Summary

Een alkali-brandwonden Model van Cornea Neovascularisatie in de muis

Published: April 07, 2014
doi:

Summary

Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies kan compliceren meerdere visuele pathologieën. Met behulp van een gecontroleerde, alkali-brandwonden-model, kan een kwantificeerbare niveau van de cornea NV worden geproduceerd voor mechanistische studie van het hoornvlies NV en evaluatie van potentiële therapieën voor neovascular aandoeningen.

Abstract

Onder normale omstandigheden, het avasculaire hoornvlies, en deze transparantie is essentieel voor het handhaven van goede gezichtsscherpte. Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies, die kan worden veroorzaakt door trauma, keratoplastie of besmettelijke ziekte, breekt de zogenaamde angiogene privilege "van de hoornvlies en vormt de basis van meerdere visuele pathologieën die zelfs kan leiden tot blindheid. Hoewel er verschillende behandeling opties beschikbaar, de fundamentele medische noodzaak door het hoornvlies neovascular pathologieën blijft onvervulde. Om een ​​veilige, effectieve en doelgerichte therapieën te ontwikkelen, is een betrouwbaar model van het hoornvlies NV en farmacologische interventie vereist. We beschrijven hier een alkali-brandwond corneale neovascularisatie model in de muis. Dit protocol verschaft een werkwijze voor het aanbrengen van een gecontroleerde alkali-brandwonden aan het hoornvlies, toedienen van een farmacologische verbinding van belang en visualisatie van het resultaat. Deze methode zou kunnen blijken instrumentatieTal voor het bestuderen van de mechanismen en mogelijkheden voor interventie in de cornea NV en andere neovascular aandoeningen.

Introduction

Hoornvlies blindheid is de vierde meest voorkomende oorzaak van blindheid, verantwoordelijk voor ongeveer 4% van alle gevallen 1. Corneale neovascularisatie (NV) speelt een belangrijke rol in veel van deze ziekten, waaronder herpetische keratitis (de voornaamste infectieuze oorzaak van blindheid in de West) en trachoom (de belangrijkste oorzaak van besmettelijke blindheid) 2. Huidige therapieën omvatten steroïden, niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAIDs), anti-VEGF therapie en cyclosporine A evenals conventionele of laser chirurgische technieken 3. De sterk ondermijnende aard van corneale NV basis pathologieën, het gebrek aan chirurgische faciliteiten kunnen behandelen cornea NV en het ontbreken van een sterk presterende farmacologische optie leidde een recent deskundige ronde tafel te concluderen dat, ondanks de bestaande therapieën, de fundamentele medische behoefte door deze pathologieën nog onvervulde 4.

Het menselijk hoornvliesbestaat uit 5 lagen, 3 cellulaire lagen (epitheel, stroma en endotheel) en 2 interface (Bowman membraan en Descemet membraan). Het functioneert als een mechanische barrière en brekend oppervlak voor het oog. Het transparante karakter is het gevolg van een delicaat evenwicht tussen de componenten en is een integraal onderdeel van de juiste functie 5. Normaal avasculaire, het hoornvlies bloed uit microvessels die langs de buitenrand die worden gevoed vanuit de ciliaire en oogheelkundige slagaders. Cornea NV treedt op wanneer een stimulus angiogenese bevordert deze vaartuigen waardoor ze groeien naar het midden van het hoornvlies en dus zicht 6 beperken. Corneale angiogenese omvat hemangiogenesis en lymfevaten, die resulteren in de ingroei van bloedvaten en lymfevaten van de limbale vasculaire arcade naar het midden van het hoornvlies. Dit leidt tot een afbraak van het hoornvlies "angiogene privilege", een verhoging van het hoornvlies en fibrose, verstoring van de cornea layers, en oedeem 7. De precieze triggers van het hoornvlies NV zijn talrijk, variërend van een reactie op infectieziekten zoals trachoom een ​​chemisch geïnduceerde toestand veroorzaakt traditionele medicijnen, industriële chemicaliën, of zelfs stoffen voor chemische oorlogvoering.

De moleculaire mechanismen van dit proces niet, nog zo, volledig gekarakteriseerd; Er zijn echter een paar belangrijke spelers geïdentificeerd. Onder normale omstandigheden het hoornvlies bezit een unieke 'angiogene privilege' onderhouden door een Redundant Array of anti-angiogene factoren (zoals oplosbare VEGF-R1) 8. In reactie op een externe stimulus (bijvoorbeeld letsel), zal er een lokaal verhoogde expressie van pro-angiogene factoren (zoals VEGF-A). Deze tips het saldo van pro-en anti-angiogene factoren die angiogene voorrecht het hoornvlies ten grondslag ligt, en leidt tot hemangiogenesis, lymphangeogenesis, en ontsteking, dus waardoor de cornea pathologie en zelfs blindheid 9.

<p class = "jove_content"> Aangezien de medische behoefte van deze zeer slopende pathologie, is het van belang het veld om een ​​betrouwbaar diermodel van hoornvlies NV hebben. Hier presenteren we een dergelijk model: gecontroleerd alkali-brandwonden. Diverse eye-verwonding modellen op basis van het gebruik van filterpapier ringen worden al sinds 1970 10. In 1989, een groep van de Harvard Medical School oogartsen gekenmerkt een standaardmodel van een centrale cornea alkali-brandwonden bij konijnen op basis van het weken een cirkelvormig stukje filterpapier met natriumhydroxide (NaOH) en toe te passen op het hoornvlies bij een bepaald bereik van concentraties 11. Sindsdien is deze techniek aangepast voor gebruik in de muis 12-14. Onlangs, Wang lab bestudeerden de therapeutische effecten van histone deacetylase (HDAC) inhibitor SAHA in de pathogenese van corneale NV een muis hoornvlies alkali-brandwonden model 15. De methodiek van de muis hoornvlies alkali-brandwonden hier gepresenteerde model werd gebouwdvooral op het voorafgaande werk van twee andere kranten 14,16.

Protocol

Opmerking: Het volgende protocol en representatieve resultaten te gebruiken de HDAC inhibitor SAHA als voorbeeld verbinding. Echter, dit protocol is geenszins beperkt tot het gebruik van SAHA, en wordt aanbevolen als een algemene methode om de effecten van de oplosbare bestanddelen op corneale neovascularisatie testen. Kleine aanpassingen moeten worden gemaakt verdunningsgraad en frequentie en duur van de toepassing. Bovendien zullen verbindingen die gemakkelijk oplosbaar zijn in water kunnen bij afwezigheid van DMSO wo…

Representative Results

Na alkali-brandwonden, hoornvlies NV treedt op voorspelbare, tijdsafhankelijke wijze. Figuur 1 toont het grote verschil in zowel neovascularisatie en corneale opaciteit tussen een onbehandeld dier (figuur 1A) en een dier behandeld met de HDAC inhibitor SAHA (Figuur 1B ) op de 7 dag tijdstip. Figuren 2A en 2B tonen een corneale vlakke bevestiging van een onbehandelde controle-oog met primaire PECAM-1 en LYVE-…

Discussion

De hier gepresenteerde protocol resulteert in reproduceerbare niveaus van hemangiogenesis, lymfangiogenese, en ontsteking, waardoor het een ideaal systeem om deze drie (samenhangende) processen te bestuderen. Hoewel deze methode levert gecentraliseerde hoornvlies NV, verschillende methoden die zijn ontwikkeld om meer gerichte NV, namelijk het hechten van het hoornvlies 17 veroorzaken en geïmplanteerd groeifactor uitdrukken pellets 18, misschien ook interessant. Ons protocol is ontworpen voor gebru…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn dankbaar voor Dr Xinyu Li's hulp bij de voorbereiding van het manuscript. SW werd ondersteund door een Startup fonds van Tulane University, voorzitter van de Raad voor Onderzoek New Investigator Award van UT Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, een loopbaanontwikkeling onderscheiding van het onderzoek naar Blindheid stichting voorkomen, en een Bright Focus Award in leeftijdsgebonden maculaire degeneratie Onderzoek .

Materials

1 mL Syringe BD 309659
18 Guage Needle BD 305918
10 mL Syringe BD 306575
25 Guage Needle BD 305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse) AbD Serotech MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) Abcam ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) BD 553370
Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat) Invitrogen A11006
Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit) Invitrogen A11012
Camera Tucsen TCC 5.0 ICE
Coverslips Fisher 12-548-B
DMSO Sigma D4540-1L Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris WPI 15915
Forceps (Sharp), Dumont #4 WPI 500340
KCl Fisher P217-500
Ketamine Solution MedVet RXKETAMINE Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope AmScope LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X) AmScope SM-1B
Mounting Medium, Vectashield Vector H-1000
NaCl Fisher S271-10
NaH2PO4 Fisher S397-500
NaOH Fisher S318-1 Caution: Corrosive
Paraformaldehyde P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride Sigma P4554-1G
Scissors (5mm blade), Vanas WPI 14003
Goat Serum MPBio 92939249
Microscope Slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-6508
Xylazine Solution MedVet RXANASED-20

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).
  2. Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).
  3. Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).
  4. Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).
  5. Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
  6. Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).
  7. Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).
  8. Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).
  9. Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).
  10. Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).
  11. Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).
  12. Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).
  13. Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).
  14. Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).
  15. Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).
  16. Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).
  17. Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. , (2012).
  18. Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).
  19. Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).
  20. Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).

Play Video

Cite This Article
Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse. J. Vis. Exp. (86), e51159, doi:10.3791/51159 (2014).

View Video