Summary
Неоваскуляризация (Невада) роговицы может осложнить несколько визуальных патологий. Используя контролируемое, модель щелочно-ожога количественному уровень роговицы NV могут быть произведены для механистической изучения роговицы NV и оценки потенциальных методов лечения для неоваскулярных расстройств.
Abstract
В нормальных условиях, роговица аваскулярный, и эта прозрачность имеет важное значение для поддержания хорошего остроту зрения. Неоваскуляризация (Невада) роговицы, которое может быть вызвано травмой, кератопластики или инфекционного заболевания, ломается так называемый 'ангиогенную привилегией »роговицы и составляет основу нескольких визуальных патологий, которые могут даже привести к слепоте. Хотя есть несколько вариантов лечения, фундаментальная медицинская потребность представлен роговицы неоваскулярных патологий остается неудовлетворенным. В целях развития безопасных, эффективных и целенаправленных методов лечения, надежная модель роговицы NV и фармакологического вмешательства не требуется. Здесь мы описываем возможность получения травмы щелочно-ожог роговицы модель неоваскуляризации в мыши. Этот протокол предусматривает способ применения контролируемой щелочно-ожоговой травмы роговицы, введения фармакологического соединение, представляющее интерес, и визуализации результата. Этот метод может оказаться инструментальныхТаль для изучения механизмов и возможностей для вмешательства в роговицы NV и других неоваскулярных расстройств.
Introduction
Роговицы слепота является четвертым наиболее распространенной причиной слепоты, причиной примерно 4% всех случаев 1. Неоваскуляризации роговицы (Невада) играет значительную роль во многих из этих патологий, в том числе герпетического кератита (основной инфекционной причиной слепоты на Западе) и трахомы (ведущей причиной инфекционного слепоты во всем мире) 2. Современные методы терапии включают стероиды, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), анти-VEGF терапии, и циклоспорин А, а также обычные или лазерные хирургические методы 3. Тем не менее, серьезно изнурительных характер роговицы NV основана патологий, малочисленность хирургического оборудования, способных лечить роговицы NV, а также отсутствие сильно выполняющего фармакологической вариант привел недавний экспертный круглый стол на заключение, что, несмотря на дошедших до нас терапии, фундаментальную медицинскую потребность представленный этих патологий остается неудовлетворенным 4.
Роговицы человекасостоит из 5 слоев, 3 клеточных слоев (эпителиальные, стромальные и эндотелия) и 2 интерфейса (Bowman мембраны и десцеметовой мембраны). Он функционирует как механический барьер и преломляющей поверхности для глаз. Его прозрачный характер является следствием тонкий баланс его компонентов и является неотъемлемой частью его нормального функционирования 5. Обычно бессосудистый, роговица получает кровь из микрососудов, проходящую вдоль его внешней кромке, которые питаются от ресничного и глазных артерий. Роговицы NV происходит, когда стимул способствует ангиогенез этих сосудов, позволяя им расти по направлению к центру роговицы и таким образом ограничить видение 6. Роговицы ангиогенез включает hemangiogenesis и лимфангиогенез, которые приводят к врастанию сосудов и лимфатических сосудов от лимба сосудистой аркады к центру роговицы. Это приводит к нарушению роговицы "ангиогенной привилегии», увеличение помутнения роговицы и фиброза, нарушения роговицы лаYers и отек 7. Точные триггеры роговицы NV многочисленны, начиная от ответа на инфекционное заболевание, например, трахомы к химически индуцированного государства вызвало народной медицины, промышленные химикаты, или даже боевых отравляющих веществ.
Молекулярные механизмы этого процесса нет, пока еще, полностью охарактеризованы; однако, несколько ключевых игроков были определены. При нормальных условиях роговица обладает уникальным 'ангиогенную привилегию' поддерживается избыточный массив антиангиогенных факторов (таких, как растворимого VEGF-R1) 8. Тем не менее, в ответ на внешний раздражитель (например, травмы), будет местный регуляция проангиогенных факторов (например, VEGF-A). Это советы баланс про и анти-ангиогенных факторов лежит в основе ангиогенную привилегию роговицы, и приводит к hemangiogenesis, lymphangeogenesis и воспаление, поэтому вызывает роговицы патологии и даже слепоту 9.
<р = класса "jove_content"> Учитывая неудовлетворенная медицинская потребность этого весьма изнурительной патологии, он представляет интерес для области, чтобы иметь надежный животную модель роговицы NV. Здесь мы представляем такую модель: контролируемое повреждение щелочно-ожога. Различные модели глаз травмы на основе с использованием фильтровальной бумаги кольца были использованы с 1970-х годов 10. В 1989 году группа из Гарвардской медицинской школы офтальмологов характеризуется стандартную модель центрального повреждением роговицы щелочно-ожоговой в кролика на основе замачивания кусок круглой фильтровальной бумаги с гидроксидом натрия (NaOH) и применяя его к роговице в определенном диапазоне концентрации 11. С тех пор эта техника была адаптирована для использования в 12-14 мыши. В последнее время лаборатория Ван изучал терапевтические эффекты гистондеацетилазы (HDAC) ингибитора САХА в патогенезе роговицы NV с помощью мыши роговицы щелочно-ожогов модель 15. Методология мыши роговицы щелочно-ожоговой травмы модели, представленной здесь был построенв основном на предварительной работе двух других работах 14,16.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Следующий протокол и представительные результаты использовать HDAC ингибитор Саха качестве примера соединения. Тем не менее, этот протокол является отнюдь не ограничивается к использованию САХА, и рекомендуется в качестве общего метода для проверки влияния растворимых соединений на неоваскуляризации роговицы. Незначительные изменения должны быть сделаны для степени разбавления, а также частоты и длительности применения. Кроме того, соединения, которые легко растворимы в воде смогут быть введены в отсутствие ДМСО.
Этические Заявление: Все эксперименты на животных должны выполняться только в соответствии с национальным законодательством и институциональных правил. Этот протокол был одобрен для использования университета Tulane Уходу за животными и использованию комитета.
1. Подготовка материалов (в порядке использования)
- Отрежьте кусок целлюлозы фильтровальную бумагу (11 мкм) на 2 мм кругах.
- Подготовка 1 М раствора NaOH порастворения 20 г NaOH в 500 мл дистиллированной H 2 O. Хранить при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: решения NaOH вызывают коррозию и может привести к щелочно-ожоги.
- Подготовка обезболивающий коктейль разбавлением 10 мл 100 мг / мл кетамина и 2,5 мл 20 мг / мл ксилазина в 37,5 мл 1х PBS до конечной концентрации 20 мг / мл кетамина и 4 мг / мл ксилазина.
- Приготовьте 0,5%-ный раствор гидрохлорида пропаракаина (для местного обезболивания) растворением 500 мг гидрохлорида пропаракаина в 100 мл отфильтрованной PBS.
- Приготовьте 1х PBS растворением 8 г NaCl, 0,2 г хлорида калия, 1,44 г Na 2 HPO 4 и 0,23 г NaH 2 PO 4 в 900 мл дистиллированной H 2 O. Отрегулируйте до 7,4 рН. Доведите раствор до конечного объема 1000 мл дистиллированной H 2 O и фильтруют для обеспечения стерильности.
- Подготовка 1000 х исходные растворы SAHA при ~ 100 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО) растворением 26,4 мг SAHA в 1 мл ДМСО. Развести в 1х (~ 10 мкМ)Раствор фильтруют в PBS для каждого использования. Храните маточного раствора при температуре -20 ° С в течение до одного месяца. ВНИМАНИЕ: ДМСО является известный токсин и мутагенным.
- Подготовка 4%-ный раствор параформальдегида (PFA) для фиксации. В соответствии с химическим капотом, растворить 4 г PFA в 90 мл PBS. Доведите смесь до 65 ° С и титруют до рН 7,4. После того, как PFA не растворится, довести раствор до конечного объема 100 мл. Хранить при температуре 4 ° С в течение до одного месяца. ВНИМАНИЕ: PFA является, как известно, аллергенным, канцерогенным и токсичным.
- Приготовьте 1х блокирующий буфер разбавлением 5 мл козьей сывороткой и 500 мкл Тритона Х-100 в 94,5 мл PBS.
- Приготовьте 1х промывочный буфер при разбавлении 500 мкл Тритона Х-100 в 99,5 мл PBS.
2. Щелочно-ожогов и обработки соединением
- Замачивание круглый кусочек фильтровальной бумаги, ~ 2 мм в диаметре, в растворе 1 М NaOH.
- Обезболить мышь с инъекцией 100 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина, белыйич составляет ~ 100 мкл анестетика коктейль с этапа 1.3 в 25 г мыши. Анестезия займет ~ 1-2 минут, чтобы установить дюйма Глубина анестезии может определяться мягко зажимая палец или хвост животного, если анестезия достаточно не должно быть никакого ответа. Примечание: Следует проявлять осторожность, чтобы гарантировать мышь не поддаваться анестезии индуцированной гипотермии.
- Использование пипетку, местно применять капли гидрохлорида пропаракаина 0,5% до поверхности роговицы для местного обезболивания.
- Использование стерильного пинцета, забрать кусок NaOH, смоченной фильтровальной бумаги. Если вы заметили избыток NaOH цепляясь или капает из фильтровальной бумаги, коротко нажмите на смоченную фильтровальную бумагу на сухую кусочек фильтровальной бумаги, чтобы поглотить избыток. Поместите кусок NAOH, смоченной фильтровальной бумаги на центральной роговицы. Оставьте его в течение 30 сек для создания острый щелочного-ожог ~ 2 х 2 мм 2 в области. Операционный микроскоп является полезным в правильно размещения фильтровальную бумагу. Примечание: только один глаз от мыши сhould получить травму с другой выступающей в качестве контроля.
- Удалить фильтровальную бумагу. Использование 10 мл шприц, осторожно промойте глаз 10 мл 1x PBS дважды, чтобы смыть остаточной 1 М NaOH.
- Сразу нанесите каплю 1x САХА рабочего раствора (или управления транспортным средством, состоящий из PBS разбавляют ДМСО, не содержащий Саха) местно на роговицу. Повторите приложений 3 раза в день в течение 14 дней. Примечание: в этот период мази антибиотик не рекомендуется, поскольку это может помешать развитию травмы и доставки соединения. Использование жидкого раствора к антибиотикам, такие как 3%-ный раствор гентамицина, вместо этого.
- Перейдем непосредственно к клинической оценке (Протокол 3 ниже) или пожертвовать мышь и выяснять глаза для роговицы плоской горы (протокол 4 ниже) или обычный парафин / замороженные гистология.
3. Клиническая оценка
- Выполните ежедневный осмотр мышей слепым под операционным микроскопом и оценка грorneal Н.В. на основе помутнения роговицы, NV, и размера судна. Используйте как минимум двух наблюдателей и записать окончательный счет, который в среднем из двух.
- Оценка помутнение роговицы на шкале 0-4. 0 = полностью прозрачные; 1 = слегка мутной, радужной оболочки и зрачка хорошую видимость; 2 = немного непрозрачные, радужной оболочки и зрачка еще обнаружить; 3 = непрозрачные, ученики вряд ли обнаружению; и 4 = полностью непрозрачные без вида ученика.
- Оценка NV на шкале 0-3. 0 = нет новых сосудов; 1 = новых сосудов в роговицы лимба; 2 = новых сосудов, охватывающих роговицы лимб и приближающиеся роговицы центр; 3 = новых сосудов, охватывающих роговицы центр.
- Оценка размера судна в масштабе 0:3. 0 = нет новых сосудов; 1 = новых сосудов обнаруживаемые под операционным микроскопом; 2 = новых сосудов легко видеть под операционным микроскопом; 3 = новых сосудов легко видеть без микроскопа.
- Использование цифровой камеры, взять репрезентативные изображения глаза на 7 дней и 14 дней.
4.Роговицы Окрашивание и плоские крепления
- Fix энуклеированные глаз в 4% PFA в течение не менее 1 часа при 4 ° С.
- Перенести глаза на 1x PBS и использовать пинцет, чтобы тщательно удалить излишки ткани.
- С помощью операционного микроскопа, использовать иглу (18 калибра) или микро-нож перфорировать pericorneal область глаза (обратите внимание: это должно выпустить жидкость из глаз).
- С перфорацией, достигнутом в разделе 4.3.1 использовать пару хирургических ножниц вырезать переднюю часть глаза (роговицы) из задней части.
- Трансфер роговицы обратно в 4% PFA для фиксации в течение ночи при 4 ° С.
- Откажитесь от 4% PFA (ВНИМАНИЕ: PFA является опасным и должны быть утилизированы в соответствии с институциональными нормами) и промыть роговице три раза 1x PBS, чтобы удалить остатки PFA.
- Инкубировать в 1x блокирующем буфере в течение по крайней мере 2 ч при комнатной температуре к проницаемыми ткани и предотвращения неспецифического связывания из первичного антитела.
- Применение первичного антитела в блокирующем буфере 1x, при 100-500 кратного разведения. (Например, крыса анти-мышь-РЕСАМ-1 для обнаружения кровеносные сосуды в 1:100, кроличье анти-мышь-LYVE-1 для обнаружения лимфатические сосуды в 1:500 и / или крыса anti-mouse-F4/80 для обнаружения макрофаги 1:100). Инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
- Промыть шесть раз промывочным буфером 1X в течение 1 часа каждый раз при комнатной температуре, чтобы полностью удаления несвязанного первичного антитела.
- Нанесите вторичного антитела в 1x блокирующего буфера на 500-1000 кратного разведения. (Например, 488 нм флуоресцентный отмеченных козьего антитела против крысиного IgG-на 1:800 или 594 нм флуоресцентный отмеченных козьего анти-кроличьего IgG-на 1:800). Инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
- Промыть три раза 1x PBS в течение 1 часа каждого при комнатной температуре в полной мере удаления несвязанного вторичного антитела.
- Передача роговицы в свежую 1x PBS, и с помощью операционного микроскопа, тщательно делают надрезы четыре от периферии к процентаэ. Это должно разделить роговицу на четыре квадранта приблизительно равные (в результате форма должна выглядеть скорее как бабочка) и дайте ему лежать на слайде.
- Установите с монтажным среде, подходящей для флуоресцентных изображений. Для достижения наилучших результатов, образцы должны быть отображены сразу и цифровые фотографии, сделанные, но может храниться в течение нескольких недель в защищенном от света при температуре 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После травмы щелочно-ожоговой, роговицы Н.В. происходит в предсказуемой, зависящим от времени образом. Рисунок 1 демонстрирует суровую разницу как в новых сосудов и помутнения роговицы между необработанной животного (рис. 1А) и животного, обработанного HDAC ингибитором САХА (рис. 1В ) в 7-дневный временной точке.
Фиг.2А и 2В показывают роговицы плоскую гору необработанной контрольной глаза с первичной РЕСАМ-1 и LYVE-1 окрашивания и вторичного Alexa Fluor 488 и 594 окрашивания (соответственно). На фиг 2С и 2D показывают ту же окрашивание на глазу ежедневно обрабатывали ингибитор HDAC САХА, обратите внимание на резкое снижение как hemangiogenesis и лимфангиогенеза.
3А и 3В обеспечивают детальный взгляд на двух пятен. РЕСАМ-1 служит маркером для Блоод сосуды (рис. 3А), в то время как LYVE-1 специфически связывается с лимфатических сосудов (рис. 3б). Наложение двух полей показан на рисунке 3C, позволяющий сравнение hemangiogenesis против лимфангиогенеза а также сравнение отличающейся морфологии клеток.
После PFA фиксации (шаг 4.1), вы можете использовать обычные протоколы секционирования (не описанные в приведенном выше протокола) для генерации либо замороженные или парафином глаза. В то время как это не позволяет тот же уровень количественного вторжения, что плоская гора делает, сагиттальной разделы роговицы может показать вам толщины роговицы и относительную глубину трубок внутри глаза. Рисунки 3D-F показывает сагиттальные, замороженных срезов роговицы и либо F4/80 (окрашивание макрофагов), DAPI (ядерная окрашивание) или объединенного изображения.
Рисунок 1. Прогрессирование неоваскуляризации роговицы через семь дней после травмы щелочно-записи. (А) представитель образ необработанной глаза. (В) представитель изображение глаза лечение три раза в день с нашим соединением интерес (ГДАЦ ингибитора Саха). Обратите внимание на разницу в помутнения роговицы и неоваскуляризации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель изображения необработанным контролем (А и В) и САХА лечение (С и & #160, D) роговицы через семь дней после щелочно-ожогов (А и С) Широкое поле образ эндотелия сосудов окрашивания клеток с PECAM-1.. (В и D) Широкое поле образ лимфатической эндотелия окрашивания клеток с LYVE-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. (А) эндотелия сосудов окрашивание клеток с PECAM-1. (В) лимфатической эндотелия окрашивание клеток с LYVE-1. (С) Merged окрашивание PECAM-1/LYVE-1. (D) F4/80 окрашивание макрофагов в сагиттальной замороженный участок. (Е) DAPI улAining клеточного ядра в сагиттальной резать замороженные разделе. (F) Merged F4/80 и окрашивание DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь приводит к воспроизводимых уровней hemangiogenesis, лимфангиогенеза и воспаление, что делает его идеальной системой для изучения этих трех (взаимосвязанных) процессов. Хотя этот метод производит централизованную роговицы Н.В., несколько методов, которые были разработаны, чтобы вызвать более направленный Н.В., а именно ушивание роговицы 17 и имплантированных фактора роста, выразив гранул 18, также может представлять интерес. Наш протокол предназначен для использования в взрослой мыши, обеспечивая простой в использовании животную модель, а также позволяет лабораторию, чтобы в полной мере воспользоваться множеством молекулярных и трансгенных методов, не готовые к крупным млекопитающим. Данный протокол и представительные результаты подробно использование мышей на фоне C57BL/6J. Белых мышей будет также подходит и может обеспечить для облегчения визуализации; Однако, недавнее исследование показывает, что неоваскулярная реакция белых мышей не может быть столь же драматичным 19. Кроме того, в отличие от несколькихдругие модели неоваскуляризации роговицы Н.В. можно забил с осмотра через операционного микроскопа или даже невооруженным глазом. Если более строгий количественная оценка степени неоваскуляризации требуется, цифровые изображения окрашенных плоской горы могут быть проанализированы с помощью ряда программных пакетов, пример того, как сделать это с Photoshop CS4 можно увидеть в Коннер, и др.. Недавнее Природа Протоколы бумаги "Количественное определение кислорода, вызванной ретинопатии у мыши" 20.
Пропаракаина гидрохлорид представляет собой сложный эфир амино анальгетик применяется как раствор для наружного применения (не исключено, что другие члены этой семьи будет в равной степени приемлем). Даже если животное помещают под общим наркозом для процедуры мы считаем дополнительных актуальных обезболивания этическую необходимость, чтобы предотвратить отмены боли в роговице. Крайне важно, что PBS используется для разбавления ваш соединение и промойте глаз быть отфильтрованы и содержались в чистоте всюду гоэ процедура (проверка на видимых признаков загрязнения Перед использованием). PBS вызывается для основана на индивидуальном лаборатории традиции; любой эквивалентный сбалансированный солевой раствор должен достичь желаемого результата. Кроме того, пересмотр протокола иммуногистохимии представленной здесь может быть необходимо, если антитела из других источников используются (т.е. степени разбавления, необходимого).
Наиболее технически сложной части этой процедуры являются первичное размещение на NaOH, смоченной фильтровальной бумаги и рассечение роговицы. Мы рекомендуем, что оба метода практиковаться до фактического процедуры. Фильтровальная бумага должна быть помещена в центре роговицы с целью содействия равный уровень неоваскуляризации со всех сторон. Любая степень смещения создаст высокий уровень изменчивости от мыши к мыши. Роговицы рассечение требуется немало ловкости рук. Глаз может деформироваться в ответ на попытку перфорировать pericorneal области.Мы рекомендуем использовать острый, небольшой иглы, чтобы сделать первоначальный разрез и выпустить давление внутри. После первоначального выполнен прокол, пара хирургических ножниц может быть вставлен в отверстие и используется для резки вдоль воображаемой линии, разделяющей передней части глаза от заднего чашки глаз. Работа медленно и осторожно должны дать нетронутыми роговицы.
Следует отметить, что в то время как основная цель этого протокола является для анализа эффективности различных соединений в лечении повреждение роговицы щелочно-ожога он также имеет потенциал, чтобы быть использованы для изучения роговицы рану вновь epitheliaztion, роговицы фиброз и лимбальную эпителиальных стволовых обновление клеток. Кроме того, он служит в качестве общей модели для изучения механизмов патологического hemangiogenesis, лимфангиогенеза, и воспаления. Относительная легкость, с которой протокол может быть выполнена, а также его неинвазивной природе, представляет собой привлекательный возможность в естественных условиях соединения скрининга, тестирования эффективностис, и характеристика трансгенных мышиных моделях относительно патологического ангиогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны за помощь доктора Xinyu Ли в подготовке рукописи. З поддержали Startup фонда Тулэйн университета, президента исследовательского совета Нью-следователь премии от UT Юго-западного медицинского центра, NIH Грант EY021862, премию развития карьеры от исследований в области профилактики слепоты основу, и на премию Яркий Фокус в возрастная дегенерация желтого пятна исследований .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 18 G Needle | BD | 305918 | |
| 10 ml Syringe | BD | 306575 | |
| 25 G Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, VECTASHIELD | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5 mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).
- Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).
- Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).
- Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).
- Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
- Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).
- Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).
- Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).
- Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).
- Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).
- Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).
- Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).
- Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).
- Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).
- Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. , (2012).
- Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).
- Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).
- Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).
