Summary
각막의 혈관 신생 (NV)는 여러 시각 병리를 복잡하게 할 수 있습니다. 제어, 알칼리 화상을 입지 모델을 활용, 각막 NV의 정량화 수준은 신생 혈관 질환에 대한 잠재적 인 치료의 각막 NV 및 평가의 기계 론적 연구를 위해 생성 될 수있다.
Abstract
정상적인 조건 하에서, 각막은 무 혈관이며,이 투명도가 양호한 시력을 유지하는데 필수적이다. 외상, 각막 또는 감염성 질병에 의해 야기 될 수있는 각막의 혈관 신생 (NV)은 각막의 소위 '혈관 신생 특권'분해 심지어 실명을 초래할 수있는 다수의 카메라 병리 기초를 형성한다. 사용할 수있는 여러 가지 치료 방법이 있지만, 각막 신생 혈관 병변에 의해 제공되는 기본적인 의료 필요 충족 남아있다. 안전하고, 효과적이며 타겟 요법을 개발하기 위하여, 각막 NV 및 약리학 적 개입의 안정적인 모델이 요구된다. 여기서, 우리는 마우스에서 알칼리 화상을 입지 각막 혈관 신생 모델을 설명한다. 이 프로토콜은 각막, 또한 약리학 화합물을 투여하고, 그 결과의 시각화를 제어 알칼리 화상 손상의 애플리케이션에 대한 방법을 제공한다. 이 방법은 계장 증명할 수탈 각막 NV 및 기타 신생 혈관 질환에 개입 메커니즘 기회를 공부.
Introduction
각막 실명 모든 경우 (1)의 약 4 %에 대한 책임이 실명의 네 번째 가장 흔한 원인이다. 각막 신생 혈관 (NV)가 포진 각막염 (웨스트에서 실명의 주요 감염 원인)와 트라코마 (전세계 전염성 실명의 주요 원인) 2를 포함하여 이러한 병리의 많은에 중요한 역할을한다. 현재 치료는 스테로이드, 비 스테로이드 성 항 염증성 약물 (NSAIDs), 항 VEGF 치료, 및뿐만 아니라 기존의 또는 레이저 수술 기법 3 시클로 스포린 (가) 있습니다. 그러나 각막 NV 기반 병리의 심한 쇠약 자연, 수술 각막 NV 치료를 할 수있는 시설, 강력하게 수행하는 약리 옵션의 부족의 소수는, 현존하는 치료에도 불구하고, 기본적인 의료 필요를 그 결론을 내릴 수있는 최근의 전문가 원탁 회의를 주도 이러한 병리 제시는 4 충족 남아있다.
인간의 각막5 층, 3 층 세포 (상피, 각막 내피 세포)와 2 인터페이스 (보우만 막과 데스 메 막)으로 구성되어 있습니다. 그것은 눈을위한 기계적인 장벽과 굴절 표면으로 작동합니다. 그것의 투명한 자연의 구성 요소의 미묘한 균형의 결과이며 적절한 기능 5에 필수적이다. 일반적으로 무 혈관, 각막은 섬모와 안과 동맥에서 공급되는 바깥 쪽 가장자리를 따라 실행 미세 혈관에서 혈액을 받는다. 자극이 그들을 각막의 중심을 향해 성장하고, 따라서 비전 6을 제한 할 수 있도록 이러한 혈관의 혈관 신생을 촉진 할 때 각막 NV가 발생합니다. 각막 신생 혈관이 각막의 중심을 향해 윤부 혈관 아케이드에서 혈관과 림프 혈관의 증식을 초래할하는 hemangiogenesis과 림프관을 포함한다. 이것은 각막 "혈관 특권", 각막 혼탁 및 섬유증의 증가, 각막 라의 중단의 고장에 이르게yers를, 부종 7. 각막 NV의 정확한 트리거는 기존의 의약품, 산업용 화학 물질, 또는 화학 요원 전쟁의 원인이 전염성 질병에 대한 응답에서 이러한 결막염과 같은 화학적으로 유도 된 상태에 이르기까지, 수많은 있습니다.
이 과정의 분자 메커니즘은 아직 완전히 특징으로하지 않습니다; 그러나, 몇 가지 주요 선수가 확인되었습니다. 정상적인 조건에서 각막 (예 : 수용성 VEGF-R1과 같은) 항 혈관 신생 인자 (8)의 중복 배열에 의해 유지되는 고유 한 '혈관 신생 특권'을 가지고 있습니다. 그러나, (예컨대 부상 등) 외부 자극에 응답하여, 친 혈관 생성 인자 (예를 들어 VEGF-A)의 로컬 상향 조절이있을 것이다. 이 팁 각막의 혈관 신생 권한을 기초, 따라서 각막 병리, 심지어 실명 9 일으키는 hemangiogenesis, lymphangeogenesis, 염증에 이르게 프로 및 항 혈관 신생 인자의 균형.
<P 클래스 = "jove_content는">이 매우 쇠약 병리의 충족 의료 필요 감안할 때, 그것은 각막 NV의 신뢰할 수있는 동물 모델을 가지고 현장에 관심입니다. 제어 알칼리 화상을 입지 : 여기에서 우리는 같은 모델을 제시한다. 필터 종이 반지를 사용하여 기반의 다양한 눈 부상 모델은 1970 년대 10 년부터 사용되어왔다. 1989 년에, 하버드 의과 대학의 안과의 그룹은 수산화 나트륨 (NaOH를) 원형 필터 종이를 담글 및 특정 범위의 각막에 적용을 기반으로 토끼 각막 알칼리 화상 손상의 표준 모델을 특성화 농도 11. 그 이후로,이 기술은 마우스 12-14에서 사용하기 위해 적응되어있다. 최근, 왕 연구소는 마우스 각막 알칼리 화상을 입지 모델 (15)를 사용하여 각막 NV의 병인에서 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 억제제 SAHA의 치료 효과를 연구했다. 여기에 제시된 마우스 각막 알칼리 화상을 입지 모델의 방법론은 내장 된주로 두 가지 다른 논문 (14, 16)의 사전 작업에.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 : 다음 프로토콜과 대표적인 결과는 예를 들어 화합물로 HDAC 억제제 SAHA를 사용합니다. 그러나이 프로토콜은 SAHA의 사용에 한정되는 것은 아니다, 각막 신생 혈관에 수용성 화합물의 효과를 테스트하는 일반적인 방법으로서 추천된다. 약간의 수정은 희석의 정도뿐만 아니라 주파수와 응용 프로그램의 기간 동안 할 필요가있을 것이다. 또한, 물에 쉽게 용해되는 화합물은 DMSO의 부재로 투여 될 수있을 것입니다.
윤리 정책 : 모든 동물 실험은 국가의 법률과 제도 규정에 따라 수행되어야한다. 이 프로토콜은 툴레 인 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 사용이 승인되었다.
1. (사용 순으로) 재료의 제조
- 2mm 원에 셀룰로오스 종이 필터 (11 μM)의 조각을 잘라.
- 로 NaOH를 1 M 용액을 준비500 ㎖의 증류수 H 2 O.에서의 NaOH 20g을 용해 상온에서 보관. 주의 : 수산화 나트륨 용액은 부식성 알칼리 화상을 입을 수 있습니다.
- 최종 20 ㎎ / ㎖ 마취제의 농도와 4 ㎎ / ㎖ 자일 라진에 1X PBS의 37.5 ㎖에 20 ㎎ / ㎖ 자일 라진의 10 ~ 100 ㎎ / ㎖ 케타민 ㎖ 및 2.5 ㎖에 희석하여 마취 칵테일을 준비합니다.
- 여과 PBS 100 ㎖의 proparacaine 염산염 500mg을 용해하여 (국소 마취를 위해) proparacaine 염산염의 0.5 % 용액을 준비한다.
- 8g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 1.44 g 나 2 HPO 4 및 증류 H 2 O. 900 ml 중의 NaH 2 PO 4 0.23 g을 용해하여 1X PBS를 준비 7.4 pH로 조정합니다. 멸균을 위해 증류수 H 2 O 필터 및 1000 ㎖의 최종 부피로 용액을 가져온다.
- DMSO의 1 ml의 SAHA의 26.4 mg의 용해하여 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 ~ 100 ㎜에서 SAHA의 1,000 X 스톡 용액을 준비한다. 1X로 희석 (~ 10 μM)각 사용에 대한 필터링 된 PBS 용액. 최대 한 달 동안 -20 ° C에서 원액을 저장합니다. 주의 : DMSO 알려진 독소와 돌연변이입니다.
- 고정 용 파라 포름 알데히드 (PFA)의 4 % 용액을 준비합니다. 화학 후드, PBS 90 ㎖에 PFA 4 g을 용해. 65 ° C에 혼합물을 가지고, 7.4의 pH를 적정한다. PFA가 용해되면, 100 ㎖의 최종 부피로 용액을 가져온다. 최대 한 달 동안 4 ° C에 보관하십시오. 주의 : PFA는, 극성 발암 성, 독성 것으로 알려져.
- PBS의 94.5 ㎖에 염소 혈청 5 ㎖ 및 트리톤 X-100의 500 UL를 희석하여 1X 차단 버퍼를 준비합니다.
- PBS의 99.5 ㎖의 트리톤 (Triton) X-100의 500 UL를 희석하여 1X 세척 버퍼를 준비합니다.
2. 상해 및 화합물 처리에게 알칼리 굽기
- 1 M의 NaOH 용액에, 직경 여과지의 원형 조각, 1 ~ 2 밀리미터를 적시십시오.
- 뭐, 100 ㎎ / ㎏의 케타민 (ketamine)과 5 ㎎ / ㎏ 자일 라진 주사로 마우스를 마취무형 문화 유산은 ~ 25g 마우스 당 1.3 단계에서 마취 칵테일의 100 μL이다. 마취는 마취는 응답이 없어야합니다 충분한 지, 부드럽게 동물의 발가락이나 꼬리를 곤란에 의해 결정될 수있다 ~ 마취의 깊이 안으로 설정 1 ~ 2 분 정도 소요됩니다. 참고 : 관리는 마우스가 마취 유도 저체온증에 굴복하지 않도록주의해야한다.
- 스포이드를 사용하여 국소 지방 진통제 위해 각막 표면에 0.5 % proparacaine 염산염의 저하를 적용한다.
- 멸균 집게를 사용하여, NaOH를 적신 여과지의 조각을 선택합니다. 당신이 초과 된 NaOH에 집착하거나 여과지에서 떨어지는 통지하는 경우, 간단히 과잉을 흡수하는 필터 종이의 건조 조각에 적신 종이 필터를 누릅니다. 중심 각막에 NAOH 적신 여과지의 조각을 놓습니다. 지역에서 ~ 2 × 2mm 2의 급성 알칼리 화상을 생성하기 위해 30 초를 남겨주세요. 수술 현미경 제대로 종이 필터를 배치에 도움이됩니다. 참고 : 마우스의의 하나의 눈을해야할 것은 다른 컨트롤로 봉사와 부상을 입을 수.
- 필터 용지를 제거합니다. 10 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 잔여 1 M NaOH를 씻어 두 번 1X PBS 10 mL로 눈을 세척하십시오.
- 즉시 1X SAHA 작업 용액 (또는 PBS로 구성된 차량 제어가 더 SAHA를 포함하지 DMSO를 희석) 국소 적 각막에 한 방울을 적용합니다. 14 일 동안 프로그램 3x/day를 반복합니다. 참고 : 부상의 개발과 화합물의 전달을 방해 할 수 있으므로이 기간 동안 국소 항생제 연고는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 액체 항생제 용액과 같은 3 % 겐타 마이신 용액을 대신 사용합니다.
- 임상 평가 (아래 프로토콜 3)로 직접 이동하거나 마우스를 희생 (아래 프로토콜 4) 또는 기존의 파라핀 / 냉동 조직 검사 각막 평면 마운트의 눈을 명백히하다.
3. 임상 평가
- 수술 현미경으로 눈을 멀게 방식으로 마우스의 일일 검사를 수행하고 C 점수orneal NV는 각막 혼탁, NV, 및 선박의 크기에 따라. 적어도 두 관찰자를 사용하고이 평균이다 최종 점수를 기록한다.
- 0-4의 규모에 각막 혼탁 점수. 0 = 완전 지우기; 1 = 약간 불투명, 홍채와 동공을 쉽게 볼 수; 2 = 약간 불투명, 홍채와 동공 여전히 감지; 거의 감지 3 = 불투명, 학생; 동공없이 볼 수있는 완전히 불투명 4 =.
- 0-3의 규모에 NV 점수. 0 = neovessels; 각막 윤부에서 1 = neovessels; 각막 윤부에 걸쳐 각막 중심 접근 2 = neovessels; 각막 중심에 걸친 3 = neovessels.
- 0-3의 규모에 선박의 크기를 점수. 0 = neovessels; 수술 현미경으로 검출 1 = neovessels; 쉽게 수술 현미경으로 본 2 = neovessels; 쉽게 현미경없이 볼 3 = neovessels.
- 디지털 카메라를 사용하여, 7 일, 14 일에 눈을 대표하는 이미지를 가지고.
4.각막 염색 및 평면 마운트
- 4 ℃에서 최소 1 시간 동안 4 % PFA의 탈핵 눈 수정
- PBS를 1 배에서주의 깊게 초과 조직을 제거하는 집게를 사용하여 눈을 전송합니다.
- 수술 현미경의 도움으로 (이 눈에서 유체를 해제해야합니다주의) 눈의 pericorneal 지역을 관통하는 바늘 (18 게이지) 또는 마이크로 칼을 사용합니다.
- 4.3.1에서 만든 천공의 뒤 부분에서 눈 (각막)의 앞쪽 부분을 절단하는 수술 가위를 사용합니다.
- 4 ℃에서 하룻밤 고정에 다시 4 % PFA로 각막을 전송
- (: PFA는 위험 및 기관 규정에 따라서 처리 할 것주의)와 잔여 PFA를 제거하는 1X PBS로 각막을 세 번 씻어 4 % PFA를 폐기하십시오.
- 조직을 투과하고 차 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 실온에서 적어도 2 시간 동안 1X 블로킹 완충액 부화.
- 100 ~ 500 배 희석시, 1X 차단 버퍼에 차 항체를 적용합니다. 1:100에서 혈관을 검출하기위한 (예를 들어 쥐의 항 - 마우스-PECAM-1, 토끼 항 - 마우스 LYVE-1 식세포를 검출 1:500에서 림프관을 검출 및 / 또는 래트 anti-mouse-F4/80위한 1:100에서). 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
- 완전히 언 바운드 일차 항체를 제거하기 위해 실온에서 1 시간 동안 1X 세척 버퍼마다 여섯 번 씻으십시오.
- 1X는 500 ~ 1,000 배 희석에 버퍼를 차단에 차 항체를 적용합니다. (예를 들어, 488 nm의 형광은 1:800에서 염소 항 - 쥐 IgG의 태그 또는 594 nm의 형광은 1:800에서 염소 항 - 토끼 IgG의 태그). 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
- 완전히 언 바운드 차 항체를 제거하기 위해 실온에서 1 시간마다 1X PBS로 3 회 세척한다.
- 신선한 1X PBS로 각막을 전송하고, 수술 현미경의 도움으로 조심스럽게 %를 향해 주변에서 4 절개을어. 이 (결과 모양이 아니라 나비처럼한다) 약 동일한 크기의 네 개의 사분면으로 각막을 나누어 슬라이드에 평평하게 거짓말을 할 수 있도록해야합니다.
- 형광 이미징을위한 설치 매체 적절한으로 마운트합니다. 최상의 결과를 위해, 샘플은 즉시 군데해야하며, 디지털 사진 촬영,하지만 4 ℃에서 빛으로부터 보호 몇 주 동안 저장 될 수있다
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Representative Results
알칼리 화상 부상 후 각막 NV는 예측 가능한 시간에 의존하는 방식으로 발생합니다. 1 처리되지 않은 동물 (그림 1A)와 HDAC 억제제 SAHA (그림 1B로 치료 동물 사이에 신생 혈관 및 각막 혼탁 모두에서 뚜렷한 차이를 보여줍니다 그림 ) 7 일간 시점에서.
도 2a 및도 2b는 기본 PECAM-1과 LYVE-1 염색 및 보조 알렉사 플 루어 488 및 594 염색 (각각)로 치료를받지 않은 눈의 각막 평면 마운트를 보여 주는. 2C 및 2D는 매일 치료 눈에서 동일한 염색을 보여준다 HDAC 억제제 SAHA는 hemangiogenesis 및 림프관 모두에서 극적인 감소를 확인합니다.
도 3a 및도 3b는 두 가지의 얼룩에 대한 상세한 모습을 제공합니다. PECAM-1 BLO 대한 마커를 제공OD 혈관 (그림 3A), LYVE-1은 림프 혈관 (그림 3B)에 특이 적으로 결합하는 동안. 이 필드의 오버레이 림프관 대 hemangiogenesis의 비교뿐만 아니라 다른 세포 형태의 비교를 허용하는,도 3c에 도시된다.
PFA 고정 (단계 4.1)에 따라, 당신은 눈의 냉동 또는 파라핀 하나 포함 된 섹션을 생성합니다 (위의 프로토콜에 설명하지 않음) 기존의 절편 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 평면 마운트하지 침략의 정량의 동일한 수준을 허용하지 않지만, 각막의 시상 부분은 당신에게 각막 두께와 눈 내 튜브의 상대 깊이를 표시 할 수 있습니다. 3D-F는 각막의 시상, 냉동 섹션을 보여줍니다 피규어 과 F4/80 (대식 세포 염색) 중 하나, DAPI (핵 염색), 또는 병합 된 이미지입니다.
그림 1. 처리되지 않은 눈 7 일 알칼리 화상 손상 후 각막 신생 혈관의 진행 상황. (A) 대표 이미지. (B) 눈의 대표 이미지가 우리의 관심 화합물 (HDAC 억제제 SAHA)와 함께 하루에 세 번 치료. 각막 혼탁 및 신생 혈관의 차이를 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 치료를받지 않은 (A와 B)와 사하구의 대표 이미지는 (C와 & # 처리부상을 알칼리 화상 D) 각막 칠일 후에 (PECAM-1와 혈관 내피 세포의 염색 및 C) 넓은 필드 이미지, 160.. (B와 D) LYVE-1 림프 내피 세포 염색의 다양한 분야의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. PECAM-1 (A) 혈관 내피 세포의 염색. (B) LYVE-1 림프 내피 세포의 염색. (C) PECAM-1/LYVE-1 염색을 흡수 합병. (D) 시상 냉동 섹션에서 대 식세포의 F4/80 염색. (E) DAPI 성시상 컷 냉동 섹션에서 세포핵의 aining. (F) F4/80 및 DAPI 염색을 합병하는 것은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 이러한 세 가지 (상호) 과정을 연구하는 이상적인 시스템 만들기, hemangiogenesis, 림프관, 염증의 재현 수준의 결과. 이 방법은 중앙 각막 NV, 펠렛 (18)을 표현하는 성장 인자를 각막 (17), 즉 봉합 더 감독 NV을 유발하기 위해 개발하고 이식 된 여러 가지 방법을 생성하는 동안, 또한 관심이있을 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 또한 더 큰 포유 동물에 대한 아직 사용할 수없는 분자 및 유전자 변형 기술의 호스트를 최대한 활용하기 위해 실험실을 허용하면서 동물 모델을 사용하기 쉽게 제공하는 성인 마우스에 사용하기 위해 설계되었습니다. 위의 프로토콜과 대표적인 결과 세부 C57BL/6J 배경에 마우스의 사용. 흰둥이 쥐도 적합 할 것이다 쉽게 영상을 제공 할 수있다; 그러나, 최근의 연구는 흰둥이 쥐의 신생 혈관 응답이 19 드라마틱하지 않을 수 있음을 나타냅니다. 또한, 여러 달리다른 신생 혈관 모델은 각막 NV는 수술 현미경을 통해 또는 육안으로 검사 득점 할 수있다. 혈관 신생의 범위의 더 엄격한 정량화가 요구되는 경우에, 더러워 평 마운트 디지털 이미지는 소프트웨어 패키지의 개수를 통해 분석 할 수있다, 포토샵 CS4로 이렇게하는 방법의 예는 등 코너에서 볼 수있다. 20 최근 자연 프로토콜 종이 "마우스에있는 산소에 의한 망막 병증의 정량화".
Proparacaine 염산염은 국소 솔루션 (그것은이 가족의 다른 구성원이 동등하게 허용 될 가능성이 있습니다)로 적용 아미노 에스테르 진통제입니다. 동물이 절차에 대한 전신 마취 아래에 배치하더라도, 우리는 추가 국소 마취에게 각막을 취소 고통을 방지하기 위해 윤리 필요하다고 판단. 그것은 PBS가 화합물을 희석 눈이 필터링 세척하는 데 사용 일에 걸쳐 청결하게 유지하는 것이 필수적입니다전자의 절차 (각 사용하기 전에 오염의 흔적을 확인). PBS는 개별 실험실의 전통에 따라 호출된다; 이와 동등한 균형 소금 솔루션은 원하는 결과를 달성해야합니다. 마찬가지로, 여기에 제시된 면역 프로토콜의 버전은 다른 소스에서 항체가 (희석 요구의 정도, 즉)을 사용하는 경우에 호출 할 수 있습니다.
이 절차의 기술적으로 가장 어려운 부분은 NaOH를 적신 여과지의 초기 배치 및 각막 절개한다. 우리는 두 기술이 이전에 실제 절차에 연습을하는 것이 좋습니다. 종이 필터는 모든면에서 신생 혈관의 동일한 수준을 증진하기 위해 각막의 중앙에 배치해야합니다. 오프셋의 정도는 마우스에서 마우스에 변화의 높은 수준을 생성합니다. 각막 절개는 손재주의 좋은 거래를 필요로합니다. 눈은 pericorneal 지역을 관통하는 시도에 대한 응답으로 변형 할 가능성이있다.우리는 초기 절단하고 내부의 압력을 풀어 뾰족한 작은 게이지 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 초기 천공이 이루어진 후, 수술 가위가 홀에 삽입 및 후방 아이 컵으로부터 눈의 전방을 분리하는 가상 선을 따라 절단 할 수있다. 천천히 작업은 그대로 각막을 산출해야한다.
이것은이 프로토콜의 기본 목적은 각막 알칼리 화상 상처 치료에 다양한 화합물의 효능을 검정 동안 그것은 또한 각막 상처 다시 epitheliaztion 각막 섬유증 및 윤부 상피 줄기를 연구하는 데 사용할 수있는 잠재력이 있음을 주목해야한다 세포 재생. 또한, 병적 hemangiogenesis, 림프관, 염증의 메커니즘을 탐구하는 일반 모델 역할을합니다. 프로토콜이 수행 될 수있는 상대적 용이성뿐만 아니라 자연의 비침, 생체 화합물 스크리닝 효능 시험을위한 매력적인 기회를 제공S 및 병리학 적 혈관 신생에 대한 트랜스 제닉 마우스 모델의 특성화.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 원고를 준비 박사 Xinyu의 리튬의 도움에 감사합니다. SW는 튤 레인 대학, UT 사우스 웨스턴 의료 센터, NIH 그랜트 EY021862, 실명 재단을 방지하기 위해 연구에서 경력 개발 포상에서 대통령의 연구위원회의 새로운 탐정 수상, 및 연령 관련 황반 변성 연구에 밝은 초점 수상에서 시작 기금에 의해 지원되었다 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 18 G Needle | BD | 305918 | |
| 10 ml Syringe | BD | 306575 | |
| 25 G Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, VECTASHIELD | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5 mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).
- Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).
- Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).
- Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).
- Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
- Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).
- Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).
- Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).
- Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).
- Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).
- Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).
- Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).
- Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).
- Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).
- Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. , (2012).
- Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).
- Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).
- Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).
