene Propylene (FEP). Vi besluttet å bruke FEP hovedsakelig på grunn av dets brytningsindeks på 1,338, som er lik for vann og derfor velegnede for lys mikros arket med vann for-å dyppe mål og prøven som krever vandige medier. De rør med 0,8 mm indre diameter og 0,4 mm veggtykkelse at den passer til å utvikle sebrafisk meget godt, kan brukes sammen med typiske eksempler på holdere som passer for 1,6 mmkapillærer og er vårt førstevalg for den presenterte monteringsmetode. Vi testet dem grundig i våre hjemmebygde oppsett så vel som i det kommersielle systemet "Lightsheet Z.1" av Carl Zeiss Mikros og fant at FEP rør tilby langsiktig stabilitet, har bare minimal innvirkning på optisk ytelse og er nonfluorescent 10. De er imidlertid ikke egnet for anvendelser med prøver som krever en annen brytningsindeks, f. eks erte prøven.
Rør samt folier laget av FEP er tilgjengelige i et utvalg av diametre og tykkelser. I tillegg kan FEP bli smeltet ved 260 ° C og gir dermed nesten uendelige muligheter for skreddersydde sample monterings støtter. De polymer rør tendens til å bli levert steril, noe som er grunnen til rengjøring protokollen inneholder flere tiltak for å sikre beste optiske kvaliteten. Belegget med methylcellulose sikrer at ingen del av den voksende sebrafisk embryo fester seg til polymeren.
<p class = "jove_step"> Monterings mediumAvgjørelsen for 0,1% agarose er basert på omfattende tester av vekst og immobilitet i ulike konsentrasjoner av agarose og metylcellulose 10. Agarose konsentrasjoner over 0,1% allerede viste en alvorlig innvirkning på vekst på 24 HPF sebrafisk. I tillegg bruker vi lave doser av bedøvelse narkotika Tricaine. Tricaine blokker aksjonspotensialer, hemmer dermed signaloverføringen mellom hjernen og musklene og undertrykker muskelsammentrekninger 16. En konsentrasjon av 133-200 mg / L sikrer tilstrekkelig immobilisering av sebrafisk mellom 24-72 HPF. Men Tricaine og andre bedøvelse narkotika vi testet showet doseavhengig bivirkninger som hjerteødem. I tillegg har den nødvendige dose av Tricaine varierer med utviklingsstadiet av embryoet. Vi anbefaler derfor å redusere Tricaine konsentrasjon til det beløpet som trengs for utviklingsstadier som er fotografert. For å sikre best mulig performance og hindre dannelsen av giftige biprodukter, bør nylaget eller tinet Tricaine stamløsning anvendes, beskyttet mot lys, og ikke oppvarmet over 30 ° C.
Den innebygging i FEP-rør gir også mulighet for enkel modifisering av monteringsmedium å ta hensyn til spesielle behov. For time-lapse avbildning av hjertet, anbefaler vi å bruke 3% methylcellulose og 100 mg / L Tricaine i stedet for 0,1% agarose og 200 mg / L for montering. Metylcellulose er mer viskøs enn 0,1% agarose og dermed gi høyere ubevegelighet av seg selv og mindre Tricaine må brukes for å sikre innesperring av embryoet.
Tricaine er følsomt for temperaturer over 30 ° C, og kan også være fortynnet med mediet i avbildningskammeret, noe som fører til redusert ytelse og mulig rykning av embryoet. Derfor, sørg for å bruke Tricaine også i bilde medium der den montert prøven er nedsenket. Hvis eksperimentene krever bruk av høyeretemperaturer, anbefales det å bytte ut medium i avbildningskammeret enten kontinuerlig ved hjelp av en perfusjon system eller manuelt med et rør, og en sprøyte mellom to tids-punkter.
Kritiske trinn
De kritiske trinn under prosessen med prøven festet er inntaket av prøven inn i røret, og innsetting av den agarose pluggen. Inntaket definerer utgangsstilling av embryo, noe som er tungvint å bytte etterpå. Flere prøver skal være tilgjengelig for å montere og bør overvåkes monterings kvalitet med en stereomikroskop. Hvis prøven orientering er ikke tilfredsstillende, kan endre hastigheten på å utarbeide prøven og unngå senere bevegelser av stempelet hjelpe da dette ofte vrir embryoet. Den 1,5% agarose pluggen er nødvendig for å unngå lekkasje av 0,1% agarose. Overflaten av pluggen inne i røret må være flat for å ikke påvirke prøven orientering under utvikling. For å oppnå en god surfess, forskjellige tykkelser av de agarose lag må bli testet, og røret må bli satt inn i agarose normal til overflaten. Roterende røret litt og trekke ut røret utgivelser nøye pluggen fra fatet. Kvaliteten på montering bør kontrolleres med et stereomikroskop før avbildning.
Multiview bildebehandling
En stor fordel med lys ark mikroskopi er Multi bildebehandling, evnen til å rotere prøven, erverve z-stabler fra flere vinkler, og deretter registrere seg og smelte dem. En etablert metode for å registrere z-stabler i 3D-rom er perle-basert registrering ved hjelp av fluoriserende perler rundt prøven som tillits markører 17. Denne metoden er avhengig men på en solid monteringsmedium for eksempel 1,5% agarose og dermed synes å være uforenlig med flerlags montering presenteres her. Men flere alternative løsninger fungerer, avhengig av programmet. Først, de fluoriserende perler kanskal innlemmes i agarose plugg, som må være i synsfeltet under overtakelsen. For det andre kan de sceneplassering kalibreres før den faktiske eksperimenter ved hjelp av en 1,5% agarose kolonne med fluoriserende perler. For det tredje, kan alternative markører slik som fluorescerende kjerner brukes til å identifisere posisjonen til z-stablene i forhold til hverandre.
Fordampning
Typiske lett ark mikros oppsett bruke en åpen prøvekammeret, som uunngåelig fører til fordampning av mediet. Siden mediet er viktig for overlevelsen av prøven, for å begrense fordamping av monteringsmedium og for den korrekte brytningsindeks mellom optikk og prøven, anbefales det å utføre et eller flere av de følgende tiltak for å hindre fordampning. For det første kan mediet i kammeret bli kontinuerlig utvekslet med en perfusjons-system. For det andre, kan mediet være manuelt etterfylt. For det tredje, kan kammeret være dekket med et lokk eller en fleksibel folie.
<pclass = "jove_step"> oksygentilførselPolymeren FEP ble utviklet for å tåle et stort utvalg av kjemikalier og er derfor robust, er kjemisk inert og nonpermeable til gass. I tilfelle av flerlagsmonterings oksygen kan bare trenge gjennom agarose pluggen og agarose-luft-grenseflaten, men det gjenstår å bli vist hvis oksygentilførselen i flerlags montering er sterkt lavere i forhold til montering i 1,5% agarose, uten støtte polymerrøret. Men som montering i 1,5% agarose kan bare brukes i omtrent to timer før sebrafisk morfologi påvirkes flerlags montering synes å være den samlede overlegen løsning for langvarig avbildning.
Imaging tidligere utviklingsstadier
Multilayer montering har nå blitt vår standard embedding teknikk for time-lapse lys ark mikroskopi av sebrafisk eldre enn 24 HPF. Bortsett fra det, vi også bruke polymer rør for avbildning av tidligere stadium embryoer. Det embryos forbli i sine chorions og er montert i en FEP-rør med en indre diameter på 1 mm og fylt med E3. Sebrafisk kan fritt utvikle inne i chorion og kan fortsatt bli fotografert godt med lys ark mikroskopi.
Outlook
Den presenterte flerlags prøvemontering slipper løs det fulle potensialet av lys ark mikroskopi for sanntidsutviklingsbiologi med sebrafisk. Det kan lett bli vedtatt for andre mikroskopi teknikker som optisk projeksjon tomografi (OPT) og andre organismer. Vi tror at standard-sized FEP-rør er bare de første skritt mot prøvemonterings teknikker skreddersydd for spesifikke behov.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Max Planck Society, Human Frontier Science Program (HFSP) og Boehringer Ingelheim Fonds for finansiering og støtte.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |