Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies kan compliceren meerdere visuele pathologieën. Met behulp van een gecontroleerde, alkali-brandwonden-model, kan een kwantificeerbare niveau van de cornea NV worden geproduceerd voor mechanistische studie van het hoornvlies NV en evaluatie van potentiële therapieën voor neovascular aandoeningen.
Onder normale omstandigheden, het avasculaire hoornvlies, en deze transparantie is essentieel voor het handhaven van goede gezichtsscherpte. Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies, die kan worden veroorzaakt door trauma, keratoplastie of besmettelijke ziekte, breekt de zogenaamde angiogene privilege "van de hoornvlies en vormt de basis van meerdere visuele pathologieën die zelfs kan leiden tot blindheid. Hoewel er verschillende behandeling opties beschikbaar, de fundamentele medische noodzaak door het hoornvlies neovascular pathologieën blijft onvervulde. Om een veilige, effectieve en doelgerichte therapieën te ontwikkelen, is een betrouwbaar model van het hoornvlies NV en farmacologische interventie vereist. We beschrijven hier een alkali-brandwond corneale neovascularisatie model in de muis. Dit protocol verschaft een werkwijze voor het aanbrengen van een gecontroleerde alkali-brandwonden aan het hoornvlies, toedienen van een farmacologische verbinding van belang en visualisatie van het resultaat. Deze methode zou kunnen blijken instrumentatieTal voor het bestuderen van de mechanismen en mogelijkheden voor interventie in de cornea NV en andere neovascular aandoeningen.
Hoornvlies blindheid is de vierde meest voorkomende oorzaak van blindheid, verantwoordelijk voor ongeveer 4% van alle gevallen 1. Corneale neovascularisatie (NV) speelt een belangrijke rol in veel van deze ziekten, waaronder herpetische keratitis (de voornaamste infectieuze oorzaak van blindheid in de West) en trachoom (de belangrijkste oorzaak van besmettelijke blindheid) 2. Huidige therapieën omvatten steroïden, niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAIDs), anti-VEGF therapie en cyclosporine A evenals conventionele of laser chirurgische technieken 3. De sterk ondermijnende aard van corneale NV basis pathologieën, het gebrek aan chirurgische faciliteiten kunnen behandelen cornea NV en het ontbreken van een sterk presterende farmacologische optie leidde een recent deskundige ronde tafel te concluderen dat, ondanks de bestaande therapieën, de fundamentele medische behoefte door deze pathologieën nog onvervulde 4.
Het menselijk hoornvliesbestaat uit 5 lagen, 3 cellulaire lagen (epitheel, stroma en endotheel) en 2 interface (Bowman membraan en Descemet membraan). Het functioneert als een mechanische barrière en brekend oppervlak voor het oog. Het transparante karakter is het gevolg van een delicaat evenwicht tussen de componenten en is een integraal onderdeel van de juiste functie 5. Normaal avasculaire, het hoornvlies bloed uit microvessels die langs de buitenrand die worden gevoed vanuit de ciliaire en oogheelkundige slagaders. Cornea NV treedt op wanneer een stimulus angiogenese bevordert deze vaartuigen waardoor ze groeien naar het midden van het hoornvlies en dus zicht 6 beperken. Corneale angiogenese omvat hemangiogenesis en lymfevaten, die resulteren in de ingroei van bloedvaten en lymfevaten van de limbale vasculaire arcade naar het midden van het hoornvlies. Dit leidt tot een afbraak van het hoornvlies "angiogene privilege", een verhoging van het hoornvlies en fibrose, verstoring van de cornea layers, en oedeem 7. De precieze triggers van het hoornvlies NV zijn talrijk, variërend van een reactie op infectieziekten zoals trachoom een chemisch geïnduceerde toestand veroorzaakt traditionele medicijnen, industriële chemicaliën, of zelfs stoffen voor chemische oorlogvoering.
De moleculaire mechanismen van dit proces niet, nog zo, volledig gekarakteriseerd; Er zijn echter een paar belangrijke spelers geïdentificeerd. Onder normale omstandigheden het hoornvlies bezit een unieke 'angiogene privilege' onderhouden door een Redundant Array of anti-angiogene factoren (zoals oplosbare VEGF-R1) 8. In reactie op een externe stimulus (bijvoorbeeld letsel), zal er een lokaal verhoogde expressie van pro-angiogene factoren (zoals VEGF-A). Deze tips het saldo van pro-en anti-angiogene factoren die angiogene voorrecht het hoornvlies ten grondslag ligt, en leidt tot hemangiogenesis, lymphangeogenesis, en ontsteking, dus waardoor de cornea pathologie en zelfs blindheid 9.
<p class = "jove_content"> Aangezien de medische behoefte van deze zeer slopende pathologie, is het van belang het veld om een betrouwbaar diermodel van hoornvlies NV hebben. Hier presenteren we een dergelijk model: gecontroleerd alkali-brandwonden. Diverse eye-verwonding modellen op basis van het gebruik van filterpapier ringen worden al sinds 1970 10. In 1989, een groep van de Harvard Medical School oogartsen gekenmerkt een standaardmodel van een centrale cornea alkali-brandwonden bij konijnen op basis van het weken een cirkelvormig stukje filterpapier met natriumhydroxide (NaOH) en toe te passen op het hoornvlies bij een bepaald bereik van concentraties 11. Sindsdien is deze techniek aangepast voor gebruik in de muis 12-14. Onlangs, Wang lab bestudeerden de therapeutische effecten van histone deacetylase (HDAC) inhibitor SAHA in de pathogenese van corneale NV een muis hoornvlies alkali-brandwonden model 15. De methodiek van de muis hoornvlies alkali-brandwonden hier gepresenteerde model werd gebouwdvooral op het voorafgaande werk van twee andere kranten 14,16.De hier gepresenteerde protocol resulteert in reproduceerbare niveaus van hemangiogenesis, lymfangiogenese, en ontsteking, waardoor het een ideaal systeem om deze drie (samenhangende) processen te bestuderen. Hoewel deze methode levert gecentraliseerde hoornvlies NV, verschillende methoden die zijn ontwikkeld om meer gerichte NV, namelijk het hechten van het hoornvlies 17 veroorzaken en geïmplanteerd groeifactor uitdrukken pellets 18, misschien ook interessant. Ons protocol is ontworpen voor gebru…
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar voor Dr Xinyu Li's hulp bij de voorbereiding van het manuscript. SW werd ondersteund door een Startup fonds van Tulane University, voorzitter van de Raad voor Onderzoek New Investigator Award van UT Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, een loopbaanontwikkeling onderscheiding van het onderzoek naar Blindheid stichting voorkomen, en een Bright Focus Award in leeftijdsgebonden maculaire degeneratie Onderzoek .
1 mL Syringe | BD | 309659 | |
18 Guage Needle | BD | 305918 | |
10 mL Syringe | BD | 306575 | |
25 Guage Needle | BD | 305916 | |
Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
KCl | Fisher | P217-500 | |
Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
Mounting Medium, Vectashield | Vector | H-1000 | |
NaCl | Fisher | S271-10 | |
NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
Scissors (5mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |