Summary
Kindlins أساسية لالتصاق الخلية من خلال لل integrins ولكن تعرقلت الدراسات منهم من الصعوبة التي واجهتها في التعبير عنها في recombinantly المضيفين البكتيرية. نحن هنا وصف الطرق لكفاءة الإنتاج في خلايا الحشرات المصابة الفيروسة العصوية.
Abstract
Kindlins هي coactivators الأساسية، مع تالين، من سطح الخلية مستقبلات لل integrins وأيضا المشاركة في إنتغرين خارج في إشارة، ومراقبة النسخ الجيني في نواة الخلية. وkindlins هي ~ 75 كيلو دالتون البروتينات متعددة المجالات وربط لعزر NPxY والمنبع العنقودية T / S الذيل حشوية إنتغرين β-الوحيدات. شكل الإسوي kindlin hematopoietically الهامة، kindlin-3، هو أمر حاسم لتراكم الصفائح الدموية خلال تشكيل خثرة، الكريات البيض المتداول في الاستجابة للعدوى والالتهابات وتشكيل خلية رجلاء ناقضة العظم في ارتشاف العظم. وقد أدى دور Kindlin-3 في هذه العمليات في الدراسات الخلوية والفسيولوجية واسعة النطاق. ومع ذلك، هناك حاجة إلى وسيلة فعالة للحصول على كميات مليغرام جودة عالية من البروتين لمزيد من الدراسات. وضعنا بروتوكولا، وهنا وصفها، للتعبير عن كفاءة وتنقية المؤتلف kindlin-3 الفئران عن طريق استخدام باكولوفيروس ديعصف نظام التعبير في خلايا Sf9 الغلة كميات كافية من البروتين عالية النقاء كامل طول السماح لها توصيف الفيزيائية الحيوية. يمكن اتخاذها نفس النهج في دراسة أخرى على الأشكال الإسوية kindlin الثدييات.
Introduction
البروتينات للأسرة kindlin هي عنصر حاسم في التجمع التصاق التنسيق، وبالتالي ضروري للحياة معقدة. Kindlins، التي يوجد منها 3 الإسوية في الثدييات (kindlin-1، kindlin-2، وkindlin-3)، وتعتبر coactivators من المستقبلات لل integrins خارج الخلية إلى جانب تالين 1. إنتغرين بوساطة خلية التصاق يربط سطح الخلية إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) في حقيقيات النوى أعلى. بل هو عملية حاسمة ومشتركة في عدد كبير من الظواهر الفسيولوجية، والتي تشمل سلامة الأنسجة، مرحلة التطور الجنيني، والتمثيل الغذائي العظام، والارقاء، والحصانة. يتم تنشيط بوساطة إنتغرين خلية التصاق من الداخل إلى الخارج عن طريق نقل الإشارة عن طريق الربط من تالين وkindlin إلى إنتغرين β-الوحيدات ذيول هيولي (CTS) في الزخارف NPxY الحفظ الخاصة بهم. أهمية الطب الحيوي للبروتينات kindlin يمتد إلا بقدر النواة، حيث ثبت kindlin-2 في عدة تقارير مؤخرا أن تشارك في النسخآل السيطرة 2،3.
Kindlins هي بروتينات متعددة المجالات من ما يقرب من 75 كيلو دالتون، مدموغ من امتلاك آلية سعر الصرف الثابت ثنائية C-محطة (4.1 الفرقة، ezrin، radixin، moesin) المجال الذي يتم مقاطعة من قبل التماثل pleckstrin (PH) النطاق في مركز فرعي F2 ل 4،5. وأظهرت الدراسات من المجالات kindlin-2-3 وkindlin PH أنه يربط رسل الثانية فوسفتيدلينوستول الدهون (3،4،5) trisphosphate وفوسفتيدلينوستول (4،5) bisphosphate 6-8. ومع ذلك، والدراسات في مجال PH kindlin-1 تبين أنه يربط PtdIns (3،4،5) P 3 مع تقارب أقل من ذلك بكثير، والتي يمكن تفسيرها في kindlin-1 عن طريق جسر الملح الإسوي محددة منع الدهون من الربط 9. بالإضافة إلى ذلك، هناك حلقة ~ 100 حمض أميني إدراجها في المجال F1 من kindlins الذي يتوقع أن يتم كشف ولكن بربط فسفاتيديل في النشرة الداخلية للغشاء البلازما 10،11. آلية سعر الصرف الثابت kindlinويعتبر المجال مثلي إلى المجال تالين سعر الصرف الثابت، على الرغم من أن مجال تالين سعر الصرف الثابت لا تملك مجال pleckstrin التماثل. كلا kindlins وتالين التفاعل مع زخارف NPxY على إنتغرين β-ذيول عبر المنطقة F3 المجال سعر الصرف الثابت، ولكن kindlin بربط غشاء عزر البعيدة، في حين يستهدف تالين القريبة غشاء واحد 12-16. Kindlins وتالين على حد سواء بالإضافة تمتلك مجال F0-N محطة مع أمثالها مثل اليوبيكويتين التي لم يتم العثور في البروتينات FERM أخرى 11،17. وقد أظهرت الدراسات على نطاق F0 من kindlin-2 أنه يربط بشكل مستقل لفوسفتيدلينوستول (4،5) bisphosphate الأغشية المخصب 17.
وkindlins تظهر الأنسجة أنماط التعبير paralogue محددة والوظائف الفسيولوجية nonredundant. وأعرب عن Kindlin-1 في المقام الأول في البشرة، ولكن أيضا إلى حد أقل في القولون، والمعدة، والكلى؛ وأعرب عن kindlin-2 بتواجد مطلق ولكن تتركز في محززة وسلسالعضلات وkindlin هي فقط التي أعرب عنها في التطور الجنيني 4، ويتم التعبير عن kindlin-3 في الأنسجة المكونة للدم وفقا لأعلى تركيز kindlin-3 الموجودة في الخلايا السوية العرطلة 18. ومع ذلك، فقد اقترح أكثر الدراسات الحديثة أن يتم التعبير عن بروتين وظيفية في الأنسجة البطانية وكذلك 19.
Kindlin-3 هو من مصلحة الطبية الحادة نظرا لدورها المهم الفسيولوجية في الدم. فمن الأهمية بمكان لتراكم الصفائح الدموية ونشر خلال تشكيل خثرة 20، الكريات البيض المتداول في الاستجابة للعدوى والالتهابات و21،22 تشكيل خلية رجلاء ناقضة العظم في ارتشاف العظم 23. وعلاوة على ذلك، ونضوب kindlin-3 في البشر يؤدي إلى التصاق الكريات البيض نقص النوع الثالث - وهو مرض يتميز النزيف اضطرابات التي تهدد الحياة والالتهابات البكتيرية المتكررة 20،24،25. كشفت Kindlin-3 دراسات خروج المغلوب في الفئران وظيفة حاسمة من البروتين فيالتصاق الخلية KIND3 - / - الفئران الظواهر عرض متميزة، مثل نزيف حاد بسبب لل integrins غير نشط الصفائح الدموية، تصخر العظم الشديد، وضعف التصاق الكريات البيض 20،22، تشبه الأعراض في البشر تفتقر kindlin-3.
حتى الآن، تم تقييد البيانات الهيكلية عالية الدقة على kindlins إلى النطاقات الفرعية الفردية مثل التماثل pleckstrin (PH) مجال kindlin-1 9 و kindlin-2 26،27 والمجال F0 من kindlin-1 11 وkindlin -2 17. ومع ذلك فقد قاوم معظم المجالات الفرعية لكل ببتيد kindlin الاستنساخ والتحليل البنيوي (ييتس وجيلبرت والملاحظات غير منشورة)، وقد عرقلت دراسات من البروتينات كامل طول من صعوبة في التعبير عن وتنقية كميات كافية باستخدام E. القولونية (الملاحظات غير منشورة وHarburger وآخرون 14). هناك اهتمام كبير في kindlin الطبية-3 وفو لnction، جنبا إلى جنب مع اثنين آخرين من أفراد الأسرة، ونحن في الآونة الأخيرة ولدت كميات مليغرام من ذلك عن طريق التعبير المؤتلف في الخلايا frugiperda ورق القطن مدفوعا عدوى الفيروسة العصوية 12. لذا نحن هنا تصف أساليب لإنتاج كميات مليغرام من الماوس المؤتلف kindlin-3 في الثقافة خلية الحشرات، ومناسبة للدراسات الهيكلية واسعة النطاق وتحليل الكيمياء الحيوية.
في هذا البروتوكول والاستفادة من bacmid خروج المغلوب هندسيا (BAC10 KO: 1629) وهذا هو، وحده، قادر على إنتاج virions قابلة للحياة 28. وهكذا أنقذت الحمض النووي الفيروسي عن طريق إعادة التركيب مع ناقلات نقل أنه في هذه الحالة يشمل أيضا الجين kindlin-3 (FERMT3) والنتائج في الجين FERMT3 استبدال الفيروس الجيني في وقت متأخر جدا، وهو ما يعبر عنه للغاية ولكن لزوم لها، مما أدى إلى المؤتلف الفيروس الذي يعبر عن الماوس kindlin-3 كجزء من دورة حياة الفيروس 28. حددنا هذاطريقة لإنتاج kindlin-3 بعد أن أثبتت محاولات للتعبير عن وتطهيره في المضيفين التعبير الأخرى صعبة باهظة (الملاحظات غير منشورة)، ولكن أيضا بسبب براعة من مجموعة ناقلات شبكة المعلومات السكانية، والتي كنا لالاستنساخ والتي يمكن نشرها في العديد من التعبير يستضيف 29.
Protocol
يفترض هذا البروتوكول أن الماوس kindlin-3 الجين (FERMT3) تم استنساخ بنجاح في ناقلات المصب من وقت متأخر جدا P10 المروج وأن ناقلات تمتلك المرافقة تسلسل الفيروسة العصوية للسماح إعادة التركيب مع bacmid BAC10 KO: 1629 التي وضعتها IM جونز و الزملاء 28. لهذا البروتوكول، تم استنساخ الجين kindlin-3 في 29 pOPINE والاشعال واستراتيجية الاستنساخ المستخدمة يمكن العثور موضح في مكان آخر 12. تم تصميم البلازميد بحيث الجين FERMT3 (kindlin-3) هو تحت سيطرة P10 baculoviral المروج وناقلات يحتوي على 5 'UTR/ORF603 وORF 1629 ويشفر-C محطة صاحب 6 شعارا لتنقية مجرى النهر 29.
1. خلية ثقافة الحشرات والصيانة
- قبل التضخيم المؤتلف الفيروسة العصوية والخلايا frugiperda ورق القطن تكييفها مع الثقافة تعليق (خلايا Sf9) ينبغيزراعتها والمحافظة عليها. وينبغي دائما أن تعالج خلايا الحشرات باستخدام تقنيات العقيم في مكرسة زراعة الأنسجة غطاء الدخان.
- يتم تحضين الثقافات تعليق خلايا الحشرات في SF-900 II (SFM) مصل المتوسطة السائل حرة تستكمل مع البنسلين 100 ميكروغرام / مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين في قوارير حتى 27 درجة مئوية مع اهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة.
- الحفاظ على الخلية الحشرات كثافة تتراوح الثقافة بين 1 × 06-1 أكتوبر 7 × 10 خلية / مل عن طريق تقسيم وإضعاف ثقافة الخلية مع الطازجة SF-900 II وسائل الإعلام.
ملاحظة: صحي خلايا ينبغي أن ننظر موحدة في الحجم وينبغي أن تكون كروية الشكل. - عد الخلايا في حجم العينة باستخدام عدادة الكريات والمجهر الضوئي لحساب كثافة الخلية الثقافة.
2. توليد المؤتلف الفيروسة العصوية
- الثقافة والحفاظ على خلايا Sf9 في التعليق باستخدام SF-900 II وسائل الإعلام تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل العسائلن و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين. لتوليد الفيروسة العصوية، يجب أن يكون مثقف خلايا الحشرات لمجموعة كثافة 5 × 10 5 - 1 × 10 6 خلية / مل.
- البذور حوالي 1 × 10 6 خلايا Sf9 لكل بئر من 6 معقمة جيدا نسيج لوحة الثقافة في 2 مل من SF-900 II وسائل الإعلام تستكمل مع البنسلين 100 ميكروغرام / مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين. ترك الخلايا Sf9 في RT في غطاء الدخان على الانضمام إلى قاعدة الآبار البلاستيك وبالتالي تشكيل أحادي الطبقة.
- أداء الجيل الفيروسة العصوية المؤتلف من قبل cotransfecting الحمض النووي DNA البلازميد bacmid وعلى الثقافة أحادي الطبقة.
- لكل ترنسفكأيشن، مزيج 1-2 ميكروغرام من المنقى pOPINE-mFERMT3 الذي يمتلك عناصر ORF1629 الفيروسة العصوية، مع 0.5 ميكروغرام من تنقية BAC10 KO: 1629 في 100 ميكرولتر من SF-900 II الإدارة المستدامة للغابات دون المضادات الحيوية (محلول A).
- في أنبوب منفصلة، وتمييع 6 ميكرولتر من Cellfectin الثاني الكاشف مع 100 ميكرولتر من SF-900 II الإدارة المستدامة للغابات دون المضادةالحيوية لكل رد فعل ترنسفكأيشن (محلول B). يمكن إنشاء 'مزيج الماجستير هنا، لانخفاض مناولة السائل، وإذا كانت هناك حاجة العديد من transfections.
- مزيج من الحلين (A و B، ما يقرب من 200 ميكرولتر) واحتضان على RT لمدة 20 دقيقة لتشكيل مجمع الحمض النووي الدهون.
- تمييع المجمعات الحمض النووي الدهون مع 800 ميكرولتر SF-900 II الإدارة المستدامة للغابات دون المضادات الحيوية. نضح بعناية Sf9 سائل الإعلام أحادي الطبقة الخلية وماصة بعناية الحل A / B وسائل الإعلام على رأس أحادي الطبقة Sf9.
- احتضان الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في حاضنة ترطيب عند 27 ° CO / N وإضافة 1 مل مزيد من SF-900 II الإدارة المستدامة للغابات دون المضادات الحيوية لكل ثقافة أحادي الطبقة في اليوم التالي. احتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية لمدة 5 أيام أخرى.
- حصاد الفيروسة العصوية المؤتلف مباشرة من مستنبت (حوالي 2 مل في المجموع) ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة (على سبيل المثال 15 مل فالكون أنبوب).
- توضيح أي الانقاض الخلية Sf9هو عن طريق الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نقل الفيروس، والتي هي في طاف الناتجة وتدل P1، إلى أنبوب نظيفة وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام حتى الاستخدام. في هذه المرحلة المتبقية Sf9 أحادي الطبقة يمكن استخدامها لتقييم الجيل الفيروس المؤتلف من خلال تقييم وجود المؤتلف kindlin-3 في خلايا الحشرات.
- resuspend وأحادي الطبقة مع 0.5 مل PBS وتمييع عينة 10 ميكرولتر مع أحجام متساوية من 2X العازلة SDS-PAGE التحميل. تسخين العينات عند> 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- يصوتن العينة لمدة 1 ثانية بنسبة 10٪ السعة باستخدام طرف sonicator الصغيرة إذا كان لزج جدا بالنسبة السليم هلام التحميل.
3. التضخيم المؤتلف الفيروسة العصوية
- لالتضخيم من الفيروس في التعليق، واستخدام كثافة الخلايا 1.4 × 10 6 خلية / مل، وهذا ينبغي أن تحتل 1/20 من إجمالي حجم القارورة (أي 50 مل في الثقافةقارورة 2 لتر).
- تحقيق التضخيم من الفيروسات عن طريق إصابة المؤتلف ثقافة الخلية الحشرات مع الأسهم الفيروسية P1 في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 0.1 باستخدام الصيغة التالية؛
ملاحظة: يمكن الافتراض الجيل الفيروس P1 أن يكون لها عيار الفيروسية المتوقع من 1 × 10 7 PFU / مل. ومع ذلك، فإن فحص اللوحة لا يمكن أن يؤديها قبل هذه المرحلة. - احتضان الثقافة الحشرات P1 المصابة حتى 27 درجة مئوية مع اهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 3 أيام (72 ساعة).
- حصاد الفيروس عن طريق فصل الخلايا من وسائل الإعلام بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. حفظ بيليه الخلية الناتجة في هذه المرحلة لتأكيد الإنتاج الفيروس المؤتلف من خلال تقييم kindlin-3 البروتين التعبير SDS-PAGE والنشاف الغربية.
- نقل وسائل الإعلام التخصيب فيروس أوضح لأنبوب نظيفة وتخزينها في 4 درجة مئوية فيالظلام حتى الاستخدام. وتدل هذه الأسهم الفيروسية كما P2.
ملاحظة: A عيار الفيروسية من 2 × 10 8 PFU / مل (أو معدل التضخيم من 100 PFU / خلية) يمكن توقعها.
4. التعبير عن kindlin-3-المصابة الفيروسة العصوية في Sf9
- تنمو حجم كاف من خلايا Sf9 الثقافات في تعليق في SF-900 II SFM تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، قبل نطاق واسع المؤتلف kindlin-3 لتنقية التعبير. احتضان الثقافات التعليق في 27 درجة مئوية مع الهز عند 100 دورة في الدقيقة وبحجم اجمالي الثقافة: قارورة نسبة حجم 01:05.
- تصيب الثقافات تعليق Sf9 في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 خلية / مل.
- تكملة الثقافات Sf9 مع تركيز النهائي من 1٪ (V / V)، يليه مصل بقري جنيني (FBS) مع الفيروس المؤتلف تضخيم (الاسهم-P2 الفيروسية) لإعطاء وزارة الداخلية من 1. احتضان الثقافات المصابة حتى 27 درجة مئوية مع اهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة.
- الحصاد recombinaالإقليم الشمالي kindlin-3-المخبر 6 معربا عن الخلايا Sf9 72 ساعة بعد العدوى عن طريق الطرد المركزي في 1000 x ج وبيليه الخلية الناتجة تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام، أو -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
5. تنقية المؤتلف Kindlin-3
- ذوبان الخلايا المجمدة الحشرات المصابة الفيروسة العصوية (Sf9) الكريات معربا عن المؤتلف kindlin-3 على الجليد.
- resuspend الكرية خلية إذابة مع تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1٪ (V / V) توين-20)، على أن تستكمل مع خالية من EDTA مثبط البروتياز الكوكتيل و1،000-2،000 U من DNase1.
ملاحظة: بدلا من ذلك، الفوسفات مخزنة المالحة تعديل (PBS) يمكن أن تستخدم أيضا، حيث يتم ضبط تركيز كلوريد الصوديوم إلى 500 ملي لمنع التفاعلات غير محددة بين البروتينات الذاتية خلية Sf9 ويجمد العمود تقارب المعدن الذي يستخدم لتنقية المصب (انظر أدناه). - ليز الخلايا التي تفرخ الخلايا معلق مع المنظفات وفوrtexing. يصوتن (40٪ السعة، 10 دورات من 10 ثانية نبض تليها 10 ثانية تبريد) عينة لمزيد من تمزيق الخلايا في حمام جليدي أو بدلا من ذلك استخدام الخالط Dounce.
- توضيح المحللة بواسطة الطرد المركزي في 48،000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تحميل طاف الناتجة على عمود HisTrap (5 مل حجم العمود)، معايرتها مسبقا مع تحلل العازلة، في 4 درجات مئوية بمعدل 1 مل / دقيقة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن حضنت المحللة أوضح مع حجم السرير 1-5 مل من قبل معايرتها حبات sepharose و النيكل (مثل ني سيفاروز 6 تدفق سريع) في 4 درجات مئوية لمدة 1-2 ساعة. يمكن تشكيل طابور من ني sepharose و بعد الخطوة ملزمة باستخدام عمود تدفق الجاذبية. - غسل العمود مع 10 مجلدات عمود من غسل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي إيميدازول) لإزالة البروتينات غير منضم.
- استخدام الانحدار الخطي إيميدازول 10-500 ملم بمعدل 10 ملم / مل (أو في 10 مجلدات العمود) باستخدام AKTA FPLC إلى أزلوkindlin-3-المخبر المؤتلف المربوطة 6.
- يجزئ شطف إلى 0.5-1 مل الكسور باستخدام AKTA FPLC، مع تلك الكسور التي تحتوي على kindlin-3-6 المخبر عادة ما يبلغ حجمه في تركيز إيميدازول 300 ملم.
- تقييم تكوين البروتين من eluant بواسطة SDS-PAGE والتنقيات لأول مرة تأكيد عن طريق النشاف الغربية باستخدام مضاد للله 6 الأجسام المضادة أو مكافحة فأر kindlin-3 الأجسام المضادة.
- تجمع الكسور التي تحتوي على kindlin-3 والصرف العازلة في 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 200 ملي مول كلوريد الصوديوم عن طريق سلسلة من التخفيفات في العازلة وتركيزات العينة باستخدام البروتين المكثف الطرد المركزي مع 50 كيلو دالتون الوزن الجزيئي وقف انتاج المواد الانشطارية (MWCO) في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بدلا من ذلك، dialyze الحل البروتين باستخدام الشرائح-A-lyzer غسيل الكلى كاسيت مع MWCO من 30 كيلو دالتون في 4 درجة مئوية لمدة ساعة إلى 4 O / N في 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 200 ملي مول كلوريد الصوديوم.
ملاحظة: للالتبادل الأيوني (انظر أدناه) أقل تركيز من كلوريد الصوديوم،- تطبيق حل البروتين تبادل عازلة في الصعود إلى قبل معايرتها HiTrap الهيبارين HP العمود (5 مل حجم العمود) باستخدام AKTA FPLC بمعدل 0.5 مل / دقيقة.
ملاحظة: يتم مزال وkindlin-3 ملزمة باستخدام كلوريد الصوديوم الانحدار الخطي (0.2 M كلوريد الصوديوم إلى 1 M كلوريد الصوديوم) في نفس العازلة، زيادة بمعدل 10 ملم / مل. ومن المتوقع أن أزل في ~ 0.6 M كلوريد الصوديوم Kindlin-3-CHIS6.- يجزئ شطف إلى 0.5-1 مل الكسور وتقييم تكوين البروتين بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربية، إذا كان ذلك مناسبا.
ملاحظة: يمكن للمرء أن يتوقع نقاء البروتين ما يقرب من 95٪، وفقا لتقييم SDS-PAGE.- الكسور التي تحتوي على حمام سباحة kindlin-3 والتركيز المكثف باستخدام أجهزة الطرد المركزي مع البروتين 50 كيلو دالتون MWCO إلى الحجم النهائي من 0.5-2 مل.
- في الخطوة الأخيرة، تلميع البروتين المركزة وتبادل العازلة البروتين باستخدام اللوني استبعاد حجم (SEC).
- تطبيق البروتين النقي في الصعود إلى سوperdex S200 (16/60) أو (10/30) قبل معايرتها في 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 200 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT بمعدل 1 مل / دقيقة أو 0.5 مل / دقيقة اعتمادا على حجم العمود المستخدمة.
ملاحظة: يمكن أيضا حجم الاستبعاد اللوني أن يؤديها في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إذا لزم الأمر. - تنقية البروتينات وفقا لحجم من خلال تطبيق العازلة على العمود بمعدل 1 مل / دقيقة أو 0.5 مل / دقيقة، اعتمادا على حجم العمود المستخدمة.
ملاحظة: البروتين يبلغ حجمه من العمود هو مجزأ ورصدها باستخدام الامتصاصية في 280 نانومتر. - ينبغي أن يتوقع ذروة الامتصاصية واحد من المجلس الأعلى للتعليم، والتي هي مجزأة والمقررة من قبل SDS-PAGE لتحديد التجانس، وعادة> 95٪ نقية بعد هذه الخطوة.
- التركيز المطهرون kindlin-3-6 المخبر باستخدام أجهزة الطرد المركزي المكثف البروتين مع 50 كيلو دالتون MWCO إلى ~ 15 ملغ / مل، وفقا لتقييم طيفيا باستخدام معامل الانقراض المحسوبة (ε) من 109320 M -1 سم -1 </ سوب> (على افتراض يتم تخفيض جميع بقايا السيستين).
- للتخزين في -20 درجة مئوية، والتخزين على المدى الطويل في -80 درجة مئوية، وقسامة البروتين في أنابيب PCR وفلاش تجميد العينات في النيتروجين السائل. بدلا من ذلك، هذا البروتين يمكن استخدامها مباشرة للتحقيق فيها باستخدام عدد من التقنيات الحيوية والفيزياء الحيوية.
- تطبيق حل البروتين تبادل عازلة في الصعود إلى قبل معايرتها HiTrap الهيبارين HP العمود (5 مل حجم العمود) باستخدام AKTA FPLC بمعدل 0.5 مل / دقيقة.
Representative Results
التعبير على نطاق واسع من الماوس المؤتلف kindlin-3 باستخدام الخلايا المصابة Sf9 الفيروسة العصوية يمكن أن يستغرق أقل من أسبوعين لتحقيق كميات مليغرام، كما هو موضح في الشكل 1A التخطيطي ويتطلب سوى كمية صغيرة من الحمض النووي البلازميد من عدة QIAprep Miniprep، ل المثال. ويتحقق توليد المؤتلف الفيروسة العصوية التي كتبها cotransfecting خلايا Sf9 مع الماوس kindlin-3 (FERMT3) التي تحتوي على البلازميد معا مع bacmid خطي هندسيا (BAC10: KO 1629) وحصاد virions شكلت حديثا بعد 5-7 أيام، كما هو مبين في الشكل 1A. هذا الأسلوب من نتائج الجيل الفيروسة العصوية في 100٪ من الفيروسات المؤتلف ويوزع أساسا على ضرورة تنقية البلاك 28،30. وهناك على نطاق صغير (2 مل أحادي الطبقة) الثقافة ممثل توليد حل المحتوية على الفيروس المؤتلف مع عيار الفيروسية المتوقع تشكيل وحدات 1 × 10 7 وحة (PFU) لكل مل منالثقافة. يمكن للمرء أن إجراء فحص اللوحة لتحديد عيار الفيروسية الفعلي ولكن هذا ربما أيضا كثيفة العمالة عندما يتم اختبار عدد كبير من البنى الهيكلية للدراسات. نجاح الخطوة الجيل الفيروس يمكن تقييمها باستخدام البلازميد التي تحتوي على EGFP في موازاة ذلك، أو، لهذا البناء kindlin-3، وأحادي الطبقة Sf9 يمكن معلق في برنامج تلفزيوني والمقررة من قبل SDS-PAGE والنشاف الغربية، والذي يدل عادة الفرقة واضحة الموافق 75 كيلو دالتون صاحب الموسومة البروتين، كما هو مبين في الشكل 1B. يتم تضخيمه الفيروس بعد ذلك إلى توليد كميات كافية على نطاق واسع (وحدات التخزين لتر) عدوى الخلية الحشرات والعزلة المؤتلف البروتين. يتم إنشاء فيروس المقطع الثاني (P2) عن طريق إصابة الثقافات التعليق مع وزارة الداخلية تقدر ب 0.1 (انظر البروتوكول). فمن الأهمية بمكان أن التضخيم Sf9 الثقافة التعليق تحتل سوى العشرين لإجمالي حجم القارورة. هذا تهوية إضافية يضمن أن ينتج فيرولنا المحتوية على وسائل الإعلام، التي تحصد بعد 3 أيام (72 ساعة) بعد الإصابة، وتوليد كميات كافية من kindlin-3 في ثقافة التعبير اللاحقة. يفترض أن الأسهم الفيروس تضخيم (P2) لتمتلك عيار الفيروسية المتوقعة من 2 × 10 8 PFU / مل على أساس تقدير متحفظ من 100 PFU / خلية باستخدام الكثافة خلية من 2 × 10 6 خلية / مل خلال التضخيم 31. عموما، لإنتاج الأمثل التضخيم الفيروسة العصوية والبروتين، وينبغي أن تكون خلايا Sf9 موحدة في الحجم وكروية، كما هو مبين في الشكل 1C. بالإضافة إلى ذلك، التضخيم الفيروسية والبروتين التعبير هو الحد الأقصى في 72 ساعة بعد الإصابة، ويتم تخفيض حد سواء بشكل ملحوظ في 96 ساعة بعد العدوى.
مرة واحدة وقد تم تضخيم الفيروسات واستخدامها لتصيب خلايا Sf9 في التجارب على نطاق واسع يتم تنقيته المؤتلف kindlin-3 جزئيا بحكم المهندسة C-محطة له 6 علامة باستخدام يجمد الاستشراب تقارب المعدن لهاالكروماتوغرافي، كما هو مبين في الشكل 2. فمن المهم لتنفيذ عملية تنقية في 4 درجات مئوية، وقد أضاف أن مثبطات الأنزيم البروتيني الكافي لمنع التحلل البروتيني. وkindlin-3 المنقى جزئيا هو زيادة تخصيبه إلى قرب التجانس بواسطة التبادل الأيوني اللوني (IEC) باستخدام عمود الهيبارين، كما هو موضح في الشكل 3. استخدمناها استخدام عمود الهيبارين بدلا من عمود التبادل الأيوني التقليدية، كما توقعنا أن عدد كبير من بقايا الأساسية، بما في ذلك امتداد بولي يسين داخل نطاق kindlin F1-3، سوف تتفاعل بقوة مع المجموعات كبريتات سالبة الشحنة العمود. هذه الاستراتيجية مفيدة بشكل خاص لالحمض النووي والبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي مع بقع ملزمة الحمض النووي الأساسية، على سبيل المثال محطة ملزم RNA uridylyltransferase Cid1 32. أخيرا kindlin-3 النقاء هو "مصقول" حسب حجم الاستبعاد اللوني لإزالة الركام وتحقيق التجانس، كما هو مبين فيالشكل 4. المخازن المؤقتة المحددة في البروتوكولات هي مخازن القياسية التي يكثر استخدامها في تنقية البروتين عن التحليل البنيوي. عموما، وتجنب مخازن القائم على الفوسفات لتنقية البروتينات للدراسات الهيكلية، وخاصة فحص التبلور نظرا لتكوين بلورات فوسفات في بلورة قطرات (وخاصة للتجارب في 4 درجات مئوية). ومع ذلك، أجرينا مقايسة التحول الحراري استنادا Thermofluor لتحديد مخازن التي استقرار لkindlin-3، كما هو مبين في الشكل 5. لفترة وجيزة، والمخفف حل البروتين النقي في المخازن المؤقتة التي تغطي مجموعة واسعة من درجة الحموضة وتركيز الصوديوم كلوريد، وبالتالي تشكيل الشاشة 2 الأبعاد. يتم قياس ذوبان البروتين من خلال مراقبة مضان من Sypro البرتقال صبغة (تحقيقات الجزيئية)، التي تربط لبقايا مسعور داخل البروتين الأساسية مطوية، على مدى درجة حرارة 20-95 درجة مئوية (293-368 K). منتصف النقطة درجة الحرارة التي الالبروتين تتكشف ه تم احتساب (درجة حرارة التحول، T م) باستخدام برنامج مراقبة Opticon ويوصف في مكان آخر 33. ولوحظ Kindlin-3 أن تكون مستقرة في تركيزات عالية كلوريد الصوديوم (500 ملم) في نطاق درجة الحموضة 7،0-9،0، مع درجة حرارة التحول متناسقة (T م) من 55 درجة مئوية. وقد لوحظ أيضا أن T م من Kindlin-3 كان ما يقرب من 55 درجة مئوية في نطاق درجة الحموضة 7،0-7،5 بغض النظر عن تركيز الصوديوم كلوريد.
وجدنا أن هناك التحلل البروتيني محدود من kindlin-3 خلال تنقية ولكن أثبت تحليل SDS-PAGE مركزة للغاية من البروتين (~ 15 ملغ / مل) مع اثنين من التلوث محدودة البروتينية إضافية من كثافة متساوية. الغريب، ولكن ليس هناك ما يدل الأنواع إضافية حسب حجم الاستبعاد اللوني، كما هو مبين في الشكل 4. وبالتالي يعتقد أن هذا البروتين هو رصدت من قبل ولكن لا تزال مطوية البروتياز وhydrodynتمييزه amically من البروتين كامل طول. ومن المثير للاهتمام، هو Calpain البروتيني المعروف أن يشق kindlin-3 في Tyrosine373، والذي هو في حلقة β1-β2 من التماثل pleckstrin (PH) للنطاق 34 و قد يفسر ملاحظاتنا. علاوة على ذلك، النشاف الغربية يكشف عن أن واحدة من الحلل ببتيد تمتلك-C محطة صاحب العلامة والوزن الجزيئي واضح من صدرة، عندما لخص، يساوي 75 كيلو دالتون، وهو نفس الوزن الجزيئي للبروتين كما الأم. العائد من تنقية kindlin-3 المؤتلف للتر الواحد من خلايا Sf9 (~ 2 غرام من الوزن الخلية) هو، في أحسن الأحوال، 5 ملغ.
الشكل 1. نظرة عامة نظرة عامة على الخلية المصابة الفيروسة العصوية الحشرة مغاير التعبير البروتين (أ) A schematized من generatio الفيروسة العصويةن والتعبير عن kindlin-3 في خلايا Sf9. في الخطط ناقلات DNA، هو لون 5'UTR / ORF603 باللون الأحمر، والملونة باللون الأخضر وORF1629، هو لون الجين من البروتين من الفائدة (POI) الأزرق. (B) لطخة غربية، وذلك باستخدام مضاد للله 6 الضد، ستة على نطاق صغير (2 مل أحادي الطبقة) الثقافات (الممرات المسمى وفقا للثقافة) من الخلايا المنتجة للSf9 الفيروسة العصوية المؤتلف والمؤتلف kindlin-3 الفئران. (C) ضوء صورة مجهرية من الخلايا Sf9 صحية نمت في تعليق في SF-900 II SFM تستكمل مع المضادات الحيوية ونقل إلى 35 ملم صحن زراعة الأنسجة بشكل جيد (انظر البروتوكول). الصورة 20X التكبير.
الشكل 2. Represeتنقية ntative من kindlin-3 من قبل يجمد اللوني تقارب المعادن (إيماك). SDS-PAGE من النيكل تقارب المنقى المؤتلف الفئران أعرب kindlin-3 في الخلايا المصابة الفيروسة العصوية Sf9 (~ 2 غرام من الوزن الخلية). ومزال البروتين كثف باستخدام التدرج إيميدازول (كما هو موضح أعلاه الجل). وصفت الممرات النحو التالي؛ ميغاواط، الوزن الجزيئي علامة؛ ليز، المحللة خلية كاملة؛ FT، تتدفق من خلال (غير منضم)؛ WI، غسل 1؛ WII، وغسل 2. تم إجراء تحليل لطخة غربية (أدناه) أيضا باستخدام الكسور شطف لتأكيد وجود المهندسة صاحب العلامة على البروتين المؤتلف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. الدعوة موجهةلاحظ تنقية sentative من kindlin-3 بواسطة الهيبارين تقارب اللوني. (A) ملف شطف عند 280 نانومتر (الأزرق) عرض ذروة متناظرة واحد يبلغ حجمه تحت كلوريد الصوديوم الانحدار الخطي (الأخضر) باستخدام مجموعة تركيز كلوريد الصوديوم من ،05-1،0 M. ( ب) تحليل SDS-PAGE لشطف مجزأة مما يدل على وجود البروتين كيلو دالتون 75، kindlin-3 (K3 المسمى). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الممثل الترشيح هلام اللوني ومركزة kindlin-3 (أ) الترشيح جل الشخصي شطف من المنقى kindlin-3 باستخداموSuperdex S200 (16/60) في تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم و 1 ملي DTT عند 20 درجة مئوية. على أساس حجم شطف، kindlin-3 يهاجر كما هو متوقع ل75 كيلو دالتون البروتين، مما يشير إلى أنه في الغالب أحادى. (B) SDS-PAGE عالية التركيز من المنقى المؤتلف kindlin-3 في 14.5 ملغ / مل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تخفيفه مقرها Thermofluor الرقم 5. الفحص التحول الحراري لفحص المخزن المؤقت. Kindlin-3 في مخازن مختلفة تضم شاشة ثنائية الأبعاد من درجة الحموضة في مقابل تركيز الصوديوم كلوريد. وقد لوحظت درجات الحرارة التي تمر بمرحلة انتقالية (درجة الحرارة منتصف نقاط) من خلال مضان منصبغة ملزمة hydrophobically، Sypro البرتقال (تحقيقات الجزيئية) وتحسب باستخدام برنامج مراقب Opticon. (A) والرسم البياني 3D من درجات الحرارة التي تمر بمرحلة انتقالية يتم رسم جنبا إلى جنب مع (B) التغير في درجة حرارة التحول من المتوسط المحسوب من 50.4 درجة مئوية. من أجل الوضوح وأشرطة ملونة وفقا لمجموعة من درجات الحرارة التي تتلاءم معها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
نظم التعبير الفيروسة العصوية تزداد شعبية وأداة مهمة لإنتاج كميات مليغرام من البروتين المؤتلف لتوصيف البروتين باستخدام الدراسات الفيزيائية الحيوية، بما في ذلك البلورات بالأشعة السينية. على الرغم من كونه تجريبيا تطالب بالمزيد من نظم التعبير الفيروسة العصوية تقدم العديد من المزايا أكثر من E. القولونية واحدة منها هي بيئة شبه الأصلي للبروتينات من أصل حقيقية النواة مثل وجود مرافقين وفرصة للتعديل بعد متعدية المناسبة. في جهودنا للتعبير عن kindlin-3، واستخدمت المضيفين التعبير البديلة بما في ذلك الثدييات خلية خطوط وسلالات بكتيرية التعبير (الملاحظات غير منشورة). عموما، فإن العديد من E. القولونية سلالات اختبار إنتاج كميات صغيرة جدا من المؤتلف kindlin-3 (~ 0.5 ملغ / لتر من الثقافة؛ الملاحظات غير منشورة). ومع ذلك، كان التعبير يحركها الفيروسة العصوية في خلايا الحشرات وفعالة بشكل خاص، بالتعاونmparison في التعبير عابرة في خلايا الثدييات، وأكثر قابلية لتوليد الكتلة الحيوية الكبيرة المطلوبة لعزل ملليغرام من البروتينات المؤتلف هيولي (الملاحظات غير منشورة). نحن التكهن بأن وجود مرافقين حقيقية النواة قد تسمح للكفاءة الإنتاج من kindlin-3.
وbaculoviridae تصيب خلايا الحشرات والمؤتلف للتعبير البروتين يستند الفيروسة العصوية المستخدمة في هذا العمل على Autographa californica فيروس polyhedrosis النووية (AcNPV). في طبيعة AcNPV، الذي يصيب Autographa californica (البرسيم lopper) يرقات الحشرات، يتطلب البروتين polyhedrin لتشكيل انسداد حيث يتم تغليف virons في مصفوفة البروتين البلورية وبالتالي توفير الحماية اللازمة للإفراج عنهم. في الخلايا المستزرعة غير مطلوب تشكيل الهيئات انسداد للنسخ المتماثل، وبالتالي يمكن الاستغناء عنها. في حالة التعبير عن البروتينات الأجنبية يمكن أن يكون هذا الجين البروتين polyhedrin صeplaced في AcNPV المؤتلف مع الجين للبروتين من الفائدة. AcNPV يمكن أن تصيب الأنواع الأخرى وLepidopteron لأغراض المؤتلف دودة ورق القطن التعبير البروتين الجيش frugiperda تستخدم خلايا المبيض العذراء. في النهج المذكورة هنا، تم تصميم وbacmid AcNPV (BAC10) بحيث يتم المعطل الجينات الفيروسية الأساسية، ORF1629، من قبل الإدراج من الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز مما أدى إلى bacmid خروج المغلوب (BAC10: KO 1629)، من النوع الذي هو غير قادر على تشكيل baculovirions المعدية 28. Cotransfection خلايا Sf9 مع BAC10 خطي: KO 1629 وFERMT3 المحتوية على نقل متجه للإصلاح ORF1629 غير نشط، من خلال تبديل، مما أدى إلى الجينوم قابلة للحياة التي أدرجت أيضا الجين FERMT3 تحت سيطرة المروج polyhedrin 28.
نحن تصف بروتوكول تنقية لعزل الماوس المؤتلف نقية للغاية kindlin-3 عن طريق ثلاث،الخطوة e نهج الكروماتوغرافي. يمكن بسهولة أن تطبق الأساليب المستخدمة هنا إلى غيرها من البروتينات صاحب الموسومة. استخدمناها خطوة التبادل الأيوني لمزيد من تنقية kindlin-3 ولكننا نعتقد أن هذه خطوة أخرى شبه تقارب كما kindlin-3 تمتلك عددا كبيرا من بقايا الأساسية، بما في ذلك امتداد بولي يسين داخل نطاق F1 لها. بالإضافة إلى ذلك، يعتبر kindlin-3 لربط والتفاعل مع مواجهة حشوية من غشاء البلازما، حيث يعمل، وبالتالي نتوقع أن تجميع المخلفات الأساسية سيسمح البروتين لمواجهة غشاء سالبة الشحنة.
تعتبر مخازن موضح في البروتوكولات القياسية تنقية وكثيرا ما تستخدم في علم الأحياء الهيكلي. مقايسة thermofluor (الشكل 5) يدل على أن kindlin-3 هو مستقر في معظم الظروف العازلة أعلاه الرقم الهيدروجيني 6.0. وكان هذا مفيدا بشكل خاص ومهم لإعلام تجاربنا عند دراسة kinldin-3: β1وهناك تفاعل الذيل بواسطة الرنين المغناطيسي، والذي أثمر أطياف ممتازة في درجة الحموضة 6.1 مع تركيزات منخفضة من كلوريد الصوديوم 12.
قبل أن تتمكن من إجراء أي دراسة الفيزياء الحيوية، فمن المهم لإثبات أن البروتين المنقى من الفائدة هو في الواقع مطوية بشكل صحيح ونشطة وظيفيا. في منشور سابق أثبتنا أن kindlin-3 المؤتلف وأعرب وتنقيته باستخدام هذا الأسلوب كان مونومر وmonodispersed في الحل، وفقا لتقييم اللوني الحجم الاستبعاد، وتشتت الضوء الحيوي، تنبيذ فائق التحليلية والصغيرة زاوية تشتت الأشعة السينية، وكان أيضا قادرة على ربط والاعتراف NPxY غشاء القاصي والمنبع العنقودية سيرين / ثريونين من β 1A ذيول حشوية 14، مما يؤكد أنه يتصرف مثل البروتين الأم، وهو ما يتماشى مع الدراسات الخلوية والفسيولوجية السابقة 14،20،22. استخدام فحص الاستقرار الحراري هو وسيلة إضافية ليوحي عشرسوف البريد لطي السليم للبروتين من الفائدة، والبروتين مطوية بشكل غير صحيح يؤدي إلى خلفية مضان عالية بسبب مخلفات مسعور عرضة للخطر.
وكانت عائلة من البروتينات kindlin محط اهتمام الكثير منذ اكتشاف دور غير متوقع على النحو coactivators أساسيا من لل integrins في الجسم الحي. وقد أثار هذا الكثير من الجهد للتعبير عنها recombinantly وحل هياكلها. حتى الآن تم الإبلاغ عن نجاح محدود في التعبير عن كميات مليغرام من كامل طول البروتين المؤتلف ولكن لدينا هنا وصف استخدام نظام الفيروسة العصوية التي تسمح التعبير على نطاق واسع على المستويات حيث أصبحت الدراسات البنيوية الممكنة. عن طريق توليد كميات كبيرة من المؤتلف kindlin-3 ونحن نتوقع أن هذا سوف يساعد المزيد من الدراسات من هذا البروتين. ويمكن أيضا أن طريقة سير العمل وتنقية يحركها الفيروسة العصوية وصفها هنا لالمؤتلف الفئران kindlin-3 يمكن استخدامها للتعبير عن وتنقية الأشكال الإسوية kindlin أخرى، والتي هي أيضا من الصعب للتعبير عن وتمتلك بولي يسين تمتد أيضا، ويمكن تكييفها لمزيد من البروتينات السيتوبلازمية الأخرى، مثل البروتينات ملزمة الحمض النووي، التي تفشل في التعبير عن سلالات بكتيرية.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر Weixan لو لتقديم المساعدة التقنية في الثقافة والمحافظة على مخزون الخلية Sf9. وأيد LAY من قبل مجلس البحوث الطبية (MRC) studentship الدراسات العليا. كان RJCG زميل أبحاث جامعة الجمعية الملكية. شعبة أكسفورد لعلم الأحياء الهيكلي هو جزء من مركز ويلكوم ترست لعلم الوراثة البشرية، ويلكوم ترست كور جائزة جرانت عدد 090532/Z/09/Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf-900 II serum free media (SFM) 1x liquid | Life Technologies | 10902-096 | store at 4 °C and warm to RT before use |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used |
| Streptomycin sulphate (solid) | Melford | S0148 | Sterilize filter (0.22 μm filter) before use |
| Penicillin G, potassium salt (solid) | Melford | P0580 | Sterilize filter (0.22 μm filter) before use |
| CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10100-147 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8849 | Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO |
| Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I | Sigma | D5025 | |
| HisTrap FF (5 ml) | GE Heathcare | 17-5286-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
| HiTrap Heparin (5 ml) | GE Heathcare | 17-0407-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) | Millipore | UFC905024 | 15 ml capacity and a MWCO of 50 kDa protein concentrator |
References
- Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. The tail of integrins, talin, and kindlins. Science. 895, 899- (2009).
- Yu, Y., et al. Kindlin 2 forms a transcriptional complex with β-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling. EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).
- Yu, Y., et al. Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family. Int J Cancer. , (2013).
- Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins. Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).
- Siegel, D. H., et al. Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome. Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).
- Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration. J. Biol. Chem. , (2013).
- Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
- Qu, H., et al. Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins. J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).
- Yates, L. A., et al. Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain. J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).
- Bouaouina, M., et al. A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated αIIbβ3 integrin coactivation. J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).
- Goult, B. T., et al. The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation. J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).
- Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal β-Subunit NPXY motif. J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).
- Anthis, N. J., Campbell, I. D. The tail of integrin activation. Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).
- Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects. J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).
- Tadokoro, S., et al. Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation. Science. 302, 103-106 (2003).
- Garcia-Alvarez,, et al. Structural determinants of integrin recognition by talin. Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).
- Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation. Structure. 19, 1664-1671 (2011).
- Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development. Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).
- Bialkowska, K., et al. The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell. J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).
- Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation. Nat. Med. 14, 325-330 (2008).
- Lefort, C. T., et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119, 4275-4282 (2012).
- Moser, M., et al. Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells. Nat. Med. 15, 300-305 (2009).
- Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption. J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).
- Malinin, N. L., et al. A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans. Nat. Med. 15, 313-318 (2009).
- Svensson, L., et al. Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation. Nat. Med. 15, 306-312 (2009).
- Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation. Protein Cell. 3, 434-440 (2013).
- Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
- Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. Improving baculovirus recombination. Nucleic Acids Res. 31, (2003).
- Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J Struct. Biol. 172, 55-65 Forthcoming.
- Wasilko, D. J., et al. The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).
- Yates, L. A., Fleurdépine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).
- Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58. Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).
- Zhao, Y., et al. Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain. J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 Forthcoming.
