Summary
Drug resistentie testen voor HIV-1 geïnfecteerde individuen falende antiretrovirale therapie (ART) kan toekomstige therapieën begeleiden en verbeteren behandelingsresultaten. Het optimaliseren van de individuele en de bevolking gezondheidsresultaten in hoge HIV-prevalentie, maar met beperkte middelen zal uiteindelijk vereisen betaalbaar en toegankelijk resistentie genotypering en interpretatie methoden.
Abstract
HIV-1 resistentie heeft de potentie om de effectiviteit en impact van antiretrovirale therapie (ART) ernstig in gevaar brengen. Zoals ART-programma's in sub-Sahara Afrika verder uit te breiden, moeten individuen op ART nauwlettend worden gecontroleerd op het ontstaan van resistentie. Surveillance verzonden resistentie transmissie van virale stammen al resistent ART volgen is ook kritisch. Helaas, resistentie testen is nog steeds niet gemakkelijk toegankelijk met beperkte middelen, want genotypering is duur en vereist geavanceerde laboratorium-en datamanagement-infrastructuur. Een open toegang genotypische resistentie controle methode om individuen te beheren en te beoordelen overgedragen resistentie wordt beschreven. De methode maakt gebruik van gratis open source software voor de interpretatie van resistentie patronen en het genereren van individuele patiënt rapporten. De genotypering protocol heeft een versterkingsfactor van meer dan 95% voor plasma monsters met avIral load> 1000 HIV-1 RNA kopieën / ml. De gevoeligheid aanzienlijk vermindert virale lading <1000 HIV-1 RNA kopieën / ml. De hier beschreven methode werd gevalideerd aan de hand van een methode van HIV-1 drug-resistentie testen goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA), de Viroseq genotyperingsmethode. Beperkingen van de hier beschreven werkwijze is het feit dat het niet geautomatiseerd en dat deze evenmin de circulerende recombinante vorm CRF02_AG een validatie panel monsters versterken, hoewel versterkt subtypes A en B van hetzelfde paneel.
Introduction
De HIV-epidemie in zuidelijk Afrika is snel 1 evolueren met een gelijktijdige exponentiële toename van individuen op antiretrovirale therapie (ART), met name in Zuid-Afrika 2, 3. Als bewijs van de epidemiologische gevolgen van grootschalige behandelprogramma's in het verminderen van de incidentie 4 en stijgende levensverwachting in gebieden met beperkte middelen (RLS) 5 blijft ophopen, zal inspannen om ART dekking te verhogen worden geïntensiveerd. De evolutie van de richtlijnen voor het gebruik van de behandeling als preventief instrument 6, 7 onder het testen en behandelen van programma's betekent dat het absolute aantal mensen op behandeling verder zal toenemen. Grote aantallen individuen zal op ART voor langere tijd als de gemiddelde levensverwachting van mensen op ART nadert dat van de HIV-geïnfecteerde populatie 8. De ontwikkeling en overdracht van HIV resistentie heeft always beschouwd als een bedreiging voor de verworvenheden van ART 9-12. Er is dus een noodzaak van een strengere bewaking en monitoring van resistentie als meer mensen worden geïnitieerd op ART.
Genotypische resistentie testen (BRT) is met succes gebruikt in de ontwikkelde landen, zowel voor het toezicht en de monitoring van HIV-1 drug-resistentie bij personen die ART. In deze instellingen, is GRT is geïntegreerd in het continuüm van de zorg voor HIV-1 geïnfecteerde individuen. De meeste internationale richtlijnen adviseren BRT voor volwassen patiënten of kinderen niet ART (eerste lijn en tweede lijn) 13-15, pediatrische patiënten blootgesteld aan preventie van moeder-op-kind overdracht (pMTCT) regimes maar vervolgens geïnfecteerd 16, en in de instellingen met hoge niveaus van overdraagbare resistentie onder acuut geïnfecteerde individuen 13-15. Echter, de kosten, technologie en infrastructuur eisen de uitvoering beperktlegging van een soortgelijke aanpak om resistentie controle in RLS.
De Zuid-Afrikaanse hiv-behandeling en richtsnoeren voor monitoring op dit moment geen gebruik van BRT in het begeleiden van de keuze van ART voor individuen niet de eerste lijn regimes 17 aanraden. Individuen ingeschakeld voornamelijk gebaseerd op virologische (HIV-1-RNA virale last) parameters. Maar in 2012, de Zuid-Afrikaanse HIV Artsen Society publiceerde de eerste Zuid-Afrikaanse ARV resistentietest richtlijnen 18. Deze richtlijnen bevelen brt testen voor alle volwassenen falende eerste lijn en tweede lijn ART en voor geïnfecteerde zuigelingen en kinderen blootgesteld aan pMTCT 18. Echter, brt niet aanbevolen 18 voor acuut geïnfecteerde individuen, omdat er geen actueel bewijs voor hoge niveaus van overdraagbare resistentie in zuidelijk Afrika 19-29. Verwacht wordt dat sommige van deze aanbevelingen worden geïntegreerd over de tijd in de nationale treatment en monitoring richtlijnen van de verschillende landen in de regio. Reeds in de 2013 Zuid-Afrikaanse behandelrichtlijnen is er nu aanbeveling van GRT op het moment van de tweede lijn mislukking voor volwassenen en op het moment van eerste-of tweede-lijn PI-gebaseerde regime mislukking voor kinderen 30.
Het is aangetoond dat de integratie van BRT in behandelingsrichtlijnen in Zuid-Afrika potentieel kosten-neutraal zou zijn. Gezien de kosten van de tweede lijnregime geneesmiddelen die relatief duurder dan de eerste lijn drugs, met BRT in patiënten die echt moeten worden geschakeld tweede lijn therapie identificeren extra kosten voor het programma niet optreden. Daarnaast kunnen BRT zich ook over andere redenen voor het falen, conserveren behandelingsopties en het genereren van informatie over opkomende resistentie patronen 31. Daarom moeten de kosten van resistentie bewakingsmethoden verder om de toegang, de kwaliteit van de zorg een verbetering verminderend resultaten.
Hier presenteren we een BRT methode ontworpen om generieke (open source) primers gebruikt voor reverse transcriptie polymerase-kettingreactie (PCR) en sequentie (tabel 1), en meestal openbron resistentie interpretatie. Voor klinische behandeling, is het protocol aangevuld door een uitgebreide evaluatie en rapportage methode met gespecialiseerde interpretatie van het laboratorium resistentie rapport met dicht naleving van de nationale behandelrichtlijnen. Het protocol bestaat uit vier componenten: 1) HIV ribonucleïnezuur (RNA) extractie, 2) reverse transcriptie en polymerasekettingreactie (PCR) amplificatie van virale targets, 3) Sequencing 4) Bioinformatics voor de analyse van chromatogrammen, uitlijning, curation en interpretatie van sequence data.
Protocol
1. Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) volbloed Processing
Opmerking: bloed kan onmiddellijk na verzameling kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur worden verwerkt.
- Werken in een bioveiligheid kast, zodat de EDTA volbloedmonster op kamertemperatuur komen.
- Voor elk monster te labelen genoeg cryovials met het monster identificatie (ID), opslag materiaal (plasma) en de datum.
- Centrifugeer de monsters gedurende 10 min bij 1000 x g. Niet remmen gebruiken om de centrifuge te stoppen. - Een zeer dunne laag - en erytrocyten, trombocyten zoals plasma, leukocyten (buffy coat): Dit zal drie lagen (van boven naar beneden) te geven.
- Zuig voorzichtig het supernatant (plasma) en hoeveelheid van 500 ml in elk cryovial. Let op dat de cellaag (buffycoat) niet te verstoren of overdragen cellen.
- Bewaren bij -80 ° C totdat het nodig is voor RNA extractie of overgaan tot RNA-extractie onmiddellijk.
- Bereid een extractie werkblad met de ID's van de monsters te extraheren met inbegrip van positieve en negatieve plasma controles.
- Voor elk monster moet worden geëxtraheerd, label een 1,5 ml steriele microcentrifugebuis met het monster ID, extractie datum en "RNA". Ook label een samengestelde kolom en verzamelbuis en een 2 ml microcentrifugebuis met werken lysis oplossing overeenkomstige nummers van de extractie werkblad.
- Werken in de Bio-Safety Cabinet, voeg 200 ul monster naar de overeenkomstige 2 ml microcentrifugebuis van werken lysisoplossing.
- Vortex putje en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Na 10 min, centrifuge de buis kort.
- Voeg 800 ml absolute ethanol aan elk van de buizen.
- Meng door puls vortexen en kort centrifuge.
- Transfer 600 ul van deze oplossing om de corresponderende kolom / collectie binnenband. Centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 minuut.
- Column over te dragen aan een nieuwe collectie buis en de oude collectie buis met het filtraat weggooien. Herhaal de bovenstaande stap 2.8 (boven) tweemaal.
- Voeg 500 ul wasbuffer AW1 aan elke kolom en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 minuut.
- Gooi het filtraat en de collectie buis en breng de kolom naar een nieuwe collectie buis.
- 500 Voeg ui was buffer AW2 en centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 3 minuten. Herhaal stap 2.11.
- Centrifugeer in een nieuwe verzamelbuis bij 20.000 xg gedurende nog 2 minuten.
- Gooi filtraat over kolom in 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 60 ul buffer AVE (RNase vrij water) naar het midden van de kolom ervoor te zorgen dat u niet de vloeistof afgeven aan de zijkant van de kolom.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
- Centrifugeer bij 6000 xg gedurende 2 minuten.
- Gooi de kolom en de dop op de 1,5 ml microcentrifugebuizen.
- De monsters zijn nu klaar voor reverse transcriptie.
- Als testen om direct uitgevoerd, bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 6 uur. Indien testen worden vertraagd dan plaats bij -80 ° C onmiddellijk. NB: niet invriezen / ontdooien van de monsters meer dan 3x.
3. Bereiding van het reagens voor reverse transcriptie
- Voordat Bereken het volume van elk van de voor het aantal monsters verwerkt zoals de positieve en negatieve plasmacontroles reagentia. Voeg ook een reagens controle.
- De berekende hoeveelheden uit stap 3.1 (boven), bereid de deoxyribonucleotide trifosfaat (dNTP)-primer mengsel in een schone, steriele 200 pi PCR-buis, gevolgd door kort vortexen puls. Elk monster moet 0,5 ul van de reverse primer RT21 en 0,5 ul van de dNTP hebben, zie tabel 2.
- Aliquot 1,0 III van de dNTP-primer mix 200 pi PCR-buisjes.
- Bereid reverse transcriptase (RT) enzym mix door het toevoegen van 1 μ, L van de 10x reverse transcriptie buffer, 1 ui 0,1 M DTT en 2 ui 25 mM MgCl2 in een steriele buis gevolgd door vortexen en kort centrifugeren, zie Tabel 3.
- Voeg 0,5 pi elk van de enzymen RNAseOUT en Superscript III reverse transcriptase aan het enzym mix buis tik op de buis voorzichtig te mengen.
- Houd de buizen met de dNTP-primer mengsels en enzymmengsel op een koude blok en naar het RNA station.
4. Reverse transcriptie
- Voeg 6 pl van de RNA-monster naar de dNTP-primer mix buis gevolgd door kort vortexen te mengen.
- Na de toevoeging van het RNA naar de PCR kamer zowel dNTP / primer / RNA mengsel en RT enzymmengsel buizen op een koude blok of ijs.
- Kort centrifugeren de dNTP / primer / RNA mix buizen (uit stap 4.2) en plaats ze in een thermocycler.
- Verhit bij 65 ° C gedurende 5 minuten om het RNA te denatureren.
- Snel afkoelen tot 4 ° C, gedurende 2min.
- Pauzeer de thermocycler terwijl nog bij 4 ° C; neem de buizen.
- Voeg snel 5 ul van het enzymmengsel terwijl de buizen op een koude blok.
- Meng voorzichtig door de buis te tikken vervolgens kort centrifuge de buizen en terug te keren naar de thermocycler.
- Houd de buizen bij 50 ° C gedurende 60 minuten om de omgekeerde transcriptie van RNA-enzym gevolgd door denaturatie bij 85 ° C gedurende 5 minuten om de omgekeerde transcriptie te stoppen.
- Koel af tot 37 ° C. Zodra de temperatuur weer tot 37 ° C, pauzeren en neem de tube uit de thermocycler.
- Voeg snel 0,5 pl RNAse H van de buizen en terug naar de thermocycler.
- Houden op 37 ° C gedurende 20 minuten en daarna afkoelen tot 4 ° C.
- De complementaire DNA (cDNA) kan direct worden gebruikt of kunnen bij -20 ° C of kouder bewaard totdat het nodig is. Toch moet de opslag van cDNA lange termijn bij -80 ° C.
5. Bereiding van het reagens voor PCR
- Befoherstart, berekent de hoeveelheden van elk van de voor het aantal monsters worden verwerkt en de controles reagentia. Naast de drie controles (positieve, negatieve en Reagent), kunt u een PCR-controle (HIV DNA) toe. De eerste en tweede ronde PCR mengsels kunnen gelijktijdig worden bereid en de tweede master mix bewaard bij -20 ° C totdat het nodig is. Mengsels kunnen worden bewaard gedurende ongeveer 8 uur.
- Voeg 18,4 ul water, 2,5 pi 10 x buffer, 1,0 pl MgCl2, 0,5 pl dNTPs, en 0,25 pi van elk van de primers zoals weergegeven in tabel 4 en vortex.
- Voeg 0,1 ul van Platinum Taq polymerase (5U/μl) en meng de buis door erop te tikken.
- Aliquot 23 ul van de master mix aan 200 ul PCR-buisjes.
- Met de master mix buisjes op een koude blok of ijs te verplaatsen naar de PCR kamer.
6. Nested PCR
- Voeg 2 pi van de cDNA 23 pl van de 1e ronde PCR Master mengen.
- Sluit de buizen, zet de monsters in de thermocycler en de volgende PCR-cycling condities: 94 ° C gedurende 2 min, 30 cycli van 95 ° C gedurende 30 seconden, 58 ° C gedurende 20 seconden en 72 ° C gedurende 2 min, gevolgd door een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten zoals getoond in figuur 1.
Figuur 1. Nested PCR fietsen voorwaarden. Klik hier voor grotere afbeelding.
- Ga door naar de 2e ronde PCR podium of bewaar de 1e ronde PCR-producten bij -20 ° C of kouder, totdat in een later stadium.
- Voor 2e ronde PCR, voeg 2 pl van de 1e ronde PCR-product tot en met 23 ul van de 2e ronde PCR Master Mix eend gebruik van dezelfde PCR-programma op Figuur 1.
7. Gelelektroforese
- Gelbereiding
- Voeg een 0,5 g agarose tablet in een 250 ml glazen kolf en voeg 50 ml 1x TBE buffer aan de kolf.
- Warmte in de magnetron aan het koken; wervelen regelmatig (ongeveer elke 30 seconden) tot het volledig oplosbaar. Gebruik een silicone grip of siliconen handschoen oven op de hete fles grijpen. De agarose oplossing kan uitkoken van de kolf heel gemakkelijk dus nauwlettend toezien op dit proces.
- Afkoelen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10 minuten.
- Giet agarose in een gel gieten lade met de juiste grootte kam; gel is klaar voor gebruik in ongeveer 20-30 minuten.
- Plaats gel in elektroforese kamer en lopen zoals aanbevolen door de fabrikant.
- Gelelektroforese en visualisatie.
- Vortex Nieuwe Sap voor 10 seconden vóór gebruik.
- Verdun 1 pl Novel Juice met 5 pi van DNA monster en mix.
- Verdunnen 3 pi van Novel Juice met 3 pi molecuulgewichtsmerker en meng.
- Laad het mixen van secties 7.2.2 en 7.2.3 (boven) en laat de gel bij 100 V en 400 mA gedurende 40 minuten aan de PCR amplificatie evalueren.
- Positieve versterking kan onder UV-licht zichtbaar worden gemaakt als 1315 bp fragment, Figuur 2.
Figuur 2. Gel bevestiging van PCR-amplificatie met behulp van 1% agarose gel elektroforese en een 200 bp ladder. Klik hier voor grotere afbeelding.- Er mag geen versterking in de negatieve en reactieve controles zijn dus afwezigheid van besmetting aangeeft.
8. PCR-product Cleanup
- Ter voorbereiding van de sequentie reactie worden de positieve tweede ronde PCR producten schoongemaakt met de PureLink PCR zuivering kit.
- Voeg 80 ul van werken bindingsbuffer High-Cutoff (B3) tot 20 pl PCR product en pipetteer mix.
- Voeg gemengd met de bindingsbuffer een spinkolom in een verzamelbuis monster.
- Centrifugeer de kolom bij 10.000 xg gedurende 1 minuut. Breng de kolom in een nieuwe collectie buis.
- Was de kolom met 650 ui wasbuffer met ethanol.
- Centrifugeer de kolom bij 10.000 xg gedurende 1 minuut. Breng de kolom in een nieuwe collectie buis.
- Centrifugeer de kolom op maximale snelheid gedurende 2-3 minuten om resten van het wassen buffer verwijderen.
- Plaats de spin kolom in een schone 1,7 ml elutie met de kit buis.
- Voeg 40 ul elutiebuffer naar het midden van de kolom en de kolom incubeer bij kamertemperatuur Temperatuure 1 minuut.
- Centrifugeer de kolom op maximale snelheid gedurende 2 minuten (> 10.000 xg).
- De elutiebuis bevat uw gezuiverde PCR product klaar voor sequencing. Gooi de kolom.
- Bepaal de concentratie en kwaliteit van het DNA met een Nanodrop.
- Als er geen in-house sequencing faciliteiten beschikbaar zijn, kan het gezuiverde PCR-producten een commerciële sequencing lab gestuurd in dit stadium.
9. Sequensreacties
- De PCR-producten worden gesequenced met de grote dye terminator kit versie 3.1 en 4 primers voor elk monster (twee vooruit en twee achteruit). De primersequenties worden getoond in Tabel 2. Daarom, na de sequencing termijn zal elk monster vier sequenties te worden samengevoegd tot een aaneengesloten.
- Stel de sequentie reacties zoals aangegeven in tabel 5 voor elk van de vier primers.
- Meng de sequencing buffer en de primers door vortexen voor gebruik.
- Meng dewater, buffer en primer vóór de toevoeging van de kleurstof grote sequencing. Meng door vortexen.
- Meng de master mix na het toevoegen van de grote kleurstof sequencing mix door het buisje of het zachtjes tikken.
- Aliquot 9 ul van de master mix in een 96-well optische plaat.
- Om 24 samples / plaat, het opzetten van de plaat zoals hieronder aangegeven Figuur 3 draaien.
Figuur 3. Regeling voorstelling van een 96-wells plaat met 12 patiënten monsters worden gesequenced met 4 primers elk (RTC1F, RTC2R, RTC3F en RTC4R). Klik hier voor grotere afbeelding.- Voeg 1,0 ul van het DNA-monster (~ 20-40 ng), bedek de plaat met eenn zelfklevend aluminium deksel en vervolgens voorzichtig mengen.
- Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 1 minuut. Verwijder het aluminium deksel en voeg een rubberen mat.
- Plaats de plaat op de thermocycler en voer de volgende fietsen programma weergegeven in figuur 4.
Figuur 4. PCR fietsen voorwaarden voor sequencing. Klik hier voor grotere afbeelding.- Als de PCR klaar is, het schoonmaken van de sequencing product onmiddellijk.
10. Sequencing Cleanup
- Voor elke sequencing reactie meng 50 pl absolute ethanol en 5 pl 3 M natriumacetaat.
- Met behulp van een multichannel pipet 55 &# 956, l natriumacetaat / EtOH-oplossing aan elk putje.
- Seal putten met zelfklevende aluminium deksel, zodat elk putje wordt goed afgesloten.
- Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 20 minuten.
- Na 20 minuten, verwijder het deksel en draai de plaat, in een vloeiende beweging, op een gevouwen lab weefsel (NIET bang om zich te ontdoen van de bovenstaande vloeistof, omdat dit de pellet zal verjagen!).
- Centrifugeer de omgekeerde plaat op hetzelfde weefsel bij 150 xg gedurende 2 minuten.
- Onmiddellijk toevoegen 150 ul koude 70% EtOH. DO toevoeging van ethanol niet langer bij deze stap.
- Afdichting met dezelfde lijm aluminium deksel en vortex.
- Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 5 minuten.
- Omkeren plaat op een nieuw gevouwen weefsel en centrifuge omgekeerde bij 150 xg gedurende 1 minuut.
- Na het centrifugeren, plaatst ontdekt in thermocycler en drogen bij 50 ° C gedurende 2 minuten.
- Zodra de platen droog is, sluit deze af met zelfklevende folie covers, wikkel in folie en bewaar bij -20 ˚ C tot klaar om te gaan wiTh De sequencing elektroforese.
- Als u klaar bent om de sequentie, te ontbinden schoongemaakt sequencing producten in 10 ml Hi-Di formamide, denatureren en de belasting voor elektroforese.
11. Bioinformatica
- Sequence Assembly
- Start het programma Geneious.
- Maak een werkmap aan de sequenties op te slaan.
- Importeer de ABI bestanden die door de sequencing machine om de werkmap functie import. Geneious zal percentage kwaliteit score toe te wijzen voor elke ingevoerde volgorde.
- Open sequenties met kwaliteit scores> 70% door erop te dubbelklikken.
- Elk bestand moet openen in een nieuw venster. De software zal de kwaliteit aan te geven bij elke nucleotide positie van het chromatogram van de sequentie kwaliteit met behulp van licht blauwe balken. Hoe hoger de balk, hoe beter de kwaliteit van de basis gesprek.
- Met behulp van de cursor, selecteer het midden gedeelte van de sequentie weglaten van de uiteinden, die meestal van slechte kwaliteit. Klik op de knop extract naar de regio te halen met een goede kwaliteit volgorde.
- Selecteer alle vier gewonnen sequenties voor elk monster en monteer ze tegen een referentie-sequentie.
- Inspecteer de gemonteerde sequentie om ervoor te zorgen dat je in de juiste reading frame. Als je in de juiste reading frame, moet het begin van protease beginnen met de volgende aminozuren: PQITLW. Het begin van RT zal beginnen met PISPIE.
- Pak de contig regio die het begin van PR naar de 300e RT codon. Tijdens dit proces ook controleren inserties of deleties.
- Ga door de consensus sequentie van het gewonnen contig, het identificeren van dubbelzinnigheden en controleer posities met gemengde bases door de inspectie van de kwaliteit (symmetrie, hoogte, achtergrond en schouders van flankerende gebieden) van de basis gesprekken.
- Selecteer de consensus sequentie en klik op de knop extract naar een apart bestand van de consensus sequentie te maken uit de vier primers en de Label op gepaste wijze.
- De sequentie exporteren naar een back-up opslag map op de computer of een netwerkmap.
- Sequence Quality Assessment (HIVDB)
- Analyseer de sequentie met de HIVDB programma op http://hivdb.stanford.edu .
- Controleer op deleties en inserties in de samenvatting gegevens en zorgen ervoor dat de sequentie omvat alle 99 protease (PR) codons en de 1e 300 RT codons.
- Controleren op eventuele gemarkeerd kwaliteitsborging (QA) kwesties in zowel de PR en RT regio's, zoals stopcodons, kader verschuivingen, dubbelzinnige posities en ongewone residuen.
- Sequencing Quality Control
- Schiet de nieuwe volgorde tegen een lokale sequentiedatabank van vorige run.
- Als de nieuwe sequentie> 97% vergelijkbaar met een sequentie in de database moeten alle fasen van het protocol worden beoordeeld, beginnend bij de sequentie-analyse en terug naar de RNA-extractie op een verder gaandee dat er geen mix-ups (sample switching, mislabeling) of contaminatie.
- Als er geen problemen worden geïdentificeerd, moet de analyse van zowel de oude en nieuwe monsters van de RNA-extractie.
- Als de sequenties zijn nog steeds> 97% vergelijkbaar, beoordelen de anamnese om te beoordelen voor een epidemiologisch verband tussen de individuen.
- Fylogenetische analyse
- Lijn alle sequenties uit de database met behulp ClustalW programma in Geneious.
- Handmatig controleren van de uitlijning voor uitgelijnd sequenties, deleties en inserties en dienovereenkomstig te wijzigen.
- De bouw van een fylogenetische boom met behulp PHYML, Geneious boom bouwer of andere boom bouwers in Geneious.
- Onderzoek de boom voor monsters met korte tak lengtes.
- Bekijk de monsters met korte tak lengtes op mogelijke verontreiniging.
12. REGA DB Informatica
- Sequence uploaden
- Log in op de RegadB met een unieke gebruikersnaam en wachtwoord.
- Op het menu drop-down, onder Patient ID, selecteer "Begint met".
- Voeg de patiënt-ID en selecteer de persoon wiens genotype te worden geüpload.
- Op het menu aan de linkerkant, kies "virale isolaat".
- Van de opties onder virale isolaat selecteer "add".
- Voer de Sample datum, Sample ID, Sequence ID en Sequence datum.
- Selecteer "kies bestand" en navigeer naar de fasta bestand van de reeks te worden geüpload.
- Na de fasta bestand te uploaden selecteren, klik op upload.
- Zodra de geüploade volgorde weergegeven in het vak onder de nucleotide sequentie identificeert en data, klik op de OK-knop aan de onderkant rechts van het venster.
- Controleer voor PR en RT eiwit uitlijning door te klikken op de knop eiwit en ofwel PR of RT selecteren.
- Controleer voor de resistentie mutatie door te klikken op de weerstand knop. Hierdooru de weerstand profielen van drie algoritmes: ANRS, Stanford HIVDB en RegaDB.
- Het genereren van rapporten met behulp van REGA
- Log in op de RegaDB behulp van uw unieke gebruikersnaam en wachtwoord.
- Op het menu drop-down, onder Patient ID, selecteer "Begint met".
- Voeg de patiënt-ID en selecteer het individu waarvan het verslag kan worden gegenereerd.
- Op het menu aan de rechterkant, selecteert virale isolaat.
- Van de opties onder virale isolaat klik op "view".
- Dubbelklik op het virale isolaat waarvoor u een rapport wilt maken.
- Op de virale isolaat venster klikt u op het tabblad virale isolaat rapport.
- Selecteer de algoritmes voor de interpretatie van het genotype van het drop down menu en selecteer vervolgens verslag sjabloon te gebruiken.
- Zodra het algoritme en de sjabloon zijn geselecteerd, klikt u op de knop "genereren".
- Download de rtf-document gegenereerd.
- Open de rtf doencument als een Word-document.
- Het formaat van de behandeling geschiedenis grafiek.
- Na de grafiek, voegt u de sectie "Klinische grafiek en weerstand interpretatie".
- De gegevens van de weerstand tafel en klinische grafiek, een omschrijving van resistentieprofiel van de patiënt te beginnen met de behandeling van de patiënt, en de geneesmiddelen waarvoor het virale isolaat bestand. Voeg ook een beschrijving van de virale belasting van de patiënt en de hoeveelheid CD4-profielen uit de grafiek.
- Stuur het rapport naar de Infectieziekten (ID) specialist voor onderzoek en aanbevelingen voor de toekomstige behandeling van de patiënt. Deze werkwijze is ook een zeer belangrijke kwaliteitsborging fase. Eventuele fouten in het genotype of inconsistences in de behandeling geschiedenis, kan virologische en immunologische profielen worden geïdentificeerd en beoordeeld voordat er een eindverslag wordt gestuurd, met alle aanbevelingen, om de arts het beheer van de patiënt.
Representative Results
De gevalideerde was een modificatie van een eerder beschreven werkwijze 20. De Viroseq genotyperingsmethode, dat door de FDA heeft goedgekeurd, werd gebruikt als referentiemethode in de validatie. Een panel van bekwaamheidstesten monsters verkregen van de Franse nationale agentschappen voor onderzoek naar AIDS en Virale Hepatitis (ANRS) werd gebruikt in de primaire vergelijking tussen de twee methoden. De twee genotyperingswerkwijzen waren 100% concordant in het identificeren van alle klinisch belangrijke drug-resistentie mutaties zoals uitgelegd door het HIVDB programma voor de monsters die met succes werden versterkt door beide methoden. Zoals getoond in Tabel 6, de nucleotide sequenties van de drie paren waren 99.5% identiek. De voorspelde aminozuursequenties zijn 100% identiek. Een monster van de vijf niet met succes konden worden versterkt door Viroseq. Naast het monster niet geamplificeerd door Viroseq de eigen methode niet een tweede monster dat werd getoond amplificereneen circulerende recombinante virus (CRF02_AG) zijn door Viroseq. De drie monsters die versterkt met beide methoden waren subtype B (twee monsters) en subtype A (een monster).
Figuur 5. Gebruik van een HKY Neighbor Deelnemen boom gedaan als onderdeel van opeenvolging kwaliteitsborging. Er zijn vier paren / clusters van sequentie met zeer korte genetische afstanden. De genetische afstand tussen RES655 en RES655_1 (dezelfde monsters gesequenced op verschillende dagen) is 0.003. Het is een mogelijke fout met de RES637_1/RES638 paar als hun genetische afstand is te kort (0.075) voor monsters uit verschillende epidemiologisch gekoppelde individuen. Er is nog RES637 op de boom met een afstand van 0,075 in vergelijking met RES638_1. De CQ01/CQ02 cluster suggereert dat de twee monstersvan het panel zijn duplicaten van hetzelfde monster. Ze cluster samen met het subtype B referentie sequentie bevestigt het subtype toegewezen door de REGA Subtypering tool. CQ05 en CQ04 geclusterd met subtypes A en G respectievelijk, terwijl de REGA subtyping hulpmiddel geclassificeerd ze als A en CRF02_AG respectievelijk. Een ander handig hulpmiddel voor HIV subtypering en recombinatie is SCUEL, dat beschikbaar is op http://www.datamonkey.org is. Klik hier voor grotere afbeelding.
Een panel van vijf monsters werd gebruikt om de nauwkeurigheid van het eigen methode beoordelen. Tien repliceren genotypen werden gegenereerd voor elk van de vijf monsters. Met behulp van de 16 capillaire 3130xl genetische analyzer, 48 van de 50 genotypen werden gegenereerd uit 24 runs, bereid op dezelfde dag. Voor alle vijf monsters, de voorspelde aminozuursequenties waren 100% concordant tussen replicaten. Voor de nucleïnezuursequenties, there was> 99% paarsgewijs gelijkenis.
Gedurende de eerste twee jaren van de toepassing van deze methode werden zestig monsters willekeurig herhaald RNA extractie de sequentie. Er waren geen statistisch significante verschillen tussen de sequentie kwaliteit score en het aantal gemengde basen tussen de herhalingen. Zowel de nucleotide-en aminozuursequenties paarsgewijze vergelijkingen voor de zestig paren waren meer dan 99% identiek. Dus de drug resistentie mutaties voor alle paren waren 100% concordant.
Kostenreductie
De reactie volumes RT PCR en sequencing werden met minstens de helft ten opzichte van de oorspronkelijke methode 20, 32, zonder aan de kwaliteit van de gegenereerde sequenties. Dit stelde een kostenreductie van 50% van de RT-en PCR-stappen.
De nieuwe methode werd oorspronkelijk ontworpen voor zes sequencing primer sequentie Alle 99 codons van het protease-gen en de eerste 300 codons van het reverse transcriptase gen 20, 32. Vergelijkbare methoden gebruiken ook zes tot acht primers 33, 34. Enkele recent gepubliceerde methoden hebben gebruikt minder dan zes primers, hoewel soms sequencing de protease en RT genen seprately 35, 36. We wilden het aantal sequencing primers verminderen 6-4 (figuur 6)
Figuur 6. Vergelijking aaneengesloten sequenties van zes vs vier sequencing primers voor het genereren van het 1197 bp pol-sequentie die alle 99 HIV-1 protease codons en de eerste 300 codons van het reverse transcriptase gen.242/51242fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Sequenties uit een set van 17 monsters geproduceerd zes primers werden vergeleken met sequenties gegenereerd na uitsluiting van twee primers (MAW46 en RTY). De subtypen waren 14 subtype C, twee subtype B, en een subtype A. Er waren geen significante verschillen in volgorde kwaliteitsscores. Ook de gemiddelde paarsgewijze gelijkheid tussen de 17 paren van nucleïnezuur was 99% en 100% op het aminozuurniveau. Zo verminderen de sequencing primers 6-4 resulteerde in een verlaging van de kosten sequencing met bijna een derde.
De enige proprietary software tool gebruikt in dit protocol was Geneious voor volgorde assemblage. De drug resistentie interpretatie hulpmiddelen, evenals het rapport genereren tools zijn allemaal gratis, open toegang gereedschappen. Dit vermindert de kosten verder door het elimineren van de kosten voor het gebruik van eigen software. Verder collective onderhandelingen kon de reagentia voor dit protocol te worden verpakt in een kit voor gemakkelijke toegang van Life Technologies en is beschikbaar als de Saturn / Life Technologies genotyperingsmethode 37. Bovendien kan Saturnus leden toegang tot de reagentia tegen een gereduceerde prijs.
Klinische setting
De beschreven protocol is geïmplementeerd in de monitoring en bewaking van resistentie in een landelijke gemeenschap in KwaZulu-Natal. Een totaal van 604 genotypen werden gegenereerd uit klinische monsters tussen december 2010 en mei 2013 in een versterking van 95% voor monsters met een viral load> 1000 RNA kopieën / ml. Deze klinische HIV resistentie onderzoek werd goedgekeurd door het Biomedical Research Ethics Committee van de Universiteit van KwaZulu-Natal (ref. BF052/10) en het Comite voor Onderzoek van de Gezondheid van de KwaZulu-Natal Department of Health (ref. HRKM 176/10). Individuele patiënt rapporten zijn gegenereerd en teruggestuurd naar de kliniekenvoor een goede behandeling.
Tweeënzeventig (72) genotypen werden ook gegenereerd als onderdeel van een surveillance van overdraagbare resistentie studie, genesteld in een grote prospectieve basis van de bevolking HIV-surveillance studie. De primaire monsters waren naaldprik bloed in EDTA microtubes verzameld. Bij genotypering was er een versterking van 79% 19. Ethiek goedkeuring voor de genotypering van monsters uit de surveillance studie werd verkregen van de Universiteit van KwaZulu-Natal Biomedical Research Ethics Committee (ref. BE066107).
| Primer Naam | Sequentie | Lengte | Richting | HXB2 Positie | |
| MAW-26 | TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC | 23 | Vooruit | 2028-2050 | 1e ronde PCR |
| RT-21 | CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG | 31 | Reverse | 3539-3509 | 1e ronde PCR |
| Pro-1 | TAGAGCCAACAGCCC CACCA | 20 | Vooruit | 2147-2166 | 2e ronde PCR |
| RT-20 | CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC | 22 | Reverse | 3462-3441 | 2e ronde PCR |
| RTC1F | ACCTACACCTGTCAA CATAATTG | 23 | Vooruit | 2486-2508 | Sequencing |
| RTC2R | TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG | 27 | Reverse | 2630-2604 | Sequencing |
| RTC3F | CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC | 30 | Vooruit | 2956-2994 | Sequencing |
| RTC4R | CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC | 29 | Reverse | 3129-3101 | Sequencing |
| RT-y | GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG | 22 | Reverse | 2967-2946 | Sequencing |
| MAW-46 | TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC | 27 | Vooruit | 2251-2277 | Sequencing |
Tabel 1. Reverse transcriptie PCR en sequencing aangepaste primers gebruikt bij het genereren van een 1197 bp fragment pol die alle 99 HIV-1 protease codons en de eerste 300 codons van het omgekeerde trascriptase gen.
| RT21 (5pmol/ml) | 0.5 | 0.2 |
| dNTP (10 mM) | 0.5 | 0.4 |
| Totaal | 1 |
Tabel 2. dNTP / Primer mix voor de reverse transcriptie reactie.
| Reagens | Volume (ml) / reactie | Concentratie / reactie |
| First Strand Buffer (10x) | 1 | 1 |
| MgCl2 (25 mM) | 2 | 4 |
| DTT (0,1 M) | 1 | 0.008 |
| RNaseOUT (40 U / ml) | 0.5 | 16 |
| Superscript III reverse transcriptase (200U/ml) | 0.5 | 8 |
| Totaal | 5 |
Tabel 3. Enzym mix voor de reverse transcriptie reactie.
| Reagens | Volume (ml) / reactie | Eindconcentratie / Reaction |
| DEPC behandeld water | 18.4 | - </ Td> |
| PCR Buffer (10x) | 2.5 | 1 |
| MgCl 2 (50 mM) | 1 | 2 |
| dNTP mix (10 mM) | 0.5 | 0.2 |
| Froward primer (5 pmol / ml) | 0.25 | 0.05 |
| Reverse primer (5 pmol / ml) | 0.25 | 0.05 |
| Platinum Taq polymerase (5 U / ml) | 0.1 | 0.02 |
| Subtotaal | 23 | - |
Tabel 4. Master mix voor de geneste PCR.
| Reagens | Volume (ml) / reactie | Concentratie / reactie |
| DEPC behandeld water | 6.1 | |
| Sequencing Buffer (5x) | 2 | 1 |
| Primer (3,2 pmol / ml) | 0.5 | 0.16 |
| Big Dye terminator Sequencing mix | 0.4 | - |
| Totaal | 9 |
Tabel 5. Master mix voor de sequentie reacties.
| Viroseq | Inhouse | % NA Gelijkenis | |||||||
| Sample ID | Subtype | Kwaliteitsscore | PR Mutaties | RT mutaties | Subtype | Kwaliteitsscore | PR mutaties | RT Mutaties | |
| CQ01 | B | 99.9 | M46L, I54L, V82A, L90M | D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q | B | 99.2 | M46L, I54L, V82A, L90M | D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q | 100 |
| CQ02 | B | 99.5 | M46L, I54L, V82A, L90M | D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q | B | 99.5 | M46L, I54L, V82A, L90M | D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q | 100 |
| CQ03 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | |||
| CQ04 | CRF02_AG | 98.4 | I54V, V82F, I84V | M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C | NA | NA | NA | NA | NA |
| CQ05 | Een | 99.7 | K103N | Een | 93 | K103N | 100 | ||
Tabel 6. Vergelijkende Results uit een parallelle analyse tussen de Viroseq genotyperingsmethode en de eigen methode met behulp van een panel van monsters die door de ANRS.
Discussion
Verschillende lage kosten in-house methoden zijn beschreven in inspanningen om te proberen aan HIV resistentie genotypering meer betaalbare 33, 34, 36 te maken. Er is geen twijfel over de noodzaak om resistentie testen te integreren in het continuüm van zorg voor individuen op antiretrovirale therapie in gebieden met beperkte middelen. Echter, de meeste van de gerapporteerde methoden richten op de toepassing van resistentie genotypering in de surveillance van resistentie op populatieniveau. De Saturn / Life Technologies genotyperingsmethode is een volledig geïntegreerde protocol voor het toezicht en de controle van resistentie. Deze methode is ontworpen om een betaalbare protocol implementeren meestal open source en open middelen toegang bioinformatica voor de interpretatie van resistentie en het genereren van rapporten voor klinische behandeling zijn.
Het werd aangetoond door vergelijking met de FDA goedgekeurde Viroseq genotyperingsmethode tenauwkeurig in het identificeren van resistentie mutaties van een panel van ANRS bekwaamheidstesten monsters, in 100% van het laboratorium panel monsters die met succes werden versterkt. De nauwkeurigheid werd ook beoordeeld op klinische monsters van subtype C virussen, de meest dominante subtype in zuidelijk Afrika. De werkwijze was zo nauwkeurig op subtype C monsters als op subtype A en B. Indien de werkwijze worden gebruikt in andere delen van de wereld waar CRF02_AG voorkomt, is het noodzakelijk dat de wijziging van de primers omdat de werkwijze niet een van het paneel monsters die bleek CRF02_AG hebben amplificeren. Als alternatief, een gedegenereerde set primers die gevoelig zijn voor alle groep M virussen 33, 36 kan worden gebruikt in regio's waar het subtype verdeling is heterogener 38.
De gevoeligheid van de reverse transcriptie en PCR kan worden verhoogd door het extraheren van RNA uit hogere volumes plasma, bijvoorbeeld 500 ml. Het plasma kan worden CENTRIFuged bij 21.000 xg gedurende 90 min om de virale deeltjes concentreren voordat u verder gaat met het protocol zoals beschreven door de QIAamp virale RNA-extractie mini kit.
Zoals getoond, de nieuwe methode een extra voordeel dat het produceert uitgebreide rapporten voor individuele Patiëntenzorg. Deze rapporten zijn een consolidatie van het genotype, de immunologische en virologische monitoringgegevens evenals de klinische en behandeling geschiedenis van RegaDB. Dit wordt vergezeld van een gedetailleerde laboratorium interpretatie van de weerstand profiel, gevolgd door een even gedetailleerd overzicht van de klinische voorgeschiedenis van de patiënt, alsmede aanbevelingen behandeling. Het gebruik van een gespecialiseerde artsen om de rapporten te beoordelen en aanbevelingen behandeling voor de patiënten biedt de broodnodige mentorschap voor nurse practitioners als onervaren artsen, die steeds meer het verstrekken van ART in Zuid-Afrika in het kader van de aanbevelingen van de WGO voor de taak verschuiven. Deze klinischerapporten is gebleken dat effectieve leermiddelen voor clinici met weinig of geen ervaring met resistentie management. Vanuit een patiënt perspectief onze werkwijze vermindert de noodzaak om te reizen naar centrale locaties om HIV gespecialiseerde diensten.
Zo is de beschreven protocol als geheel biedt een goed platform waarlangs HIV resistentie management kan worden geïntegreerd, tegen een betaalbare prijs, in het continuüm van zorg voor HIV-geïnfecteerde individuen falende ART. De gegenereerde data kan gebruikt worden voor epidemiologische doeleinden om de evolutie en de transmissie van resistentie in de gemeenschap te beoordelen. De grootte van de pol fragment gemaakt goed genoeg voor complexere fylogenetische analyse die beter begrip van de epidemie zal produceren op populatieniveau.
Disclosures
Dit werk werd ondersteund door de Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Europese Unie (SANTE 2007 147-790), het Amerikaanse centrum voor ziektepreventie en-bestrijding via CAPRISA (project titel: Health Systems Versterking en HIV Treatment Failure (HIV- TFC)), en de Zwitserse Zuid-Afrikaanse Joint Research Programme (SSJRP) onderzoek subsidie getiteld "Swiss Prot / Zuid-Afrika: Eiwit Bioinformatics Resource Development voor Belangrijke Gezondheidspublicaties Ziekteverwekkers". RL wordt ondersteund door de Wellcome Trust (licentienummer 090999 / Z / 09 / Z). De financiers hadden geen rol in onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript. De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag alle collega's die dit werk mogelijk gemaakt, vooral Maya Balamane, Elizabeth Johnston Wit, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty erkennen , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, en Lungani Ndwandwe. De auteurs willen ook graag al het personeel van het ministerie van Volksgezondheid en het Africa Centre personeel dat de Hlabisa HIV behandeling en zorg programma werken bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
| SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
| Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
| PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
| Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
| Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
| TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
| O'Range Ruler 200 bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
| Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
| MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
| Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
| Big Dye Terminator Kit version 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
| Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
| PoP | Life Technologies | 4363785 | Sequencing |
| 10x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
| Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
| 5x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
| Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
| Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
| Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
| Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
| Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
| Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
| Vortex Genius 3 | IKA | RNA extraction and reagent preparation | |
| Vortex mixer | IKA | Sequencing Cleanup | |
| NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
| 3 M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
| Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Cleanup |
| 1.5 ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
| 2 ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
| 2 ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
| Optical MicroAmp 96-well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
| 200 µl 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab - supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
| 200 µl PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
| Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
| Internet Access | Preferrably high speed | ||
| Web resources | |||
| hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
| http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
| http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool | |
References
- Shao, Y., Williamson, C. The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries. Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).
- Mutevedzi, P. C., et al. Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes. Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).
- Houlihan, C. F., et al. Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme. Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).
- Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal. South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).
- Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment. Science. 339, 961-965 (2013).
- Montaner, J. S., et al. The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic. Lancet. 368, 531-536 (2006).
- Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model. Lancet. 373, 48-57 (2009).
- Johnson, L. F., et al. Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies. PLoS Med. 10, (2013).
- Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance. Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).
- Geretti, A. M. Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).
- Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy. Science. 243, 1731-1734 (1989).
- Erice, A., et al. Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1. N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).
- Williams, I., et al. British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy. HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).
- DHHS, US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , (2012).
- Vandamme, A. M., et al. European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update. AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).
- DHHS, US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. , (2012).
- Department of Health. Clinical guidelines for the management of HIV & AIDS in adults and adolescents. , Department of Health. (2010).
- Conradie, F., et al. The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines. S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).
- Manasa, J., et al. Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).
- Tshabalala, M., et al. Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe. PLoS ONE. 6, (2011).
- Bartolo, I., et al. Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).
- Bartolo, I., et al. HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).
- Hamers, R. L., et al. HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study. Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).
- Hamers, R. L., et al. HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2010).
- Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa. J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).
- Iweriebor, B. C., et al. Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa. Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).
- Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa. J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).
- Nwobegahay, J. M., et al. Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa. J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).
- Nwobegahay, J., et al. Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province). S. Afr. Med. J. 101 (2011), 335-337 (2011).
- Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data. J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).
- Dalai, S. C., et al. Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe. AIDS. 23, 2523-2532 (2009).
- Chen, J. H., et al. In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong. Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).
- Lee, C. K., et al. An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1. J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).
- Aitken, S. C., et al. A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only. J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).
- Zhou, Z., et al. Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings. PLoS One. 6, (2011).
- , Life Technologies. Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. , Available from: https://ir.lifetechnologies.com/releasedetail.cfm?releaseid=694585 (2012).
- Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review. AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).
