Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

doi: 10.3791/51119 Published: February 27, 2014

Summary

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Abstract

Işık sac mikroskobu Zebrafish embriyonik gelişimini incelemek için ideal bir görüntüleme tekniğidir. Nedeniyle minimal fotoğraf toksisitesine ve ağartma için, özellikle birkaç gün öncesine kadar çok saat süren uzun vadeli time-lapse görüntüleme için uygundur. Ancak, uygun bir örnek montaj strateji hapsi ve numunenin normal gelişimini hem de sunuyor ihtiyaç duyulmaktadır. Çok katmanlı montaj, optik açık tüpler düşük konsantrasyon agaroz kullanarak yeni bir gömme tekniği, şimdi bu sınırlama üstesinden gelir ve gerçek-zamanlı gelişimsel biyoloji hafif sac mikroskobu tam potansiyelini ortaya çıkarır.

Introduction

Embriyogenez sırasında karmaşık olayları ve etkileşimleri anlamak için, gelişimsel biyoloji araştırma daha tüm organizmalarda in vivo görüntüleme için tek hücre ve organların mikroskop hareket olduğunu. Geleneksel mikroskopi teknikleri, genellikle uzun bir süre boyunca hızlı olayları takip etmek mekansal ve zamansal çözünürlük sunan başarısız ve genellikle ağartma veya numune 1 fototoksik etkilere neden olabilir. Biz ve diğerleri hafif levha mikroskobu (Şekil 1) Zebra balığı 2-4 in vivo görüntüleme için ideal bir teknik bulundu. Algılama eksenine dik lazer ışığı ince bir tabaka, numunenin aydınlatma yüksek uzamsal çözünürlük hem de en aza foto-toksisite 5 hızlı optik kesit sunmaktadır. Aynı zamanda, sayesinde bu eşsiz optik düzenlemesi için, Petri kapları veya kültür odası kullanılarak geleneksel bir numune montaj teknikleri uygun değildir. Tipik ışığındasac mikroskop üç öteleme motorlar ve bir dönme motorlu tam da yerleştirilmiş olabilir şekilde örnek, tutun, açık ve herhangi bir yönden baktı. Geçtiğimiz örneklerinde hafif levha mikroskobu için genellikle bir cam kapiller 6,7 içine agaroz% 1-2 gömülü edilmiştir. Bu durumda gömülü örnek ile katılaşmış agaroz silindir görüntüleme için su gibi bir ortam ile doldurulur numune odasına cam kılcal dışarı sıkılır. Agaroz suya yakın bir kırılma indeksine sahiptir ve bu nedenle su-düzeltilmiş aydınlatma ve algılama optik kolaylaştırır in vivo hafif sac mikroskobu için uygundur. Numune katı agaroz içinde hapsedilmiş ve kısa bir süre için de görüntülü olabilir, ancak birkaç saat boyunca 7,8 görüntülerken, belirli morfogenetik değişiklikler ve embriyonun büyümesi güçlü hasar görür. Diğer uygulamalar için çözümler invaziv olmayan uzun vadeli time-lapse Zebra balığı, 9 geliştirilmiş olmasına rağmen Işık sac mikroskobu görüntüleme potansiyel geleneksel% 1.5 agaroz gömülmesini kullanılarak istismar edilemez.

Bu nedenle Zebra balığı embriyolarının 10 in vivo hafif levha mikroskopisi için yeni bir montaj strateji geliştirdi. Numune, optik bakımdan saydam, polimer, florinlenmiş etilen propilen (FEP) yapılmış bir tüp içinde 200 mg / L Tricaine ile% 0.1 agaroz içinde monte edilir. Gömülü embriyo nedeniyle orta düşük viskoziteli normal geliştirir. Aynı zamanda, boru FEP deneyin süresi için ortam ve örnek sınırlar. Burada geleneksel protokolü üzerinde avantajları yansıtan yeni montaj tekniği ve mevcut verilerin ayrıntılı bir protokol sağlar. Biz yöntem Zebra balığı gelişimi ile sürekli olarak iki günden fazla bir süre içinde yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip görüntülü edilebilir olduğunu göstermektedir.

5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
Şekil 1. Işık mikroskobu tabaka ilkesi. Fluorinatlı etilen propilen (FEP) yapılmış bir tüp içinde monte edilen bir zebra balığı çevrilmiş ve bulgulama hedefi odak düzlemi üzerinden döndürülebilir. Lazer ışığı (ışık levha) ince bir tabaka tespit objektif odak düzlemi içine aydınlatma amacı ile projelendirilen ve numunenin sadece ince bir optik bölümü aydınlatır. Yayılan floresans sinyali bulgulama amaç ile toplanmış ve bir kamera çipi üzerine kaydedilmektedir.

Protocol

1.. Malzeme Hazırlanması

  1. FEP boruların hazırlanması
    1. Tüpünden (aşağıda belirtilen adımlarda) sıvı yıkama ve künt uç kanül (Şekil 2B) ile bağlı bir şırınga kullanarak FEP tüp (Şekil 2A) temizleyin Not 1:.. Işlem boyunca kullan eldiven 2 Not: Önerimiz ca parçalar halinde borunun kesilmesi. 1 m uzunluğunda ve paralel olarak, bu temizleme.
      1. İlk arka arkaya 1 M NaOH ile tüp yıkayın. Daha sonra 0.5 M NaOH ile doldurulmuş bir 50 ml santrifüj tüpüne tüp transferi ve 10 dakika için ultrasonicate.
      2. GKD 2 O. ile küçük bir lavabo için polimer tüp transferi İlk GKD 2 O ile ve daha sonra% 70 EtOH ile tüp yıkayın.
      3. Daha sonra% 70 EtOH ile yeni bir santrifüj tüpüne FEP tüp aktarın. Yine, 10 dakika boyunca bu santrifüj tüpü ultrasonicate.
    2. Parçalar halinde temizlenmiş FEP tüp KesmeGerekirse, yaklaşık 3 cm (zebra balığı ve montaj görüntülemede kullanım için tipik bir uzunluk) ve düzeltin. GKD 2 O (Şekil 2C) ile dolu yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne temizlenmiş FEP tüpleri saklayın.
  2. Tricaine stok çözeltisinin hazırlanması
    1. 97.9 ml GKD 2 O. 400 mg Tricaine (MS-222) çözülmesiyle% 0.4 Tricaine stok solüsyonu hazırlayın Toz tamamen çözülene sonra, 2.1 ml 1 M Tris (pH 9.0) ile 7.0 'a pH ayarlamak. Işıktan çözüm koruyun. -20 ° C'de saklayın tümbölenleri
  3. % 3 metilselüloz hazırlanması
    1. Aşağıda tarif edildiği gibi FEP tüplerin iç kaplama için% 3 metilselüloz çözeltisi hazırlayın. Yaklaşık olarak 60-70 ° C bir cam şişe içerisinde E3 11 kadar ısıtın ve metilselüloz tozun uygun miktarda ekleyin. Bir karıştırma çubuğu ilave edin ve 4 ° C'de karışmaya En kısa sürede çözelti 30 ° C'nin altına kadar soğutulur gibi, nihai c Tricaine çözeltisi eklemeoncentration 100 mg / L. 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca karıştırmaya devam edin.
  4. % 1.5 hazırlanması ve E3 içerisinde% 0.1 agaroz
    1. Bir cam şişeye E3 belirli bir hacim içinde düşük erime noktasına sahip agaroz tozun uygun miktarda çözülür. Bir mikrodalga karışımı ısıtın ve agaroz çözüm homojen görünene kadar kalan kristaller olmadan, arada bir sallayın.
    2. 1.5 ml'lik tepkime tüpleri içinde% 0.1 agaroz solüsyonun 1 ml'lik numuneler hazırlayın. Alikoları, 4 ° C'de saklanabilir
    3. Kat plastik Petri için% 1.5 solüsyonu kullanın. Agaroz tabakasının kalınlığı ca olmalıdır. 2 mm. Agaroz katılaştıktan sonra kurumasını önlemek için bir tabakanın üstünde yer E3 orta ekleyin. Kaplanmış çanak 4 ° C'de saklanabilir
  5. Zebrabalıkları hazırlanması
    1. Protokollere 11,12 göre 28.5 ° C'de Zebra balığı (Br.rerio) yetişkin ve embriyo tutmak ve bunları işlemek.
    2. Öğleden sonra erkek ve dişi balık kurmak ve bir bölücü kullanarak ayırın. Balık çiftleşme zaman aşımına üzere aşağıdaki sabah bölücü çıkarın.
    3. E3 ile dolu bir tabak içinde embriyolar toplayın ve bir stereo mikroskop kullanarak onları incelemek.
    4. 24 hpf (ya da ilgi gelişim aşamasında) de, floresan ifade Zebrafish embriyoyu seçmek ve taze E3 ile yeni bir çanak olumlu olanları aktarabilirsiniz.
    5. Dikkatle iki keskin forseps (Şekil 2D ve 2E) kullanılarak embriyolar dechorionate. Onu açık gözyaşı ve onu koparmak için koryon ve ikinci forseps kapmak ve tutmak için ilk forseps kullanın Not 1:. Bir stereomikroskopta yardımı ile bu adımı gerçekleştirin.

2. Çok katmanlı Montaj

  1. FEP tüp kaplanması
    1. Bir şırıngaya bir künt uç kanül takın. Bir temizlenmiş bir ucunda içine yaklaşık 3 mm dikkatle yerleştirin ve kanül parçası kesilmiş. Kullanın eldiven ve tüpün herhangi bir eğilme veya sıkma kaçının: FEP tüp (Şekil 2F ve 2G) Not 1.
    2. % 3 metilselüloz içine FEP tüpün serbest ucunu Dip ve solüsyon ile tüp doldurun.
    3. Yavaş yavaş şırınga iterek metilselüloz bırakın. Çözüm atın.
    4. . Tekrar E3 Not 1 kullanılarak 2.1.2 ve 2.1.3 adım: kaplanmış tüpler hemen monte etmek için kullanılması gerekmektedir.
  2. Agaroza zebrafish aktarılması
    1. Bir ısı bloğu 70 ° C,% 0.1 agaroz bir kısım kadar ısıtın. Vortex Reaksiyon tüpü kısaca ve 38 ° C (Şekil 2H) ayarlanmış bir ısı bloğu aktarın.
    2. Isı bloğu dışarı reaksiyon tüpü alın ve kısa bir süre soğumasını bekleyin. Yine 133-200 mg / L ve vorteks bir son konsantrasyonda (Şekil 2I) için Tricaine ekleyin.
    3. Dechorionated Zebra balığı embriyolarının birini ve transfe seçin. r bir cam Pasteur pipet (Şekil 2J ve 2K) kullanılarak önceden ısıtılmış% 0.1 agaroz ile reaksiyon tüpüne 1 Not: Mümkün olduğunca az ek E3 aktarmak için çalışın.
  3. Zebra balığı Montaj
    1. Şırınga bağlı FEP tüp (Şekil 2L) ile embriyonun sürebilir. . Borusunun ya da sonuna yakın konumlandırılmış embriyo ve baş tüpün açılması yönünde işaret ile,% 0.1 agaroz tamamen dolu olmalıdır Not 1: balık yukarı çekmeden önce bazı agarozun almak için emin olun. Not 2: kabarcıklarını önlemek için şırınga çok yavaşça çekin Not 3:. içeriği (Şekil 2M ve 2N) sızmasını önlemek için yatay olarak tüp tutun.
  4. Tüpü takma
    Şekil 2,
    Şekil 2. Çok katmanlı Zebra balığı embriyolarının için montaj. A) Fluorinated Etilen Propilen hazırlık. Yatak önce kablo tambur (HİP) borular) bağlı bir kör uç kanül ile bir şırınga. C) Bir temizlenir ve FEP tüp. D, 24 hpf E) dechorionation kesti erimiş bir reaksiyon tüpü içerisindeki agaroz% 0.1 bir ısı bloğu aktarılması ederken zebra balığı embriyolarının. F) künt uç kanül tüp takılması. G) kanül ve tüp ekli şırınga. H) bir kısım. I) vorteks FEP tüp. M, N) içine agaroz çevreleyen ile erimiş agaroz embriyo. L) Emme içine embriyo bir cam pipet kullanılarak dechorionated embriyo agaroz. J) Uptake. K) Transfer FEP tüp içinde zebra balığı embriyo . takma) numune ve kanül. P arasındaki boru kesme. Q) embriyo takılı tüp. R) bir metal tutucu son numune hazırlama içine. için tıklayın Daha büyük resmi görmek.
    1. Kanül (Şekil 2O) kapalı tüp kesmek için jilet kullanın.
    2. Yavaşça tüp (Şekil 2P) takmak için plastik tabak içinde% 1.5 agaroz bütün kat boyunca balık içeren tüpün ucunu sopa Not 1:. Kabarcıklarının oluşumunu önlemek ve tutarak düz fiş yüzey elde etmek deneyin . tüp tam olarak dik agaroz yüzeye Not 2: biraz güzel bir fiş almak için tüp döndürün.
    3. Kurumasını önlemek için E3 ile 1.5 ml reaksiyon tüpünde monte numune tutun. Numune, ngörüntülü hazır ow. Görüntüleme önce, balık fişi (Şekil 2. Çeyrek ve 2R) üstüne sağ oturuyor olup olmadığını kontrol edin. Ayrıca, montaj ortamı içinde aynı konsantrasyonda görüntüleme odasının içine ortama eklemek Tricaine emin olun.

Representative Results

Zebra balığı damarları Kalkınma Multiday Görüntüleme

Uzun süreli ışık mikroskobu tabaka için çok katmanlı montaj stratejisinin avantajlarını göstermek için 13 zebrafish: Biz (GFP kdrl) Tg dpf 1 kullanın. Amaç, görüntü 2 gün boyunca bütün zebrabalıkları damar geliştirilmesidir. Zebra balığı embriyo metilselüloz kaplı polimer tüp içine agaroz 0.1% olarak monte edildi. Burada, Zebra balığı montaj orta ile sınırlı değildir ve normal gelişebilir. Onun kafası kuyruk (Şekil 3) uzanır ve damar filizlenmesi engelsiz görünür, yükseltir.

Şekil 3,
Şekil 3.. Zebrafish damar gelişiminin Multiday görüntüleme. Bir multila bir damar13 Zebra balığı iki gün boyunca hafif bir tabaka mikroskobu engelsiz gelişir: Yer (GFP kdrl) Tg'sinden dpf'e 1 monte. Bir 488 nm lazer ışığı floresan levha heyecan ve sinyal 10X/0.3 W objektif ve bir EMCCD kamera kullanılarak tespit edildi. Z-yığınlar dört bitişik pozisyonlarda her 10 dk edinilmiş ve ardından Fiji 15 ile dikilmiştir. Zaman noktalarında bir alt maksimum yoğunluğu projeksiyonları gösterilmiştir. Ölçek çubuğu:. 500 mikron büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Erken Zebra balığı Embriyo Görüntüleme

Burada, döllenmeden sonraki ilk gün boyunca erken Zebrafish embriyojenezin hafif levha mikroskopi için bir montaj desteği olarak FEP tüplerin yeteneği göstermektedir. 8 HPF Tg (H2A: GFP) 14 Zebra balığı embriyo bir i olan bir E3 dolu tüp içinde onun bozulmamış koryon ile monte edildi1 mm çapında nner. Bu koryon hafif bir sıkıştırma ile sonuçlanır. Embriyonik dönemde tüm gelişim süreçleri montaj etkilenmeyen ve optimal ışık levha mikroskobu kullanılarak görülebilir. Bu örnekte, 12 saatlik bir kurs (Şekil 4) üzerindeki numune görüntülenmiş. % 1.5 agaroz içinde koryon olmadan geleneksel monte kullanırken örneğin yumurta sarısı ve orta hat boyunca doku kalınlaşma artan uzama gibi erken embriyojenez sırasında tipik şekil değişiklikleri, baskı olacaktır.

Şekil 4,
. Erken Zebrafish embriyojenezin Şekil 4 Görüntüleme A Tg (H2A: GFP). 14. Zebra balığı erken embriyojenezin geçer. A 488 nm lazer ışığı sac heyecanlı GFP ve floresan sinyal tespit edildiBir 10X/0.3 W ve objektif bir EMCCD kamera ile. İki açılardan Z-yığınlar 12 saatlik bir kurs boyunca her 3 dakikada elde edildi. Geçen zaman bir alt kümesi normalize maksimum yoğunluğu çıkıntılar gösterilmiştir. Hiçbir anestezik kullanılan olarak satın alma sırasında embriyo seğirmesi 19 hpf sonuçlarına Görünür hareket bulanıklığı,. Ölçek çubuğu:. 150 mikron büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Discussion

Gibi hafif levha mikroskobu gibi ileri mikroskopi teknikleri birkaç gün boyunca yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntü verilerini kaydetmek için olanak, aynı zamanda geliştirmek için örnek montaj teknikleri gerektirir. Zebra balığı gelişme hafif levha mikroskopi için montaj çok katmanlı ayrıntılı bir protokol mevcut. Yöntemi uygulamak için basittir ve günlük olarak laboratuarımızda kullanın.

FEP borular

Bizim montaj strateji anahtar bileşenleri, polimer, florinlenmiş etilen propilen (FEP) yapılmış tüplerdir. Biz öncelikle çünkü suya benzer ve bu nedenle ideal su daldırma hedefleri ve sulu ortam gerektiren numune hafif sac mikroskopisi için uygun olan 1,338 onun kırılma indeksi, FEP kullanmaya karar verdi. 0.8 mm iç çapa ve 0.4 mm duvar kalınlığı çok iyi gelişen zebrafish uygun olan borular, 1.6 mm için uygun tipik bir numune tutucu ile birlikte kullanılabilirkılcal damarlar ve sunulan montaj yöntemi için ilk tercihtir. Biz bizim ev inşa kurulumları yanı sıra ticari sistem Carl Zeiss Mikroskobu "Lightsheet Z.1" in iyice test edilmiş ve FEP tüpler, uzun vadeli istikrar sunan optik performansı üzerinde sadece minimal bir etkiye sahip ve nonfluorescent 10 olduğu bulundu. Bununla birlikte, örneğin, numune temizlenmiş farklı bir kırılma indisine ihtiyaç örnekleri ile uygulamalar için uygun değildir.

Tüpler gibi FEP yapılmış folyolar çapları ve kalınlıkları, çeşitli mevcuttur. Buna ek olarak, FEP 260 ° C'de eritilmiş ve böylece özel olarak yapılan numune montaj destek için neredeyse sınırsız olanaklar sunmaktadır edilebilir. Polimer borular temizleme protokolü iyi optik kalitesini sağlamak için çeşitli adımlar içerir neden olan, steril olmayan temin olma eğilimindedirler. Metilselüloz ile kaplama artan Zebrafish embriyo hiçbir parçası polimerine yapışır sağlar.

% 0.1 agaroz için karar agaroz ve metilselüloz 10 farklı konsantrasyonda büyüme oranı ve hareketsizlik kapsamlı testler dayanmaktadır. % 0.1 yukarıda agaroz konsantrasyonları zaten 24 hpf zebrafish büyüme oranı üzerinde ciddi bir etkisi gösterdi. Ayrıca biz anestezi uyuşturucu Tricaine düşük dozlarda kullanın. Tricaine bloklar aksiyon potansiyelleri, böylece beyin ve kaslar arasındaki sinyal iletimini engeller ve kas kasılmaları 16 bastırır. 133-200 mg / L 'lik bir konsantrasyon 24-72 HPF arasında zebrabalıkları yeterli immobilizasyon sağlar. Ancak, Tricaine ve diğer anestezi ilaçlar biz kardiyak ödem gibi göstermek doza bağımlı yan etkileri test. Ayrıca Tricaine gerekli doz embriyonun gelişim aşaması ile değişir. Bu nedenle görüntülü gelişim aşamaları için gerekli miktara Tricaine konsantrasyonunu azaltılması önerilir. En iyi performan sağlamakce ve yan ürünler zehirli oluşumunu engellemek, taze hazırlanmış ya da çözülmüş Tricaine stok çözeltisi kullanılmıştır ışıktan korundu ve 30 ° C'nin üzerinde ısıtılmaması olmalıdır

FEP tüpler içinde gömme da özel ihtiyaçları için hesap için montaj orta kolay değişimine olanak sağlar. Kalbin time-lapse görüntüleme için, biz% 3 metilselüloz ve 100 mg / L Tricaine yerine% 0.1 agaroz ve montaj için 200 mg / L kullanmanızı öneririz. Metilselüloz,% 0.1 agaroz ve böylece kendi başına daha yüksek hareketsizlik sağlayan ve az Tricaine embriyo doğumdan sağlamak için kullanılması gereken daha fazla viskozdur.

Tricaine 30 ° C nin üzerindeki sıcaklıklara duyarlı olduğu ve aynı zamanda performansı ve embriyo olası seğirmesi azalma yol açan, görüntüleme odası içindeki ortam ile seyreltilebilir. Bu nedenle, monte numune dalmış olduğu görüntüleme ortamda da Tricaine kullandığınızdan emin olun. Deneyleriniz yüksek kullanımını gerektiriyorsasıcaklıklar, sürekli bir perfüzyon sistemi ile ya da iki el ile bir zaman-nokta arasında bir tüpü ve bir şırınga ile ya da görüntüleme odası içindeki orta alışverişi önerilir.

Kritik adımlar

Numune montaj sürecinde önemli adımlar tüpe numunenin emme ve agaroz fişin sokma bulunmaktadır. Emme sonradan değiştirmek için zahmetlidir embriyonun başlangıç ​​konumunu tanımlar. Çoklu örnekler bağlamaya hazır olmalı ve montaj kaliteli bir stereo ile izlenmelidir. Örnek yönlendirme tatmin edici değilse bu genellikle embriyo katlanmış olarak, numune hazırlanması ve pistonu sonraki hareketlerinden kaçınmak hızını değiştirerek yardımcı olabilir. % 1.5 agaroz tıpası,% 0.1 agaroz sızmasını önlemek için gereklidir. Tüp içinde tıkacın yüzey gelişimi sırasında numune yönünü etkilememektedir düz olmalıdır. İyi bir sörf elde etmek içinas, agaroz tabakaların farklı kalınlıkları test edilmesi gerekir ve boru yüzeye normal agaroz koymak gerekmektedir. Tüpü biraz Döner ve tüp çekerek dikkatlice çanak fişi serbest bırakır. Montajının kaliteli görüntüleme önce bir stereo ile kontrol edilmelidir.

Multiview görüntüleme

Işık sac mikroskobu biri büyük avantajı multiview görüntüleme, numuneyi döndürmek çoklu açılardan z-yığınları kazanmak ve daha sonra kayıt ve onları kaynaştırmak için yeteneğidir. 3D uzayda z-yığınları kayıt kurulan bir yöntem mutemet belirteçleri 17 olarak numuneyi çevreleyen floresan boncuk kullanılarak boncuk-tabanlı kaydı. Bu yöntem, bununla birlikte bu gibi% 1.5 agaroz gibi katı bir montaj ortamı üzerine dayanır ve bu sayede çok katmanlı Burada yer montaj ile uyumlu görünmektedir. Ancak, pek çok alternatif çözümler uygulamaya bağlı olarak çalışır. İlk olarak, floresan boncuk olabilirsatın alma esnasında görüş alanında olması gerekir agaroz fiş, içine dahil edilebilir. İkinci olarak, aşama pozisyonları flüoresan boncuklar ile bir% 1.5 agaroz kolonu kullanılarak, gerçek deney önce kalibre edilebilir. Üçüncü olarak, flüoresan işaretçileri çekirdekler gibi alternatif birbirlerine göre z-yığınlarının konumunu belirlemek için kullanılabilir.

Buharlaşma

Tipik ışık mikroskobu levha kurulumları orta buharlaşma açık bir örnek odası, kaçınılmaz yol kullanın. Orta montaj orta buharlaşmanın engellenmesi için numunenin hayatta kalması, ve optik ve numune arasında doğru kırılma için gerekli olduğundan, buharlaşmasını önlemek için, aşağıdaki önlemlerden bir veya daha fazla alarak tavsiye. İlk olarak, odacık içindeki ortam sürekli bir perfüzyon sistemine göre değiş tokuş edilebilir. İkinci olarak, orta elle doldurulmuş olabilir. Üçüncü olarak, hazne bir kapak ya da esnek bir folyo ile kaplı olabilir.

Polimer FEP kimyasalların büyük bir çeşitlilik dayanacak şekilde geliştirilmiştir ve dolayısıyla sağlam bir kimyasal olarak atıl ve gaz geçirgen olmayan dir. Çok katmanlı oksijen montaj durumunda sadece agaroz fiş ve agaroz-hava ara yüzeyi boyunca nüfuz ama polimer boru destek olmadan% 1.5 agaroz montaj ile karşılaştırıldığında çok katmanlı montaj oksijen kaynağı ciddi düşük ise bu gösterilecek olmaya devam etmektedir. Zebra balığı morfolojisi tabakalı monte etkilenir önce Ancak,% 1.5 agaroz içinde montajı sadece yaklaşık iki saat için kullanılabilecek uzun süreli görüntüleme için, genel olarak üstün bir çözüm gibi görünmektedir.

Gelişiminin erken aşamaları Görüntüleme

Montaj çok katmanlı şimdi Zebrafish daha eski 24 hpf time-lapse ışık sayfalık mikroskobu için standart gömme tekniği haline gelmiştir. Bunun yanı sıra, biz de erken evre embriyo görüntüleme için polimer tüpleri kullanın. Embryos kendi chorions kalır ve 1 mm'lik bir iç çapa sahip bir tüp içinde FEP monte edilmiş ve E3 ile doldurulur. Zebra balığı serbestçe koryon içinde gelişebilir ve hala iyi ışık levha mikroskobu kullanılarak görüntülü olabilir.

Görünüm

Sunulan katmanlı örnek montaj zebrabalıkları ile gerçek-zamanlı gelişimsel biyoloji hafif sac mikroskobu tam potansiyelini ortaya çıkarır. Bu kolay gibi optik projeksiyon tomografi (OPT) ve diğer organizmalar gibi diğer mikroskopi teknikleri için kabul edilebilir. Biz standart boy FEP tüpler özel ihtiyaçlarına uygun örnek montaj teknikleri doğru sadece ilk adım olduğuna inanıyoruz.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz finansman ve destek için Max Planck Derneği, İnsan Frontier Bilim Programı (HFSP) ve Boehringer Ingelheim Fonds'u teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes Bola S 1815-04 0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe B. Braun Melsungen AG 9161406 V
Sterican Single-Use Cannula, blunt B. Braun Melsungen AG 9180109 0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH 
70% EtOH
Methylcellulose Sigma M0387 supplied as powder
E3 medium (for zebrafish embryos)
1.5 ml Reaction Tube Eppendorf 3810X
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414 supplied as powder
Petri Dish Greiner 633180 plastic, 94 mm x 16 mm
Tricaine Sigma E10521 synonyms:  Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate 
10X/0.3 W Microscope Objective Lens Leica HCX APO L
EMCCD Camera Andor Technology iXon 885 EMCCD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136, (12), 1963-1975 (2009).
  2. Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nat. Methods. 10, (5), 413-420 (2013).
  3. Swoger, J., Muzzopappa, M., López-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J. Biophoton. 4, (1-2), 122-134 (2011).
  4. Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J. Biophoton. 1-11 (2012).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, (5), 566-572 (2011).
  6. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, (5686), 1007-1009 (2004).
  7. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Prot. 2010, (5), (2010).
  8. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 18, (6), 624-632 (2008).
  9. Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. A versatile sample holder for single plane illumination microscopy. J. Microsc. 10, (2013).
  10. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, (17), 3242-3247 (2012).
  11. Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. Oxford University Press. (2002).
  12. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  13. Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. R. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, (23), 5199-5209 (2005).
  14. Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development. Dev. Genes Evol. 211, (12), 603-610 (2001).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  16. Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33, (2), 313-317 (1975).
  17. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).More

Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter