Neovaskularisering (NV) af hornhinden kan komplicere flere visuelle patologier. Ved hjælp af en kontrolleret, alkali-brænde skade model, kan en kvantificerbar niveau af hornhinde NV produceres for mekanistisk undersøgelse af hornhinden NV og evaluering af potentielle terapier for neovaskulære lidelser.
Under normale forhold, hornhinden er avascular, og denne gennemsigtighed er afgørende for at opretholde god synsstyrke. Neovaskularisering (NV) af hornhinden, som kan være forårsaget af traumer, keratoplasty eller smitsom sygdom, nedbryder den såkaldte angiogene privilegium "af hornhinden og danner grundlag for flere visuelle patologier, der kan endda føre til blindhed. Selvom der er flere behandlingsmuligheder til rådighed, den grundlæggende medicinske behov præsenteret af hornhinde neovaskulære sygdomme forbliver udækket. For at udvikle sikre, effektive og målrettede behandlinger, er en pålidelig model af hornhinde NV og farmakologisk intervention kræves. Her beskriver vi en alkali-forbrændinger hornhindeneovaskularisering model i mus. Denne protokol tilvejebringer en fremgangsmåde til anvendelse af en kontrolleret alkali-forbrændinger på hornhinden, indgivelse af en farmakologisk forbindelse af interesse, og visualisering af resultatet. Denne metode kan vise sig Instrumental for at studere de mekanismer og muligheder for intervention i hornhinden NV og andre neovaskulære lidelser.
Cornea blindhed er den fjerde mest almindelige årsag til blindhed, der er ansvarlig for omkring 4% af alle tilfælde 1. Hornhindeneovaskularisering (NV) spiller en væsentlig rolle i mange af disse patologier, herunder herpetisk keratitis (den førende infektiøse årsag til blindhed i vest) og trachom (den hyppigste årsag til infektiøs blindhed på verdensplan) 2. Aktuelle terapier omfatter steroider, non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID), anti-VEGF behandlingsformer, og cyclosporin A samt konventionelle eller laser kirurgiske teknikker 3. Men den stærkt invaliderende karakter af hornhinde NV baserede patologier, manglen på kirurgiske faciliteter, der kan behandle hornhinde NV, og manglen på et stærkt udføre farmakologisk option førte en nylig ekspert rundbordsdiskussion at konkludere, at trods de bevarede behandlingsformer, den grundlæggende medicinske behov præsenteret af disse patologier forbliver udækket 4.
Den menneskelige hornhindebestår af 5 lag, 3 cellulære lag (epitel, stromal og endotel) og 2 interface (Bowman membran og Descemet membran). Den fungerer som en mekanisk barriere og refraktiv overflade for øjet. Dets åbne karakter er konsekvensen af en hårfin balance af dens bestanddele og er integreret til sin rette funktion 5.. Normalt avaskulære hornhinden modtager blod fra mikrokar løber langs den ydre kant, der tilføres fra det ciliære og ophthalmiske arterier. Corneal NV opstår, når en stimulus fremmer angiogenese af disse fartøjer tillader dem at vokse mod midten af hornhinden og således begrænse vision 6. Hornhindeangiogenese omfatter hemangiogenesis og lymphangiogenesis, som resulterer i indvækst af blodkar og lymfekar fra limbal vaskulære arkade mod midten af hornhinden. Dette fører til en opdeling af hornhinde "angiogen privilegium", en stigning i kornea og fibrose, forstyrrelse af hornhindens layers og ødem 7. De præcise udløsere af hornhinde NV er mange, lige fra en reaktion på smittefarlige sygdomme såsom trachom til en kemisk induceret tilstand forårsaget traditionel medicin, industrikemikalier, eller endda kemiske kampstoffer.
De molekylære mekanismer i denne proces er ikke, som endnu, fuldt karakteriseret; har dog et par vigtige spillere blevet identificeret. Under normale forhold hornhinden har en unik "angiogen privilege vedligeholdes af en overflødig vifte af antiangiogene faktorer (såsom opløselige VEGF-R1) 8. Men som reaktion på en ydre stimulus (såsom en skade) vil der være en lokal opregulering af pro-angiogene faktorer (f.eks VEGF-A). Dette tip balancen af pro-og anti-angiogenese faktorer, der ligger til grund for hornhindens angiogene privilegium, og fører til hemangiogenesis, lymphangeogenesis og inflammation, derfor corneabeskadigelse patologi og endda blindhed 9.
<p class = "jove_content"> I betragtning af udækket medicinsk behov for denne yderst invaliderende patologi, er det af interesse for feltet for at have en pålidelig dyremodel af hornhinde NV. Her præsenterer vi en sådan model: kontrolleret alkali-burn skade. Forskellige eye-skade modeller baseret på brug af filter papir ringe har været brugt siden 1970'erne 10. I 1989 en gruppe af Harvard Medical School øjenlæger karakteriseret en standardmodel for en central hornhinde alkali-forbrændinger i kanin baseret på iblødsætning et stykke cirkulært filter papir med natriumhydroxid (NaOH) og anvende det til hornhinden på en bestemt afstand af koncentrationer 11. Siden da er denne teknik blevet tilpasset til anvendelse i mus 12-14. For nylig, Wang lab studeret de terapeutiske virkninger af histon deacetylase (HDAC)-hæmmer SAHA i patogenesen af hornhinde NV bruge en mus hornhinde alkali-forbrændinger model 15.. Metoden i muse hornhinde alkali-forbrændinger model præsenteres her blev byggetprimært på tidligere arbejdet i to andre papirer 14,16.Protokollen præsenteres her resulterer i reproducerbare niveauer af hemangiogenesis, lymphangiogenesis og inflammation, hvilket gør det til et ideelt system til at studere disse tre (indbyrdes) processer. Selv om denne metode giver centraliseret hornhinde NV, flere metoder, der er blevet udviklet til at forårsage mere rettet NV, nemlig sutur af hornhinden 17 og implanteret vækst-faktor udtrykker pellets 18, kunne også være af interesse. Vores protokol er designet til brug i den voksne mus, de…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Dr. Xinyu Li hjælp til at forberede manuskriptet. SW blev understøttet af en Startup fond fra Tulane University, præsidentens Forskningsråd New Investigator Award fra UT Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, en karriere pris udvikling fra forskning til forebygge blindhed fundament, og en Bright Focus Award i alder maculadegeneration Research .
1 mL Syringe | BD | 309659 | |
18 Guage Needle | BD | 305918 | |
10 mL Syringe | BD | 306575 | |
25 Guage Needle | BD | 305916 | |
Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
KCl | Fisher | P217-500 | |
Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
Mounting Medium, Vectashield | Vector | H-1000 | |
NaCl | Fisher | S271-10 | |
NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
Scissors (5mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |