Kindlins är grundläggande för celladhesion via integriner men studier av dem har hämmats av svårigheterna i att uttrycka dem rekombinant i bakterievärdar. Vi beskriver här metoder för effektiv produktion i baculovirus-infekterade insektsceller.
Kindlins är viktiga samaktivatorer, med Talin, av cellytereceptorer integriner och även delta i grin utanför-i signalering och kontroll av genen transkription i cellkärnan. De kindlins är ~ 75 kDa multidomain proteiner och binder till en NPxY motiv och uppströms T / S kluster av integrin β-subenheten cytoplasmatisk svans. Den hematopoietically viktiga kindlin isoform, kindlin-3, är kritisk för trombocytaggregationen vid trombbildning, leukocyt-rullning som svar på infektion och inflammation och osteoklast podocyte bildning i benresorption. Kindlin-3: s roll i dessa processer har resulterat i omfattande cellulära och fysiologiska studier. Det finns emellertid ett behov av en effektiv metod för att förvärva högkvalitativa milligrammängder av proteinet för vidare studier. Vi har utvecklat ett protokoll, här beskrivs till effektiv expression och rening av rekombinant murint kindlin-3 genom användning av ett baculovirus-dkluven expressionssystem i Sf9-celler som ger tillräckliga mängder av högren fullängdsproteinet för att tillåta dess biofysiska karakterisering. Samma tillvägagångssätt kan utnyttjas i studiet av de andra däggdjurs kindlin isoformer.
Proteiner i kindlin familjen är en viktig del av fokal adhesion församling, och därför viktigt för komplext liv. Kindlins, av vilka det finns tre isoformer hos däggdjur (kindlin-1, kindlin-2, och kindlin-3), anses samaktivatorer av de extracellulära receptorer integriner tillsammans Talin 1. Integrin-medierad celladhesion ansluter cellytan till den extracellulära matrisen (ECM) i högre eukaryoter. Det är en kritisk och gemensam process i en plethora av fysiologiska fenomen, som inkluderar vävnadsintegritet, embryogenes, benmetabolism, hemostas, och immunitet. Grin-medierad celladhesion aktiveras via inifrån och ut signalöverföring via bindning av Talin och kindlin till grin β-subenhet cytoplasmiska svansar (CTS) vid deras konserverade NPxY motiv. Den biomedicinska betydelse kindlin proteiner sträcker sig dock så långt som till kärnan, där kindlin-2 har visats i flera färska rapporter att vara involverade i transkriptional styra 2,3.
Kindlins är multidomain proteiner av ungefär 75 kDa, stämplad av innehav av en tvådelad C-terminal FERM (4,1 band, ezrin, radixin, moesin) domän, som avbryts av en pleckstrin homologi (PH) domän i centrum för sin F2 domän 4,5. Studier av kindlin-2 och kindlin-3 PH-domäner har visat att det binder till lipid second messengers fosfatidylinositol-(3,4,5)-trisfosfat och fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfat 6-8. Men studier av kindlin-1 PH-området visar att den binder till Ptdlns (3,4,5) P3 med en mycket lägre affinitet, som kan förklaras i kindlin-1 med en isoform-specifika saltbrygga förhindrar lipider från bindande 9. Dessutom finns det ett ~ 100 aminosyra slinga införs i F1-domänen i de kindlins som förutsägs vara ovikt men binder till fosfatidylserin i innerblad av plasmamembranet 10,11. Den kindlin FERMdomän anses homolog till Talin FERM domänen, även om Talin FERM domänen inte har en pleckstrin homologi domän. Både kindlins och Talin interagera med NPxY motiv på grin β-svansar via F3 regionen i deras FERM domän, men kindlin binder till membranet distala motiv, medan Talin riktar membran proximala en 12-16. Kindlins och talin både utöver besitter en N-terminal F0 domän med ett ubiquitin-liknande veck som inte finns i andra FERM proteiner 11,17. Studier av den F0 domänen av kindlin-2 har visat att det oberoende binder till fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfat anrikade membranen 17.
De kindlins uppvisar paralog specifik vävnadsuttrycksmönster och nonredundant fysiologiska funktioner. Kindlin-1 är primärt uttrycks i epidermis, men också i mindre utsträckning kolon, mage och njurar; kindlin-2 ubiquitously uttrycks men koncentreras i tvärstrimmig och slätmuskler och är den enda kindlin uttryckt i fosterutvecklingen 4, och kindlin-3 uttrycks i de hematopoetiska vävnader med den högsta koncentrationen av kindlin-3 som finns i megakaryocyter 18. Dock har senare studier antytt att funktionellt protein uttrycks i endotel vävnader samt 19.
Kindlin-3 är av akut medicinskt intresse på grund av sin viktiga fysiologiska roll i blodet. Det är viktigt för trombocytaggregation och sprida under trombbildning 20, leukocytrullning som svar på infektion och inflammation 21,22 och osteoclast podocyte bildning i benresorption 23. Dessutom utarmning av kindlin-3 hos människor leder till leukocytvidhäftning brist typ-III – en sjukdom som karakteriseras av livshotande blödningsstörningar och återkommande bakteriella infektioner 20,24,25. Kindlin-3 knock-out-studier på möss visade den avgörande funktionen hos proteinet icelladhesion KIND3 -. / – möss visar distinkta fenotyper, såsom allvarlig blödning på grund av inaktiva trombocyter integriner, svår osteopetros och nedsatt leukocytadhesion 20,22, som liknar symtomen hos människor som saknar kindlin-3.
Högupplösta strukturella uppgifter om kindlins, hittills har begränsats till enskilda underdomäner såsom pleckstrin homologi (PH) domän av kindlin-1 9 och kindlin-2 26,27 och F0 domän kindlin-1 11 och kindlin -2 17. De flesta av de underdomäner för varje kindlin polypeptid har dock motstått kloning och strukturanalys (Yates och Gilbert, opublicerade observationer) samt studier av fullängds proteiner har hindrats av att det är svårt att uttrycka och rening av tillräckliga mängder med hjälp av E. coli (opublicerade observationer och Harburger et al. 14). Det finns ett stort medicinskt intresse kindlin-3 och dess funktion, tillsammans med de två andra familjemedlemmar, och nyligen har vi genererat milligrammängder genom rekombinant uttryck i Spodoptera frugiperda-celler som drivs av baculovirus infektion 12. Vi därför här beskriver metoder för framställning av milligrammängder rekombinant mus kindlin-3 i insektscellodling, lämpliga för omfattande strukturella studier och biokemisk analys.
I detta protokoll använder vi oss av en konstruerad knockout bacmid (BAC10 KO: 1629) som är ensam, inte kan producera livskraftiga virioner 28. Det virala DNA: t är således räddas av rekombination med en överföringsvektor som i detta fall ingår även kindlin-3-genen (FERMT3) och resulterar i den FERMT3 genen ersätter viruset mycket sen gen, som uttrycks i hög utsträckning utan överflödig, vilket resulterar i en rekombinant virus som uttrycker mus kindlin-3 som en del av virusets livscykel 28. Vi identifierade dettaFörfarande för framställning av kindlin-3 efter försök att uttrycka och rena det i andra expressionsvärdar visat oöverkomligt svår (opublicerade observationer), utan även på grund av mångsidigheten hos popin vector suite, som vi använde för kloning och som kan utnyttjas i många uttryck är värd 29.
Baculovirus expressionssystem blir allt populärare och ett viktigt verktyg för produktion av milligram mängder av rekombinant protein för proteinkarakterisering använder biofysikaliska studier, inklusive röntgenkristallografi. Trots att mer experimentellt krävande de baculovirus expressionssystem erbjuder flera fördelar jämfört med E. coli en av vilken är en nära-nativa miljö för proteiner av eukaryot ursprung, t.ex. närvaro av lämpliga chaperoner och möjlighet för posttranslationell modifiering. I våra egna ansträngningar att uttrycka kindlin-3, har alternativa uttrycksvärdar används bland däggdjurscelllinjer och bakteriella expressionsstammar (opublicerade observationer). Generellt gäller att många E. coli-stammar som testades gav mycket små kvantiteter av rekombinant kindlin-3 (~ 0,5 mg / l av kulturen; opublicerade observationer). Emellertid baculovirus-driven expression i insektsceller var särskilt effektivt och, i samverkanmparison till transient expression i däggdjursceller, mer mottagliga för att alstra det stora biomassa som erfordras för isolering av ett milligram av rekombinanta cytoplasmatiska proteiner (opublicerade observationer). Vi spekulerar att närvaron eukaryota chaperoner kan möjliggöra en effektiv produktion av kindlin-3.
De baculoviridae infektera insektsceller och för rekombinant proteinexpression baculovirus används i detta arbete är baserat på Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). I naturen AcNPV, som infekterar Autographa californica (alfalfa grensaxen) insektslarver kräver polyhedrinprotein att bilda ocklusioner varvid vironer är inkapslade i en kristallin proteinmatris vilket ger nödvändigt skydd för deras frigivning. I odlade celler erfordras inte bildning av ocklusionskroppar för replikering och är därför onödigt. I fallet med att uttrycka främmande proteiner polyhedrin proteingenen kan vara replaced i en rekombinant AcNPV med genen för proteinet av intresse. AcNPV kan infektera andra lepidopteron arter och i syfte att rekombinant proteinuttryck armé masken Spodoptera frugiperda PUPP äggstock celler används. I den strategi som beskrivs här, är det AcNPV bacmid (BAC10) konstruerad så att en väsentlig viral gen, ORF1629, inaktiveras genom insättning av kloramfenikolacetyltransferas vilket resulterar i en knock-out bacmid (BAC10: KO 1629), så att den är oförmögen att bilda infektiösa baculovirions 28. Samtransfektion av Sf9-celler med linjäriserade BAC10: KO 1629 och FERMT3-innehållande överföringsvektor reparerar det inaktiva ORF1629, genom införlivande, vilket resulterar i en livskraftig genomet som också har införlivat FERMT3-genen under kontroll av polyhedrinpromotorn 28.
Vi beskriver ett reningsprotokoll för isolering av i hög grad ren rekombinant mus kindlin-3 via en three steg kromatografisk metod. De metoder som används här kan lätt tillämpas på andra His-märkta proteiner. Vi har anställt en jonbytessteg att ytterligare rena kindlin-3, men vi anser att detta är ytterligare ett pseudo-affinitetssteg som kindlin-3 har ett stort antal grundläggande rester, däribland en poly-lysin sträcka inom sin F1-domän. Dessutom är kindlin-3 anses binda till och interagera med den cytoplasmatiska ytan av plasmamembranet, där den fungerar, och därför förutsäger vi att kluster av basiska rester kommer att tillåta proteinet att motverka det negativt laddade membranet.
Buffertarna som beskrivs i de reningsprotokoll anses standard och används ofta i strukturell biologi. Den thermofluor analysen (Figur 5) visar att kindlin-3 är stabil på de flesta buffertförhållanden över pH 6,0. Detta var särskilt användbart och viktigt för att informera våra experiment när man studerar kinldin-3: β1En svans interaktion med NMR, vilket gav utmärkt spektra vid pH 6,1 med låga koncentrationer av NaCl 12.
Innan någon biofysiska studie kan utföras, är det viktigt att visa att det renade proteinet av intresse faktiskt korrekt veckad och är funktionellt aktiv. I en tidigare publikation visade vi att den rekombinanta kindlin-3 uttrycks och renas med hjälp av denna metod var en monomer och monodispergerad i lösning, enligt bedömning av storleken-kromatografi, dynamisk ljusspridning, analytisk ultracentrifugering och liten vinkel röntgenspridning, och var även kan binda och erkänna membran-distala NPxY och uppströms serin / treonin kluster av β 1A cytoplasmiska svansar 14, vilket bekräftar att den beter sig som det naturliga proteinet, vilket är i linje med tidigare cellulära och fysiologiska undersökningar 14,20,22. Användningen av en termisk stabilitet analys är ytterligare ett sätt att föreslå the korrekt veckning av ett protein av intresse, som felaktigt vikt protein kommer att resultera i en hög fluorescensbakgrund till följd av exponerade hydrofoba rester.
Den kindlin familj av proteiner har varit i fokus för mycket uppmärksamhet eftersom deras oväntad roll som viktiga samaktivatorer av integriner in vivo upptäcktes. Detta har utlöst mycket ansträngning för att uttrycka dem rekombinant och lösa sina strukturer. Hittills begränsad framgång har rapporterats uttrycka milligrammängder av fullängd rekombinanta proteinet men vi har här beskrivit användning av ett baculovirus-system som tillåter storskalig expression vid nivåer där strukturstudier blivit genomförbart. Genom att generera stora mängder rekombinant kindlin-3 räknar vi med att det kommer att hjälpa ytterligare studier av detta protein. The baculovirus-driven metod och rening arbetsflöde som beskrivs här för rekombinant murint kindlin-3 kan också användas för att uttrycka och rena de andra kindlin isoformer, Vilka också är svåra att uttrycka och också besitter polylysin sträckor och kan ytterligare anpassas för andra cytoplasmiska proteiner, såsom nukleinsyra-bindande proteiner, som misslyckas med att uttrycka i bakteriestammar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Weixan Lu för tekniskt bistånd i kulturen och underhåll av celllager Sf9. LAY fick stöd av ett Medical Research Council (MRC) graduate studentship. RJCG var en Royal Society University Research Fellow. The Oxford Avdelningen för strukturbiologi är en del av Wellcome Trust Center for Human Genetics, Wellcome Trust Kärna Award Grant Number 090532/Z/09/Z.
Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid | Life Technoligies | 10902-096 | store at 4°C and warm to room temperature before use |
Cellfectin II Reagent | InVitrogen | 10362-100 | Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used |
Streptomycin Sulphate (solid) | Melford | S0148 | Sterilise filter (0.22μm filter) before use |
Penicillin G, potassium salt (solid) | Melford | P0580 | Sterilise filter (0.22μm filter) before use |
CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10100-147 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8849 | Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO |
Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I | Sigma | D5025 | |
HisTrap FF (5ml) | GE Heathcare | 17-5286-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
HiTrap Heparin (5ml) | GE Heathcare | 17-0407-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) | Millipore | UFC905024 | 15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator |