Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.
Işık sac mikroskobu Zebrafish embriyonik gelişimini incelemek için ideal bir görüntüleme tekniğidir. Nedeniyle minimal fotoğraf toksisitesine ve ağartma için, özellikle birkaç gün öncesine kadar çok saat süren uzun vadeli time-lapse görüntüleme için uygundur. Ancak, uygun bir örnek montaj strateji hapsi ve numunenin normal gelişimini hem de sunuyor ihtiyaç duyulmaktadır. Çok katmanlı montaj, optik açık tüpler düşük konsantrasyon agaroz kullanarak yeni bir gömme tekniği, şimdi bu sınırlama üstesinden gelir ve gerçek-zamanlı gelişimsel biyoloji hafif sac mikroskobu tam potansiyelini ortaya çıkarır.
Embriyogenez sırasında karmaşık olayları ve etkileşimleri anlamak için, gelişimsel biyoloji araştırma daha tüm organizmalarda in vivo görüntüleme için tek hücre ve organların mikroskop hareket olduğunu. Geleneksel mikroskopi teknikleri, genellikle uzun bir süre boyunca hızlı olayları takip etmek mekansal ve zamansal çözünürlük sunan başarısız ve genellikle ağartma veya numune 1 fototoksik etkilere neden olabilir. Biz ve diğerleri hafif levha mikroskobu (Şekil 1) Zebra balığı 2-4 in vivo görüntüleme için ideal bir teknik bulundu. Algılama eksenine dik lazer ışığı ince bir tabaka, numunenin aydınlatma yüksek uzamsal çözünürlük hem de en aza foto-toksisite 5 hızlı optik kesit sunmaktadır. Aynı zamanda, sayesinde bu eşsiz optik düzenlemesi için, Petri kapları veya kültür odası kullanılarak geleneksel bir numune montaj teknikleri uygun değildir. Tipik ışığındasac mikroskop üç öteleme motorlar ve bir dönme motorlu tam da yerleştirilmiş olabilir şekilde örnek, tutun, açık ve herhangi bir yönden baktı. Geçtiğimiz örneklerinde hafif levha mikroskobu için genellikle bir cam kapiller 6,7 içine agaroz% 1-2 gömülü edilmiştir. Bu durumda gömülü örnek ile katılaşmış agaroz silindir görüntüleme için su gibi bir ortam ile doldurulur numune odasına cam kılcal dışarı sıkılır. Agaroz suya yakın bir kırılma indeksine sahiptir ve bu nedenle su-düzeltilmiş aydınlatma ve algılama optik kolaylaştırır in vivo hafif sac mikroskobu için uygundur. Numune katı agaroz içinde hapsedilmiş ve kısa bir süre için de görüntülü olabilir, ancak birkaç saat boyunca 7,8 görüntülerken, belirli morfogenetik değişiklikler ve embriyonun büyümesi güçlü hasar görür. Diğer uygulamalar için çözümler invaziv olmayan uzun vadeli time-lapse Zebra balığı, 9 geliştirilmiş olmasına rağmen Işık sac mikroskobu görüntüleme potansiyel geleneksel% 1.5 agaroz gömülmesini kullanılarak istismar edilemez.
Bu nedenle Zebra balığı embriyolarının 10 in vivo hafif levha mikroskopisi için yeni bir montaj strateji geliştirdi. Numune, optik bakımdan saydam, polimer, florinlenmiş etilen propilen (FEP) yapılmış bir tüp içinde 200 mg / L Tricaine ile% 0.1 agaroz içinde monte edilir. Gömülü embriyo nedeniyle orta düşük viskoziteli normal geliştirir. Aynı zamanda, boru FEP deneyin süresi için ortam ve örnek sınırlar. Burada geleneksel protokolü üzerinde avantajları yansıtan yeni montaj tekniği ve mevcut verilerin ayrıntılı bir protokol sağlar. Biz yöntem Zebra balığı gelişimi ile sürekli olarak iki günden fazla bir süre içinde yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip görüntülü edilebilir olduğunu göstermektedir.
5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
Şekil 1. Işık mikroskobu tabaka ilkesi. Fluorinatlı etilen propilen (FEP) yapılmış bir tüp içinde monte edilen bir zebra balığı çevrilmiş ve bulgulama hedefi odak düzlemi üzerinden döndürülebilir. Lazer ışığı (ışık levha) ince bir tabaka tespit objektif odak düzlemi içine aydınlatma amacı ile projelendirilen ve numunenin sadece ince bir optik bölümü aydınlatır. Yayılan floresans sinyali bulgulama amaç ile toplanmış ve bir kamera çipi üzerine kaydedilmektedir.
Gibi hafif levha mikroskobu gibi ileri mikroskopi teknikleri birkaç gün boyunca yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntü verilerini kaydetmek için olanak, aynı zamanda geliştirmek için örnek montaj teknikleri gerektirir. Zebra balığı gelişme hafif levha mikroskopi için montaj çok katmanlı ayrıntılı bir protokol mevcut. Yöntemi uygulamak için basittir ve günlük olarak laboratuarımızda kullanın.
FEP borular
Bizim montaj strateji anahtar bileşenleri, polimer, florinlenmiş etilen propilen (FEP) yapılmış tüplerdir. Biz öncelikle çünkü suya benzer ve bu nedenle ideal su daldırma hedefleri ve sulu ortam gerektiren numune hafif sac mikroskopisi için uygun olan 1,338 onun kırılma indeksi, FEP kullanmaya karar verdi. 0.8 mm iç çapa ve 0.4 mm duvar kalınlığı çok iyi gelişen zebrafish uygun olan borular, 1.6 mm için uygun tipik bir numune tutucu ile birlikte kullanılabilirkılcal damarlar ve sunulan montaj yöntemi için ilk tercihtir. Biz bizim ev inşa kurulumları yanı sıra ticari sistem Carl Zeiss Mikroskobu "Lightsheet Z.1" in iyice test edilmiş ve FEP tüpler, uzun vadeli istikrar sunan optik performansı üzerinde sadece minimal bir etkiye sahip ve nonfluorescent 10 olduğu bulundu. Bununla birlikte, örneğin, numune temizlenmiş farklı bir kırılma indisine ihtiyaç örnekleri ile uygulamalar için uygun değildir.
Tüpler gibi FEP yapılmış folyolar çapları ve kalınlıkları, çeşitli mevcuttur. Buna ek olarak, FEP 260 ° C'de eritilmiş ve böylece özel olarak yapılan numune montaj destek için neredeyse sınırsız olanaklar sunmaktadır edilebilir. Polimer borular temizleme protokolü iyi optik kalitesini sağlamak için çeşitli adımlar içerir neden olan, steril olmayan temin olma eğilimindedirler. Metilselüloz ile kaplama artan Zebrafish embriyo hiçbir parçası polimerine yapışır sağlar.
<p class = "jove_step"> montaj orta% 0.1 agaroz için karar agaroz ve metilselüloz 10 farklı konsantrasyonda büyüme oranı ve hareketsizlik kapsamlı testler dayanmaktadır. % 0.1 yukarıda agaroz konsantrasyonları zaten 24 hpf zebrafish büyüme oranı üzerinde ciddi bir etkisi gösterdi. Ayrıca biz anestezi uyuşturucu Tricaine düşük dozlarda kullanın. Tricaine bloklar aksiyon potansiyelleri, böylece beyin ve kaslar arasındaki sinyal iletimini engeller ve kas kasılmaları 16 bastırır. 133-200 mg / L 'lik bir konsantrasyon 24-72 HPF arasında zebrabalıkları yeterli immobilizasyon sağlar. Ancak, Tricaine ve diğer anestezi ilaçlar biz kardiyak ödem gibi göstermek doza bağımlı yan etkileri test. Ayrıca Tricaine gerekli doz embriyonun gelişim aşaması ile değişir. Bu nedenle görüntülü gelişim aşamaları için gerekli miktara Tricaine konsantrasyonunu azaltılması önerilir. En iyi performan sağlamakce ve yan ürünler zehirli oluşumunu engellemek, taze hazırlanmış ya da çözülmüş Tricaine stok çözeltisi kullanılmıştır ışıktan korundu ve 30 ° C'nin üzerinde ısıtılmaması olmalıdır
FEP tüpler içinde gömme da özel ihtiyaçları için hesap için montaj orta kolay değişimine olanak sağlar. Kalbin time-lapse görüntüleme için, biz% 3 metilselüloz ve 100 mg / L Tricaine yerine% 0.1 agaroz ve montaj için 200 mg / L kullanmanızı öneririz. Metilselüloz,% 0.1 agaroz ve böylece kendi başına daha yüksek hareketsizlik sağlayan ve az Tricaine embriyo doğumdan sağlamak için kullanılması gereken daha fazla viskozdur.
Tricaine 30 ° C nin üzerindeki sıcaklıklara duyarlı olduğu ve aynı zamanda performansı ve embriyo olası seğirmesi azalma yol açan, görüntüleme odası içindeki ortam ile seyreltilebilir. Bu nedenle, monte numune dalmış olduğu görüntüleme ortamda da Tricaine kullandığınızdan emin olun. Deneyleriniz yüksek kullanımını gerektiriyorsasıcaklıklar, sürekli bir perfüzyon sistemi ile ya da iki el ile bir zaman-nokta arasında bir tüpü ve bir şırınga ile ya da görüntüleme odası içindeki orta alışverişi önerilir.
Kritik adımlar
Numune montaj sürecinde önemli adımlar tüpe numunenin emme ve agaroz fişin sokma bulunmaktadır. Emme sonradan değiştirmek için zahmetlidir embriyonun başlangıç konumunu tanımlar. Çoklu örnekler bağlamaya hazır olmalı ve montaj kaliteli bir stereo ile izlenmelidir. Örnek yönlendirme tatmin edici değilse bu genellikle embriyo katlanmış olarak, numune hazırlanması ve pistonu sonraki hareketlerinden kaçınmak hızını değiştirerek yardımcı olabilir. % 1.5 agaroz tıpası,% 0.1 agaroz sızmasını önlemek için gereklidir. Tüp içinde tıkacın yüzey gelişimi sırasında numune yönünü etkilememektedir düz olmalıdır. İyi bir sörf elde etmek içinas, agaroz tabakaların farklı kalınlıkları test edilmesi gerekir ve boru yüzeye normal agaroz koymak gerekmektedir. Tüpü biraz Döner ve tüp çekerek dikkatlice çanak fişi serbest bırakır. Montajının kaliteli görüntüleme önce bir stereo ile kontrol edilmelidir.
Multiview görüntüleme
Işık sac mikroskobu biri büyük avantajı multiview görüntüleme, numuneyi döndürmek çoklu açılardan z-yığınları kazanmak ve daha sonra kayıt ve onları kaynaştırmak için yeteneğidir. 3D uzayda z-yığınları kayıt kurulan bir yöntem mutemet belirteçleri 17 olarak numuneyi çevreleyen floresan boncuk kullanılarak boncuk-tabanlı kaydı. Bu yöntem, bununla birlikte bu gibi% 1.5 agaroz gibi katı bir montaj ortamı üzerine dayanır ve bu sayede çok katmanlı Burada yer montaj ile uyumlu görünmektedir. Ancak, pek çok alternatif çözümler uygulamaya bağlı olarak çalışır. İlk olarak, floresan boncuk olabilirsatın alma esnasında görüş alanında olması gerekir agaroz fiş, içine dahil edilebilir. İkinci olarak, aşama pozisyonları flüoresan boncuklar ile bir% 1.5 agaroz kolonu kullanılarak, gerçek deney önce kalibre edilebilir. Üçüncü olarak, flüoresan işaretçileri çekirdekler gibi alternatif birbirlerine göre z-yığınlarının konumunu belirlemek için kullanılabilir.
Buharlaşma
Tipik ışık mikroskobu levha kurulumları orta buharlaşma açık bir örnek odası, kaçınılmaz yol kullanın. Orta montaj orta buharlaşmanın engellenmesi için numunenin hayatta kalması, ve optik ve numune arasında doğru kırılma için gerekli olduğundan, buharlaşmasını önlemek için, aşağıdaki önlemlerden bir veya daha fazla alarak tavsiye. İlk olarak, odacık içindeki ortam sürekli bir perfüzyon sistemine göre değiş tokuş edilebilir. İkinci olarak, orta elle doldurulmuş olabilir. Üçüncü olarak, hazne bir kapak ya da esnek bir folyo ile kaplı olabilir.
<pclass = "jove_step"> Oksijen kaynağıPolimer FEP kimyasalların büyük bir çeşitlilik dayanacak şekilde geliştirilmiştir ve dolayısıyla sağlam bir kimyasal olarak atıl ve gaz geçirgen olmayan dir. Çok katmanlı oksijen montaj durumunda sadece agaroz fiş ve agaroz-hava ara yüzeyi boyunca nüfuz ama polimer boru destek olmadan% 1.5 agaroz montaj ile karşılaştırıldığında çok katmanlı montaj oksijen kaynağı ciddi düşük ise bu gösterilecek olmaya devam etmektedir. Zebra balığı morfolojisi tabakalı monte etkilenir önce Ancak,% 1.5 agaroz içinde montajı sadece yaklaşık iki saat için kullanılabilecek uzun süreli görüntüleme için, genel olarak üstün bir çözüm gibi görünmektedir.
Gelişiminin erken aşamaları Görüntüleme
Montaj çok katmanlı şimdi Zebrafish daha eski 24 hpf time-lapse ışık sayfalık mikroskobu için standart gömme tekniği haline gelmiştir. Bunun yanı sıra, biz de erken evre embriyo görüntüleme için polimer tüpleri kullanın. Embryos kendi chorions kalır ve 1 mm'lik bir iç çapa sahip bir tüp içinde FEP monte edilmiş ve E3 ile doldurulur. Zebra balığı serbestçe koryon içinde gelişebilir ve hala iyi ışık levha mikroskobu kullanılarak görüntülü olabilir.
Görünüm
Sunulan katmanlı örnek montaj zebrabalıkları ile gerçek-zamanlı gelişimsel biyoloji hafif sac mikroskobu tam potansiyelini ortaya çıkarır. Bu kolay gibi optik projeksiyon tomografi (OPT) ve diğer organizmalar gibi diğer mikroskopi teknikleri için kabul edilebilir. Biz standart boy FEP tüpler özel ihtiyaçlarına uygun örnek montaj teknikleri doğru sadece ilk adım olduğuna inanıyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Biz finansman ve destek için Max Planck Derneği, İnsan Frontier Bilim Programı (HFSP) ve Boehringer Ingelheim Fonds'u teşekkür ederim.
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10x/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |