اختبار مقاومة العقاقير عن HIV-1 الأفراد المصابين بالفشل العلاج المضاد للفيروسات الرجعية (ART) يمكن أن توجه العلاجات المستقبلية وتحسين نتائج العلاج. سوف تحسين النتائج الصحية الفردية والسكان في انتشار فيروس نقص المناعة البشرية عالية ولكن المناطق ذات الموارد المحدودة تتطلب في نهاية المطاف بأسعار معقولة وفي متناول التنميط الجيني مقاومة المخدرات وطرق التفسير.
HIV-1 المقاومة للأدوية لديه القدرة على تقديم تنازلات جدية فعالية وتأثير العلاج المضاد للفيروسات الرجعية (ART). مع استمرار برامج ART في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى لتوسيع والأفراد على ART ينبغي مراقبتها عن كثب لظهور المقاومة للأدوية. مراقبة مقاومة الدواء ينتقل إلى تتبع انتقال سلالات فيروسية مقاومة بالفعل إلى ART أمر بالغ الأهمية أيضا. للأسف، واختبار مقاومة المخدرات لا تزال لا يمكن الوصول إليها بسهولة في المناطق ذات الموارد المحدودة، وذلك لأن التنميط الجيني مكلفة وتتطلب المختبرات المتطورة والبنية التحتية لإدارة البيانات. يوصف وصول مفتوحة الوراثي طريقة الرصد مقاومة المخدرات لإدارة الأفراد وتقييم مقاومة الأدوية المرسلة. يستخدم الأسلوب البرمجيات الحرة ومفتوحة المصدر لتفسير أنماط المقاومة للأدوية وتوليد تقارير المريض الفردية. بروتوكول التنميط الجيني لديه معدل التضخيم أكبر من 95٪ للعينات البلازما مع مركباتتحميل iral> 1،000 HIV-1 نسخ الحمض النووي الريبي / مل. يقلل من حساسية بشكل كبير للأحمال الفيروسية <نسخ 1،000 HIV-1 RNA / مل. تم التحقق من صحة الطريقة الموصوفة هنا ضد وسيلة لمقاومة HIV-1 اختبار المخدرات التي وافقت عليها إدارة الأغذية والأدوية الأمريكية (FDA)، وطريقة التنميط الجيني Viroseq. وتشمل القيود المفروضة على الطريقة الموصوفة هنا حقيقة أن لا يتم ذلك آليا وأنه فشل أيضا في تضخيم تعميم المؤتلف شكل CRF02_AG من لجنة التحقق من صحة العينات، على الرغم من أنه تضخيم فرعية A و B من لوحة نفسها.
وقد وباء فيروس نقص المناعة البشرية في جنوب أفريقيا تتطور بسرعة 1 مع زيادة مصاحبة في الأسي الأفراد على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية (ART)، وخاصة في جنوب أفريقيا 2، 3. كدليل على تأثير الوبائية من برامج العلاج على نطاق واسع في الحد من حدوث 4 وزيادة متوسط العمر المتوقع في المناطق ذات الموارد المحدودة (ريال) 5 لا تزال تتراكم، وسيتم تكثيف الجهود لزيادة التغطية ART. تطور مبادئ توجيهية نحو استخدام العلاج كأداة الوقاية 6 و 7 في إطار برامج اختبار وعلاج يعني أن العدد المطلق للأفراد على العلاج وزيادة. وأعداد كبيرة من الأفراد يكون على ART لفترات أطول من الوقت حيث بلغ متوسط العمر المتوقع للأفراد على ART تقترب من أن السكان غير مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية 8. تطوير وانتقال المقاومة للأدوية فيروس نقص المناعة البشرية لديها علوةيس اعتبرت تهديدا للإنجازات ART 9-12. وبالتالي، هناك حاجة لمراقبة أكثر صرامة ومراقبة مقاومة الدواء كما تم تهيئتها المزيد من الأفراد على ART.
مقاومة العقاقير الوراثي اختبار (GRT) وقد استخدم بنجاح في البلدان المتقدمة، سواء لمراقبة وكذلك رصد HIV-1 المقاومة للعقاقير في الأفراد الذين يحصلون على ART. في هذه الأماكن، وقد تم دمج GRT في الرعاية المتواصلة لHIV-1 الأفراد المصابة. يوصي معظم المبادئ التوجيهية الدولية GRT للبالغين أو الأطفال المرضى بالفشل ART (الخط الأول والخط الثاني) 13-15، طب الأطفال المرضى المعرضين لمنع انتقال الفيروس من الأم إلى طفلها في وقت لاحق نظم لكن إصابة 16، وضبط مع مستويات عالية من المقاومة للأدوية التي تنتقل بين الأفراد المصابين بشكل حاد 13-15. ومع ذلك، فإن المتطلبات التكلفة، والتكنولوجيا، والبنية التحتية حدت تطبيق خطة العمل الأطريةtation نهج مماثل لمراقبة مقاومة الدواء في ريال.
علاج فيروس نقص المناعة البشرية في جنوب أفريقيا والمبادئ التوجيهية الرصد لا ننصح حاليا استخدام حمولتها في اختيار التوجيهية لART للأفراد فشلها تطوير علاجات الخط الأول 17. يتم تبديل الأفراد تستند في المقام الأول على الفيروسي (HIV-1 الحمض النووي الريبي الحمل الفيروسي) معلمات. ولكن في عام 2012، نشرت جمعية أطباء فيروس نقص المناعة البشرية للجنوب الأفريقي أول المبادئ التوجيهية المضادة للفيروسات القهقرية الأفريقية اختبار مقاومة العقاقير الجنوبية 18. ننصح هذه المبادئ التوجيهية اختبار GRT لجميع الكبار فشلها الخط الأول والخط الثاني ART وللرضع المصابين والأطفال المعرضين للالأم إلى الطفل 18. ومع ذلك، لا ينصح GRT 18 للأفراد المصابين بشكل حاد بسبب عدم وجود الأدلة الحالية لمستويات عالية من المقاومة للأدوية التي تنتقل في أفريقيا الجنوبية 19-29. ومن المتوقع أن بعض هذه التوصيات سوف تكون متكاملة مع مرور الوقت إلى عطر الوطنيةatment ورصد المبادئ التوجيهية من مختلف البلدان في المنطقة. بالفعل، في المبادئ التوجيهية للعلاج في جنوب أفريقيا عام 2013 والآن هناك توصية GRT في وقت فشل الخط الثاني للكبار وفي وقت الأولى أو الخط الثاني فشل نظام يستند PI-30 للأطفال.
فقد تبين أن إدراج GRT في المبادئ التوجيهية للعلاج في جنوب أفريقيا سيكون يحتمل محايدة التكلفة. والنظر في تكلفة أدوية الخط الثاني والتي هي نظام نسبيا أكثر تكلفة من أدوية الخط الأول، وذلك باستخدام GRT لتحديد المرضى الذين يحتاجون حقا إلى أن تنتقل إلى العلاج السطر الثاني لا ينتج أي تكلفة إضافية للبرنامج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تحديد GRT أسباب أخرى للفشل، والحفاظ على خيارات العلاج وتوليد المعلومات حول أنماط المقاومة الناشئة 31. وبالتالي، فمن الضروري خفض تكلفة أساليب مراقبة مقاومة الدواء إلى أبعد من ذلك من أجل تحسين الوصول، وجودة من الرعايةد النتائج.
هنا، نقدم طريقة GRT مصممة لاستخدام عامة (مفتوحة المصدر) لالاشعال النسخ العكسي، وسلسلة تفاعل البلمرة (PCR) والتسلسل (الجدول 1)، وكذلك البرمجيات مفتوحة المصدر في الغالب لتفسير مقاومة المخدرات. لإدارة السريرية، وأثنى على البروتوكول من خلال استعراض التقارير وطريقة تفسير شامل مع أخصائي المختبر التقرير مقاومة الأدوية مع الالتزام بالقرب من المبادئ التوجيهية المعاملة الوطنية. وينقسم البروتوكول إلى أربعة عناصر مختلفة؛ 1) حمض النووي الريبي فيروس نقص المناعة البشرية (RNA) استخراج، 2) عكس النسخ والبلمرة المتسلسل (PCR) والتضخيم من الأهداف الفيروسية، 3) وضع تسلسل و4) أساليب المعلوماتية الحيوية لتحليل المخططات الاستشرابية، والمحاذاة، كرأيشن وتفسير البيانات التسلسل.
وقد وصفت عدة طرق منخفضة التكلفة في المنزل في الجهود الرامية إلى محاولة لجعل فيروس نقص المناعة البشرية مقاومة المخدرات التنميط الجيني أكثر بأسعار معقولة 33، 34، 36. ليس هناك شك في الحاجة إلى إدماج اختبار مقاومة المخدرات في استمرارية الرعاية للأفراد على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية في المناطق ذات الموارد المحدودة. ومع ذلك، فإن معظم الطرق ذكرت التركيز على تطبيق المقاومة للأدوية التنميط الجيني في مراقبة مقاومة الدواء على مستوى السكان. طريقة التنميط الجيني زحل / الحياة تكنولوجيز هو بروتوكول متكامل لمراقبة ورصد مقاومة المخدرات. وقد تم تصميم هذا الأسلوب ليكون في متناول تنفيذ بروتوكول معظمها مفتوحة المصدر وفتح الموارد المعلوماتية الحيوية الوصول لتفسير مقاومة المخدرات وتوليد تقارير للإدارة السريرية.
وقد تبين من خلال المقارنة مع ادارة الاغذية والعقاقير المعتمدة Viroseq طريقة التنميط الجيني لتكوندقيقة في تحديد الطفرات المقاومة للأدوية من لجنة من الأيدز عينات اختبار الكفاءة، في 100٪ من عينات المختبر التي تم وحة تضخيم بنجاح. تم تقييم دقة أيضا على عينات سريرية من الفيروسات C سلالة، وسلالة الأبرز في جنوب أفريقيا. كان الأسلوب كما دقيقة على عينات سلالة C كما كان على سلالة A و B. ومع ذلك، إذا كان الأسلوب سوف تستخدم في أجزاء أخرى من العالم حيث CRF02_AG هو السائد، هناك حاجة لتعديل الاشعال منذ الأسلوب فشل في تضخيم واحدة من العينات التي تم وحة تبين أن لها CRF02_AG. بدلا من ذلك، مجموعة المنحطة الاشعال حساسة لجميع الفئات M الفيروسات 33، 36 يمكن استخدامها في المناطق التي تكون فيها توزيع فرعي هو أكثر غير متجانسة 38.
ويمكن زيادة حساسية النسخ العكسي وPCR عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي من كميات أعلى من البلازما، مثل 500 مل. يمكن الطرد المركزي البلازماuged في 21،000 x ج لمدة 90 دقيقة لتركيز الجسيمات الفيروسية قبل الشروع في البروتوكول كما هو موضح من قبل QIAamp الفيروسية استخراج الحمض النووي الريبي عدة صغيرة.
كما هو مبين، وطريقة جديدة لديه ميزة إضافية أنه ينتج تقارير شاملة لإدارة الفرد المريض. هذه التقارير هي توحيد النمط الجيني، والمناعية وبيانات الرصد فيروسية وكذلك التاريخ الطبي والعلاج من RegaDB. ويرافق هذا من قبل المختبر تفسير مفصل للوضع المقاومة يعقبه استعراض مفصل على قدم المساواة من التاريخ الطبي للمريض وكذلك توصيات العلاج. استخدام الأطباء المتخصصين لاستعراض التقارير وتقديم توصيات لعلاج المرضى يوفر الإرشاد التي تشتد الحاجة إليها للممارسين ممرضة وكذلك الأطباء عديمي الخبرة، الذين يوفرون بشكل متزايد ART في جنوب أفريقيا كجزء من توصيات منظمة الصحة العالمية لتحويل المهمة. هذه السريريةوقد أظهرت تقارير أن تكون الوسائل التعليمية الفعالة بالنسبة للأطباء مع خبرة قليلة أو معدومة في إدارة المقاومة للأدوية. من وجهة نظر المريض، ويقلل من أسلوبنا الحاجة إلى السفر إلى مواقع مركزية للوصول إلى خدمات فيروس نقص المناعة البشرية المتخصصة.
وبالتالي، فإن بروتوكول صفها ككل توفر منصة جيدة من خلالها فيروس نقص المناعة البشرية وإدارة المقاومة للأدوية يمكن أن تكون متكاملة، بتكلفة معقولة، إلى استمرارية الرعاية للأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية فشلها ART. البيانات التي تم إنشاؤها يمكن استخدامها لأغراض الوبائية لتقييم تطور وانتقال المقاومة للأدوية في المجتمع. حجم جزء بول ولدت جيدة بما يكفي لمزيد من التحليل النشوء والتطور المعقدة والتي سوف تنتج فهم أفضل لهذا الوباء على مستوى السكان.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أنوه جميع الزملاء الذين جعلوا هذا العمل ممكنا، وخصوصا مايا Balamane، اليزابيث جونستون الأبيض، شارون Sjoblom، جريج أوردنج Zakhona غوميد، Xolile Kineri، Phindile ماباسو، Lungisa Ndwandwe، جيمس غارفي، جافين كوب، سينزو Maphanga، Terusha شيتي ، Kevi نايدو، أندرو Skingsley، كاثرين ستوت، وLungani Ndwandwe. فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر جميع العاملين في وزارة الصحة والعاملين في مركز أفريقيا الذين يعملون معاملة فيروس نقص المناعة البشرية هالابيسا وبرنامج الرعاية.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |